HPLC-MS/MS法測定大鼠血漿中酸棗仁皂苷A含量及其藥動學(xué)研究

張妍，解軍波，張彥青，*

（1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院制藥工程系，天津300134；2.天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津 300134）

HPLC-MS/MS法測定大鼠血漿中酸棗仁皂苷A含量及其藥動學(xué)研究

張妍1，2，解軍波1，2，張彥青1，2，*

（1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院制藥工程系，天津300134；2.天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津 300134）

建立高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)（HPLC-MS/MS）法檢測大鼠血漿中酸棗仁皂苷A的含量，并應(yīng)用于藥動學(xué)研究。大鼠靜注（4mg/kg）或灌胃（20mg/kg）給藥，不同時間取血，血漿樣品經(jīng)處理后，采用HPLC-MS/MS法測定酸棗仁皂苷A含量，色譜柱為Waters YMCTM ODS-AQ S-5 120A（2.0×100mm）分析柱，以電噴霧離子化串聯(lián)質(zhì)譜（ESI）及多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式（MRM）進行檢測，流動相為甲醇-水（0.1%甲酸）=50∶50，流速為0.3mL/min，柱溫為30℃，根據(jù)測定結(jié)果求算藥物的藥動學(xué)參數(shù)。酸棗仁皂苷A在40 ng/mL～4 000 ng/mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r2=0.999 1），各濃度水平的精密度及穩(wěn)定性的RSD均小于15%，提取回收率均大于85%。大鼠注射給藥后主要藥動學(xué)參數(shù)分別為Ke0.28/h，t1/22.55 h，AUC0→t2 839.89 h·ng/mL，AUC0→∞3 201.51 h·ng/mL，灌胃給藥后主要藥動學(xué)參數(shù)分別為Ke0.51/h，t1/21.35 h，AUC0→t206.02 h·ng/mL，AUC0→∞211.13 h·ng/mL。經(jīng)計算，酸棗仁皂苷A在大鼠體內(nèi)的生物利用度為1.32%。本試驗所建立的檢測方法快速簡便、精密度好、靈敏度高及穩(wěn)定性好，適用于酸棗仁皂苷A在大鼠體內(nèi)血藥濃度測定及藥代動力學(xué)的研究。

酸棗仁皂苷A；藥動學(xué)；高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)；生物利用度

酸棗仁是鼠李科植物酸棗（Ziziphus psinosa Hu）的干燥成熟種子，具有斂汗、養(yǎng)肝、寧心安神等多種功效[1]。酸棗仁皂苷A（（Jujuboside A，JuA）是酸棗仁的有效成分之一，具有鎮(zhèn)靜、催眠，降壓、降脂、抗缺氧、增強免疫功能以及對心臟的保護等廣泛的藥理效應(yīng)，其應(yīng)用前景十分誘人[2-4]。本研究建立了HPLC-MS/MS法測定大鼠血漿中酸棗仁皂苷A的含量并對其藥動學(xué)進行了研究。研究結(jié)果顯示建立的方法快速簡便、精密度好、靈敏度高及穩(wěn)定性好，適用于大鼠血漿中酸棗仁皂苷A的含量測定。

1 儀器與試藥

Agilent 1100 Series高效液相色譜儀、G1322A在線脫氣機、G1312B二元泵、G1316B柱溫箱、G1315C DAD紫外檢測器、G1367D自動進樣器、Masshunter色譜工作站：Agilent，USA；BP211D型十萬分之一電子天平：Satorius，Germany；ZH-2型渦流混合器：天津大學(xué)無線電廠；AS10200A型超聲波清洗器：昆山超聲儀器有限公司；酸棗仁皂苷A對照品購自中國食品藥品檢定研究院；甲酸（96%）購自美國Tedia公司；色譜純甲醇與超純水均購自J.T.Baker公司。

Wistar雄性大鼠體重（200±20）g（天津藥物研究所），給藥前禁食24h，不禁水，大鼠血漿由實驗室制備。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱為：Waters YMCTMODS-AQS-5 120A（2.0× 100mm），柱溫為30℃，流動相為（0.1%甲酸溶液）-甲醇（50∶50）；流速0.3mL/min，進樣量為20μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧ESI（-）源，檢測方式：多反應(yīng)檢測（MRM），電噴霧電壓：4 000 V，霧化氣體：N2，霧化氣壓力：35Pa；干燥氣體：N2，干燥氣流速：8 L/min；離子源溫度：350℃，碰撞氣體：高純氮氣，碰撞氣壓力：0.15MPa。酸棗仁皂苷A的質(zhì)譜分析的條件參數(shù)如表1。

表1 酸棗仁皂苷A質(zhì)譜分析的條件參數(shù)Table1 Parameter of Mass Spectra of Jujuboside A

按前述色譜和質(zhì)譜條件對血漿樣品中酸棗仁皂苷A的含量進行測定，記錄色譜圖。圖1和圖2分別為酸棗仁皂苷A對照品、空白血漿樣品及樣品中酸棗仁皂苷A的MS2-Scan全掃描色譜圖及目標(biāo)化合物的MRM色譜圖。由圖可知樣品中酸棗仁皂苷A峰型良好，方法具有較好的分離度和靈敏度，可以進行定量分析。

圖1 酸棗仁皂苷A的MS2-Scan全掃描色譜圖Fig.1 Representative M S2-Scan Chromatograms of JuA

圖2 酸棗仁皂苷A樣品的MRM色譜圖Fig.2 Representative MRM Chromatograms of JuA

2.2 對照品貯備液的配制

精密稱量酸棗仁皂苷A對照品10mg，置10mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻后即得濃度分別為1mg/mL的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密量取酸棗仁皂苷A對照品溶液100μL置1.5mL離心管中，揮干后加入100μL大鼠空白血漿，渦旋混勻，再加入甲醇溶液200μL，渦旋10 min，6000 r/min離心10min，取200μL上清置干凈的1.5mL離心管中，補加100μL水，渦旋5min混勻，過濾后即得供試品溶液。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取適量1mg/mL酸棗仁皂苷A對照品溶液用甲醇稀釋，配制成40、80、200、400、800、1000、2000和4 000 ng/mL系列濃度的供試品溶液，按照2.3項所示方法進行處理，按前述色譜和質(zhì)譜條件測定。以樣品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。酸棗仁皂苷A在40 ng/mL～4 000 ng/mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y= 4.75X+36.35，r2=0.999 1。

2.5 精密度試驗

按照2.3項制備方法，制備40、400、4 000 ng/mL 3個濃度水平的供試品溶液，精密吸取供試品溶液20μL進樣，連續(xù)進樣5次，計算得酸棗仁皂苷A峰面積的RSD分別為4.43%、2.12%和1.92%，表明精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

按照2.3項制備方法，制備40、400、4 000 ng/mL 3個濃度水平的供試品溶液，于-20℃條件下保存，測定樣品時，在室溫條件下放置融化樣品。分別于0、3、6、12、24、48 h進行分析，測定色譜峰面積，計算得各濃度水平的酸棗仁皂苷A峰面積的RSD分別為9.17%、6.82%和4.76%，表明穩(wěn)定性良好。

2.7 重現(xiàn)性試驗

按照2.3項制備方法，制備40、400、4 000 ng/mL 3個濃度水平的供試品溶液各5份供試液，依法測定，計算得各濃度水平的酸棗仁皂苷A峰面積的RSD分別為7.26%、4.43%和3.97%，表明重現(xiàn)性良好。

2.8 提取回收率試驗

按照2.3項制備方法，制備40、400、4 000 ng/mL 3個濃度水平的供試品溶液測定酸棗仁皂苷A的含量。再分別取40、400、4 000 ng/mL 3個濃度水平的酸棗仁皂苷A對照品溶液100μL于1.5mL離心管中揮干，分別加入按照2.3法處理的未加藥的空白血漿200μL，補加100μL水后，搖勻，過濾后進樣測定酸棗仁皂苷A的含量。按照公式（1）計算得大鼠血漿中酸棗仁皂苷A提取回收率分別為85.64%、91.64%和86.69%，表明該方法提取回收率良好。

3 藥動學(xué)研究

取Wistar大鼠10只，隨機平均分為尾靜脈注射給藥組和口服灌胃給藥組，用乙醚使之輕度麻醉，將新鮮配制的酸棗仁皂苷A標(biāo)準(zhǔn)品生理鹽水注射劑對大鼠分別進行尾靜脈注射（劑量為4mg/kg）和口服灌胃給藥（劑量為20mg/kg），給藥后立即使之清醒。尾靜脈給藥組給藥后于10、30min、1、1.5、2、3、4、6 h和8 h經(jīng)大鼠眼底靜脈叢采血約400μL～500μL，注入含有0.1%肝素鈉的抗凝管中輕搖混勻，6 000 r/min離心10min后取上層血漿?？诜辔附o藥組給藥后于10、30min、1、1.5、2、3、4、6、8 h和10 h經(jīng)大鼠眼底靜脈叢采血后同上處理方法分離血漿。按照2.3法處理血漿樣品，測定血漿中的藥物濃度，計算相應(yīng)藥動學(xué)參數(shù)和平均血藥濃度-時間曲線，如表2和圖3所示。

表2 大鼠給藥后酸棗仁皂苷A藥動學(xué)參數(shù)Table2 The pharmacokinetic parameters of JuA in rats following intravenous administration and oral administration of JuA

圖3 兩種不同給藥途徑的平均血藥濃度-時間曲線Fig.3 Mean（±SD）plasma concentration-time profiles of JuA

4 討論

本試驗建立了準(zhǔn)確靈敏且快速的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-MS/MS）來測定大鼠血漿樣品中酸棗仁皂苷A的濃度。結(jié)果顯示，大鼠血漿樣品中的酸棗仁皂苷A在40 ng/mL～4 000 ng/mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，各濃度水平的精密度及穩(wěn)定性的標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15%，提取回收率均大于85%，由此說明藥物經(jīng)本方法處理后性質(zhì)穩(wěn)定，符合血漿樣品分析的各項要求，適用于大鼠血漿中酸棗仁皂苷A的含量測定。

本研究以Wistar大鼠為實驗動物，以尾靜脈注射給藥方式作為對照，研究酸棗仁皂苷A灌胃給藥后，藥物在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)過程。結(jié)果表明，酸棗仁皂苷A在大鼠體內(nèi)呈現(xiàn)線性動力學(xué)特征，但該藥物經(jīng)灌胃給藥后的生物利用度很低，初步推測藥物可能是以原型的形式或發(fā)生某種轉(zhuǎn)化后大量存在與胃腸道中，或是通過其他途徑發(fā)揮藥效作用，具體結(jié)論仍需進一步實驗對其進行佐證。

[1] 中華人民共和國藥典[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010

[2]Shea J L,Mochizuki T,Sagvaag V,et al.Rapid eye movement(REM) sleep homeostatic regulatory processes in the rat:changes in the sleep-wake stages and electroencephalographic power spectra[J]. Brain Research,2008,1213:48-56

[3] Wang X H,Li Z,Wang X.Sedative and hypnotic effects of suanzaoren decoction in different dose[J].Journal of Shanxi College Traditional Chinese Medicine,2006,7:19-20

[4] Cao J X,Zhang Q Y,Cui SY,et al.Hypnotic effect of jujubosides from Semen Ziziphi Spinosae[J].Journal of Ethnopharmacology, 2010,130:163-166

Determination of Jujuboside A in Rat Plasm a by HPLC-MS/M S and Its Pharmacokinetics Study

ZHANG Yan1，2，XIE Jun-bo1，2，ZHANG Yan-qing1，2，*
（1.Tianjin University of Commerce，School of Biotechnology and Food Science，Department of Pharmaceutical Engineering，Tianjin 300134，China；2.Tianjin Key Laboratary of Food Biotechnology，Tianjin 300134，China）

To establish a method for the determination of the concentration of Jujuboside A（JuA）in rat plasma by liquid chromatography-mass/mass spectrometry（HPLC-MS/MS），and study its pharmacokinetics.The rats were intravenously （4 mg/kg）or oral（20 mg/kg）administrated JuA.Blood samples were drawn from the palpebra at different stages.The concentrations of JuA in the plasma were determined by the HPLC-MS/MS method.Chromatographic separation was carried out with a security guard Waters YMCTM ODS-AQS-5 120A（2.0×100 mm）（Waters，USA）.HPLC-MS/MS was performed on a triple-quadrupole mass spectrometry equipped with electrospray ionization（ESI）and negative multiple reaction monitoring （MRM）.The mobile phase consisted of methanol-water-formic acid （50∶50∶0.1），delivered at the flow rate of0.3mL/min under 30℃.The method was linear over the concentration range of 40 ng/mL-4 000 ng/mL（r2=0.999 1）.The relative standard deviations of the assay were less than 15.0%for the low，and the recovery of the method was more than 85%.The pharmacokinetic parameters were as follows：Ke0.28/h，t1/22.55 h，AUC0→t2 839.89 h·ng/m L，AUC0→∞3 201.51h·ng/mL in rat with intravenous administration，and Ke0.51/h，t1/21.35h，AUC0→t206.02h·ng/mL，AUC0→∞211.13 h·ng/mL in rat with oral administration.The bioavailability of JuA was1.32%.The developed method was successfully applied to the estimation of the pharmacokinetic parameters of JuA.

Jujuboside A；pharmacokinetic;HPLC-MS/MS；bioavailability

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.03.028

2013-11-22

張妍（1987—），女（漢），碩士研究生，從事生物活性物質(zhì)的分離篩選的研究工作。

*通信作者：張彥青（1974—），女（漢），副教授。