丹紅對(duì)百草枯中毒大鼠肺TGF-β1的影響

韋紅梅,胡利明,郝志強(qiáng)，吳明霞

(1.河北省安國(guó)市醫(yī)院呼吸科，河北 安國(guó) 071200；

2.河北省滄州市渤海新區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)科，河北 滄州 061113)

·論著·

丹紅對(duì)百草枯中毒大鼠肺TGF-β1的影響

韋紅梅1,胡利明1,郝志強(qiáng)1，吳明霞2

(1.河北省安國(guó)市醫(yī)院呼吸科，河北 安國(guó) 071200；

2.河北省滄州市渤海新區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)科，河北 滄州 061113)

[摘要]目的觀察丹紅注射液對(duì)百草枯中毒大鼠肺中轉(zhuǎn)化生化因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)表達(dá)的影響，并探討其肺臟保護(hù)機(jī)制。方法百草枯灌胃染毒造模,觀察肺指數(shù)、肺組織病理學(xué)變化及形態(tài)改變,采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法測(cè)定大鼠血清中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平，采用免疫組織化學(xué)方法測(cè)定肺組織中 TGF-β1的表達(dá)。結(jié)果單純?nèi)径窘M和丹紅治療組各時(shí)間點(diǎn)血清中TNF-α水平和肺組織中TGF-β1水平均高于空白對(duì)照組，丹紅治療組血清中TNF-α水平和肺組織中TGF-β1水平低于單純?nèi)径窘M，單純?nèi)径窘M隨時(shí)間延長(zhǎng)TNF-α和TGF-β1水平逐漸增高，丹紅治療組隨時(shí)間延長(zhǎng)TNF-α和TGF-β1水平逐漸降低，組間、時(shí)點(diǎn)間、組間·時(shí)點(diǎn)間交互作用差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論丹紅注射液能通過(guò)抑制TGF-β1的合成、降低血清中TNF-α水平，減少細(xì)胞外基質(zhì)異常積聚，對(duì)百草枯中毒大鼠肺臟具有保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞]百草枯；中毒；丹紅；大鼠

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.04.021

丹紅注射液是丹參和紅花提取物的中藥制劑。有抗血小板聚集、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、改善微循環(huán)、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、耐缺氧、保護(hù)血管內(nèi)皮、抗細(xì)胞凋亡等作用。百草枯是應(yīng)用比較廣泛的一種除草劑，對(duì)人畜均有較強(qiáng)的毒性，能造成機(jī)體多臟器的損傷。百草枯損害的主要器官是肺，因其死亡的主要原因是肺損傷引起的呼吸性衰竭。本研究以百草枯灌胃染毒造模,觀察丹紅注射液對(duì)百草枯染毒所致大鼠肺病理改變及演變的影響，探討丹紅注射液對(duì)肺臟器官的保護(hù)作用機(jī)制。報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組選擇健康清潔的成年SD大鼠(雄性) 72只(購(gòu)于河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，體質(zhì)量200~240 g，隨機(jī)分為空白對(duì)照組8只、單純?nèi)径窘M32只、丹紅治療組32只。

1.1.1空白對(duì)照組生理鹽水1 mL一次性灌胃。

1.1.2單純?nèi)径窘M百草枯按50 mg/kg用生理鹽水稀釋至1 mL，用其一次性灌胃染毒，染毒后馬上給予生理鹽水(劑量與丹紅注射液量相同，1 mL/kg)腹腔內(nèi)注射，每天注射1次，直至死亡。

1.1.3丹紅治療組百草枯灌胃染毒(與單純?nèi)径?組量相同)，染毒后馬上給予丹紅注射液1 mL/kg (約0.2 mL) 腹腔注射，每天注射1次，直至死亡。

1.2灌胃染毒百草枯按照50 mg/kg進(jìn)行計(jì)算，用生理鹽水將20%百草枯稀釋至1 mL(新鮮配制)，進(jìn)行一次性灌胃染毒，操作過(guò)程: 用16號(hào)長(zhǎng)穿刺針外套管，頂端焊成球形，制成灌胃針，用其連接已抽取百草枯溶液注射器，左手抓牢大鼠，用拇指、食指固定下顎，使其頭、頸在一條線上，取垂直位，右手持針，進(jìn)針深度6~8 cm，若其沒(méi)有明顯的掙扎即可進(jìn)行注射藥物，實(shí)驗(yàn)期間，各組大鼠自由進(jìn)食、喝水。

1.3標(biāo)本收集及制備單純?nèi)径?、丹紅治療組分別于1、7、14、21 d,各取 8 只大鼠，氯胺酮麻醉后，經(jīng)股靜脈取血，高速離心后，留取血清備用；用在200 ℃下烤過(guò)的器械進(jìn)行開(kāi)胸，快速取出部分左肺組織，用刀片將其分成1 mm×1 mm×1 mm大小4~6 塊，置于盛有4% 中性甲醛的小瓶中浸泡固定12 h，制備石蠟切片。對(duì)照組8只做同樣處理。

1.4檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)測(cè)定血清中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平測(cè)定應(yīng)用雙抗體夾心ABC-ELISA法。ELISA試劑盒預(yù)先包被單克隆抗體，需要檢測(cè)的抗體為純化多克隆抗體，將用生物素標(biāo)記的樣品和抗體以及用氧化物酶標(biāo)記的親和素，先后加入酶標(biāo)板孔，反應(yīng)后，用PBS洗滌，底物3,4,5-三甲氧基苯甲醛(3,4,5-Trimethoxybenzaldehyde，TMB)顯色。用酶標(biāo)儀450 nm測(cè)定(光密度,optical density，OD)值，用標(biāo)準(zhǔn)品和樣品吸光值減去對(duì)照孔吸光值所得數(shù)據(jù)在坐標(biāo)上畫(huà)出曲線，并根據(jù)樣品吸光值于坐標(biāo)上找出對(duì)應(yīng)的濃度。

1.4.2肺組織形態(tài)學(xué)改變石蠟切片行HE染色，光鏡下觀察肺組織病變程度。

1.4.3免疫組織化學(xué)檢測(cè)法將載玻片用APES防脫片處理，然后用石蠟切片進(jìn)行脫蠟入水，再用3%甲醛-雙氧水消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性(Ⅰ型膠原標(biāo)本組用1 %胰酶室溫消化45 min)。然后用10%山羊血清進(jìn)行封閉，室溫下放置30 min，以封閉非特異性的結(jié)合位點(diǎn)。加入一抗兔抗鼠Ⅰ型膠原(稀釋度為1∶50)；兔抗鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)(稀釋度為1∶50)，4 ℃下孵育過(guò)夜。陰性對(duì)照組則使用PBS來(lái)代替一抗。加入生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗工作液。加入三抗用辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，37 ℃下孵育30 min。以二氨基聯(lián)苯胺顯色5 min(顯微鏡下控制顯色的時(shí)間)后，終止顯色。使用蘇木精復(fù)染1 min，后用1%鹽酸酒精分化，脫水、透明、封片。圖像分析及結(jié)果判定：用免疫組織化學(xué)染色的TGF-β1可見(jiàn)在細(xì)胞漿內(nèi)表達(dá)。顯微鏡下可以觀察到棕黃色為陽(yáng)性。用真彩色病理圖像分析系統(tǒng)來(lái)計(jì)算結(jié)果。

2結(jié)果

2.13組血清中TNF-α水平比較單純?nèi)径窘M血清中各時(shí)點(diǎn)血清中TNF-α水平均高于空白對(duì)照組，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，單純?nèi)径窘MTNF-α水平逐漸升高；丹紅治療組血清中各時(shí)點(diǎn)TNF-α水平均低于單純?nèi)径窘M，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，丹紅治療組TNF-α水平逐漸降低，但仍高于空白對(duì)照組。3組在組間、時(shí)點(diǎn)間、組間·時(shí)點(diǎn)間交互作用差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1　3組血清中TNF-α水平比較

2.2肺組織形態(tài)學(xué)改變空白對(duì)照組肺泡結(jié)構(gòu)比較清晰而且肺泡壁相對(duì)較完整，未出現(xiàn)明顯肺泡壁充血及增厚，肺泡腔內(nèi)亦未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。單純?nèi)径窘M1 d時(shí)出現(xiàn)明顯的急性肺泡炎癥，如形成部分透明膜、肺水腫、彌漫性肺出血以及炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)等;7 d 時(shí)仍主要為肺泡炎性改變; 14 、28 d 時(shí)出現(xiàn)不同程度的肺泡間質(zhì)纖維性增厚、纖維組織增生，可見(jiàn)玻璃樣變。丹紅治療組也出現(xiàn)單純?nèi)径窘M的表現(xiàn)，但程度較單純?nèi)径窘M輕。

2.33組肺組織中TGF-β1水平比較單純?nèi)径窘M血清中各時(shí)點(diǎn)肺組織中TGF-β1水平均高于空白對(duì)照組，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，單純?nèi)径窘MTGF-β1水平逐漸升高；丹紅治療組肺組織中各時(shí)點(diǎn)TGF-β1水平均低于單純?nèi)径窘M，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，丹紅治療組TGF-β1水平逐漸降低，但仍高于空白對(duì)照組。3組在組間、時(shí)點(diǎn)間、組間·時(shí)點(diǎn)間交互作用差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2　3組血清中TGF-β1水平比較

3討論

肺是百草枯中毒后損傷的主要靶器官,可引起不可逆的進(jìn)行性肺纖維化，最終導(dǎo)致患者呼吸衰竭死亡。百草枯中毒所致的肺損傷表現(xiàn)為早期肺泡上皮細(xì)胞受損,肺泡內(nèi)出血水腫,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),晚期可出現(xiàn)肺泡內(nèi)和肺間質(zhì)纖維化,這種表現(xiàn)被命名為 “百草枯肺”[1]。肺纖維化是百草枯中毒導(dǎo)致患者呼吸衰竭死亡的主要原因。百草枯中毒引起肺間質(zhì)纖維化的形成機(jī)制極其復(fù)雜，其中TGF-β1是肺間質(zhì)纖維化形成的關(guān)鍵因子[2]。研究發(fā)現(xiàn)丹紅注射液輔助治療百草枯中毒肺纖維化有較好的療效[3]。丹參的化學(xué)成分[4]為脂溶性的丹參酮類(lèi)和水溶性的酚酸類(lèi),后者包括丹參素、原兒茶醛和丹參酸。紅花黃色素是從紅花中提取出的有效成分，具有使冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗血小板聚集、降血脂以及耐缺氧等作用，從而被廣泛應(yīng)用于心腦血管病的治療[5-8]。

百草枯灌胃染毒是誘導(dǎo)大鼠肺發(fā)生纖維化可靠方法之一，博萊霉素經(jīng)氣管內(nèi)注入法廣泛地用于制作大鼠實(shí)驗(yàn)性肺纖維化模型[9]，研究發(fā)現(xiàn)，在給予百草枯灌胃后，大鼠出現(xiàn)張口呼吸、呼吸頻率加快、氣促、呼吸困難等改變，經(jīng)肉眼觀察可發(fā)現(xiàn)肺臟的體積出現(xiàn)變化，顏色變得不均勻，先是輕度充血，后充血加重，充血減輕，繼而變得蒼白，開(kāi)始出現(xiàn)瘀血，或者粉紅色相間等改變，最后出現(xiàn)纖維瘢痕灶，逐漸加重[10]。實(shí)驗(yàn)表明，百草枯灌胃染毒是目前制造肺纖維化動(dòng)物模型可靠的方法，而且灌胃染毒比腹腔內(nèi)注射染毒能更好地模擬百草枯臨床中毒的特點(diǎn)[11-12]，值得在百草枯中毒相關(guān)研究中進(jìn)行推廣。

TNF-α既是參與機(jī)體的免疫防護(hù)的重要介質(zhì)，又可以參與機(jī)體的免疫病理?yè)p傷。正常水平的TNF-α可以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、抗感染、促進(jìn)組織修復(fù)、引起腫瘤細(xì)胞凋亡等。研究[13]發(fā)現(xiàn),在大鼠肺成纖維細(xì)胞中 TNF-α能使TGF-β1表達(dá)上調(diào),主要是TNF-α可以活化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 ( extracellular signal-regulated kinase,ERK),而 ERK的抑制劑則可以抑制 TGF-β1mRNA和蛋白的產(chǎn)生。

百草枯中毒后，肺部癥狀主要表現(xiàn)為可誘導(dǎo)肺上皮HPAEpiC細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)發(fā)生肺間質(zhì)纖維化[14]。TGF-β1具有促進(jìn)氣道平滑肌細(xì)胞增殖的作用，能夠促使成纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原和氨基多糖，誘導(dǎo)使成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的分化，進(jìn)而促使肺纖維化的形成。因此，在氣道結(jié)構(gòu)的變化中，TGF-β1又是一種致纖維化因子，導(dǎo)致肺纖維化改變，加重肺功能的進(jìn)行性損害。

本研究結(jié)果顯示，單純?nèi)径窘M肺臟組織中TGF-β1表達(dá)逐漸增加，丹紅治療組TGF-β1蛋白的表達(dá)水平較單純?nèi)径窘M明顯降低，證實(shí)丹紅注射液可以影響百草枯中毒大鼠肺組織中 TGF-β1的表達(dá)，使TGF-β1的表達(dá)減少。提示丹紅注射液具有抗纖維化作用，其抗肺纖維化作用可能與肺組織中TGF-β1表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，丹紅注射液能通過(guò)抑制TGF-β1的合成、降低血清中TNF-α水平，減少細(xì)胞外基質(zhì)異常積聚，對(duì)百草枯中毒大鼠肺臟具有保護(hù)作用。

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(本文編輯：趙麗潔)

[收稿日期]2014-11-26；[修回日期]2014-12-14

[作者簡(jiǎn)介]韋紅梅(1978-)，女，河北定興人，河北省安國(guó)市醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，從事呼吸內(nèi)科疾病診治研究。

[中圖分類(lèi)號(hào)]R595.9

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]B

[文章編號(hào)]1007-3205(2015)04-0441-04