紫蘇分離蛋白酶解制備抗菌肽的工藝優(yōu)化

姜文鑫，王曉飛，崔玲玉，閔偉紅，*

（1.阿魯科爾沁旗天山鎮(zhèn)食品藥品監(jiān)督局，內(nèi)蒙古赤峰025550；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春130118）

紫蘇分離蛋白酶解制備抗菌肽的工藝優(yōu)化

姜文鑫1，王曉飛2，崔玲玉2，閔偉紅2，*

（1.阿魯科爾沁旗天山鎮(zhèn)食品藥品監(jiān)督局，內(nèi)蒙古赤峰025550；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春130118）

以紫蘇分離蛋白為原料，通過堿性蛋白酶（Alcalase）水解制備紫蘇抗菌肽。以大腸桿菌為指示菌，在單因素試驗基礎(chǔ)上，運用響應(yīng)面（RSM）法對水解條件進行優(yōu)化，并研究了紫蘇抗肽的廣譜抗菌性、熱穩(wěn)定性和水解度與抑菌性的關(guān)系。結(jié)果顯示：在加酶量6.89%、酶解溫度52.68℃、底物濃度4.17%、pH 8.98，水解3 h的條件下，酶解產(chǎn)物RSM的理論預(yù)測值為19.33mm，實際測量值為19.40mm。廣譜抗菌試驗表明：紫蘇抗菌肽對沙門氏菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用。水解度和抑菌性試驗表明：抑菌性隨水解度增加而增強，后趨于穩(wěn)定。

紫蘇；抗菌肽；響應(yīng)面；酶解

抗菌肽是廣泛存在于動植物體內(nèi)一類小分子多肽，具有廣譜抗菌性、耐熱性、無免疫原性和對人體無毒副作用等特點[1-2]，近年來越來越受到人們的重視。自1974年瑞典科學(xué)家Boman[3]等首次發(fā)現(xiàn)天蠶素，人們逐漸在細菌、真菌、植物、昆蟲類、兩棲類、禽類、和哺乳動物中相繼發(fā)現(xiàn)具有類似功能的生物多肽，國內(nèi)外的研究主要集中在微生物抗菌肽和動物抗菌肽，而對植物來源的抗菌肽則相對較少[1]。通過酶解植物蛋白制備抗菌肽具有成本低廉、來源廣泛和工藝簡單等特點[4]。

紫蘇（Perilla Prutescens Linn，Britton）為生唇形科植物一年草本植物[5]，是我國傳統(tǒng)的藥食兩用植物。紫蘇籽中的含油率高達45%左右[6]，目前對紫蘇籽的研究主要集中在紫蘇籽油的開發(fā)利用，而對油料副產(chǎn)物紫蘇籽粕用于飼料或直接丟棄，為提高紫蘇資源的利用價值，本研究以脫脂紫蘇粕提取的分離蛋白為原料，水解得到具有抑菌活性的多肽，并研究其廣譜抗菌性等理化性質(zhì)、水解度與抗菌性的關(guān)系，為紫蘇資源的開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫蘇粕：由敦化廣晟生物油脂有限公司。菌種：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院發(fā)酵工程實驗室。Alcalase 2.4L蛋白酶：FGNovozymes公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

EF-20型實驗室pH計：瑞士梅特勒-托利多集團；Z36HK高速冷凍離心機：德國HERMLE公司；CL-32L高壓蒸汽滅菌器：日本ALP；GNP-9080培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；振HZQ-F160蕩培養(yǎng)箱：哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紫蘇分離蛋白的制備

紫蘇分離蛋白通過堿溶酸沉法制備[6]。

1.3.2 紫蘇抑菌肽的制備

取適量蛋白液放入90℃水浴中加熱15min，水浴冷卻后調(diào)節(jié)pH，按一定體積質(zhì)量比加入Alcalase蛋白酶，在一定溫度的水浴條件酶解3 h，用NaOH溶液維持初始pH，90℃滅酶15min，水浴冷卻，5 000 r/min離心10min，取上清液進行冷凍干燥，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 抑菌活性的測定

采用瓊脂孔穴擴散法[6-7]。

1.3.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計原理[8]，進行響應(yīng)面試驗，試驗設(shè)計編碼表見表1。

表1 響應(yīng)面中心設(shè)計法各因素編碼值和實際值Table1 The factors code value and actual value of center design of the response surface method

1.3.5 水解度與抑菌性的關(guān)系

在響應(yīng)面優(yōu)化的基礎(chǔ)上，采用最佳酶解條件對紫蘇分離蛋白進行酶解，研究水解度和抑菌性的關(guān)系[9-10]。pH-star法進行測定[11]。

1.3.6 加熱時間和凍融次數(shù)對紫蘇抑菌肽穩(wěn)定性的影響

參照宋茹[11]方法進行。

1.3.7 紫蘇抑菌肽在不同pH條件的抑菌活性

不同pH條件的抑菌活性參照Mason[12]方法進行。

1.3.8 紫蘇抑菌肽的廣譜抑菌性

參照Das[13]方法進行。

1.4 數(shù)據(jù)用origin 7.5和Design-Expert8.0進行分析，所有試驗為3個平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

2.1.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果及顯著性分析

響應(yīng)面試驗結(jié)果及顯著性分析如表2、表3。

表2 Box-Behnken中心組合設(shè)計方案及結(jié)果Table2 The Box–Behnken design for optimizing hydrolysis conditions with antibacterial zone length（mm）

表3 回歸模型顯著性檢驗及方差分析Table3 Analysis of variance for the fitted quadratic regression model

運用Design-Expert8.0.6.1軟件對結(jié)果進行分析，得抗菌肽抑菌直徑的二次多元回歸方程為：

去掉不顯著的一次項X2、和二次項X1X4、X2X4、X3X4后最終為：

由表3可知，決定系數(shù)R2為0.976 1，模型可以預(yù)測97.61%的響應(yīng)值變化，模型顯著性檢驗極顯著（P< 0.000 1），模型失擬項不顯著（P=0.097 6），說明模型擬合度較好，試驗誤差較小，可以用此模型對紫蘇多肽的抑菌率的響應(yīng)值進行分析和預(yù)測[14]。各因素對抑菌性結(jié)果影響大小的順序為：底物濃度＞酶解溫度＞加酶量＞pH。

2.1.2 顯著性交互作用影響分析

各因素交互作用影響還原能力結(jié)果如圖1所示。從圖中可以直觀地反映各因素對響應(yīng)值的影響，找出最佳工藝參數(shù)以及各參數(shù)之間的相互作用。

圖1 各因素交互作用影響還原能力的響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface of mutual influence on the reducing power ability

2.1.3 驗證試驗

驗證試驗效果圖見圖2。

圖2 響應(yīng)面優(yōu)化后的紫蘇抑菌肽抑菌效果圖Fig.2 After the response surface optimization of Perilla antibacterial picture

根據(jù)Design-Expert8.0.6.1軟件的分析，得出紫蘇蛋白水解抑菌肽的最佳工藝條件為：加酶量68.96μL/g、pH 8.93、底物濃度4.2 g/100mL、酶解溫度52.98℃，在此條件下得到的抑菌圈直徑預(yù)測值為19.318 9mm。結(jié)合實際條件，選擇加酶量為69μL/g、pH 8.93、底物濃度4.2 g/100mL、酶解溫度53℃，圖2為此條件下的抑菌效果圖，得到的抑菌圈直徑為（19.6±1.1）mm與理論預(yù)測值19.3mm無顯著性差異（0.05﹤P），表明試驗所得模型可以用于預(yù)測實際值。

2.2 水解度與抑菌性的關(guān)系

水解度與抑菌性的關(guān)系如圖3。

圖3 水解度與抑菌性的關(guān)系Fig.3 The relation between degree of hydrolysis and bacteriostasis

如圖3所示，在響應(yīng)面優(yōu)化后的最佳工藝條件下，隨著水解時間的增加，紫蘇蛋白的水解度逐漸增加，抑菌逐漸增大。這一結(jié)果表明紫蘇抑菌肽至少在水解7 h的時間內(nèi)，抑菌性和水解度成正相關(guān)關(guān)系。與水解度趨勢不同的是，在水解180min后，紫蘇抑菌肽的抑菌性增加速度趨于緩慢，這可能是因為隨著酶解反應(yīng)的進行，蛋白質(zhì)分子被酶不斷水解成較小肽鏈，而根據(jù)以往的報道，抗菌肽一般為12個～100個氨基酸殘基的肽鏈，所以隨著酶解的進行，紫蘇抑菌肽的抗菌效果逐漸增大，然而當(dāng)酶解繼續(xù)進行時，抗菌肽可能被進一步水解成更小的寡肽或氨基酸，抑菌性效果增速降低[15]。

2.3 紫蘇抑菌肽在不同pH條件下的抑菌效果

紫蘇抑菌肽在不同pH條件下的抑菌效果見圖4。

圖4 pH條件與抑菌性的關(guān)系Fig.4 The relation between degree of hydrolysis and bacteriostasis

圖4顯示了紫蘇抑菌肽在pH 3～11的范圍內(nèi)抑菌效果對比，由圖可知無論在大于或小于pH 9.0的條件下，紫蘇抑菌肽的抑菌效果都逐漸下降，與之前宋茹報道的有所不同[16]，這可能是因為紫蘇抑菌肽是在pH 8和9的條件下水解得到的，偏離這pH 8和9時對紫蘇抑菌肽的結(jié)構(gòu)和周圍電荷都有很大的影響，進而影響了紫蘇抑菌肽的抑菌性。值得一提的是在pH 6.0后紫蘇抑菌肽的抑菌性急劇下降，這可能是因為紫蘇抑菌肽的等電點在pH 5.0左右[4]，在等電點時紫蘇抑菌肽的溶解性最低，進而導(dǎo)致了抑菌效果的下降。

2.4 紫蘇抑菌肽的廣譜抑菌性

紫蘇抑菌肽的廣譜抑菌性效果見圖5。

圖5 紫蘇抑菌肽分別對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的抑制效果圖Fig.5 Perilla antibacterial peptide of bacillus subtilis，staphylococcus aureus，salmonella inhibitory effect

由圖5可知，紫蘇對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌，以及革蘭氏陰性菌大腸桿菌和鼠傷寒沙門菌的生長均具有抑制作用，這表明利用Alcalase對紫蘇分離蛋白在一定條件下水解所得到的多肽具有廣譜抑菌性。

3 結(jié)論

在本試驗中，以大腸桿菌為指示菌，利用Alcalase對紫蘇分離蛋白進行水解，分別對加酶量、酶解pH、底物濃度和酶解溫度進行考察，在單因素試驗的基礎(chǔ)上根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計原理，進一步對酶解條件進行響應(yīng)面優(yōu)化，得出最佳工藝為：加酶量69μL/g、pH 8.93、底物濃度4.2 g/100mL、酶解溫度53℃，在此條件下的到紫蘇抑菌肽抑菌能力和水解度成正相關(guān)性關(guān)系，對革蘭氏陰性菌大腸桿菌和鼠傷寒沙門菌，革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的生長均具有抑制作用，具有廣譜抑菌性，并且在pH9.0左右的抑菌能力最強。紫蘇抑菌肽作為一種潛在的抑菌肽來源在未來的實際應(yīng)用中具有很大的潛力。

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Enzymatic Preparation Optimization of Antimicrobial Peptides from Perilla Protein Isolate

JIANG Wen-xin1，WANG Xiao-fei2，CUI Ling-yu2，MIN Wei-hong2，*
（1.Food and Drug Administration of Tian Shan Town Ar Horqin Banner，Chifeng025550，Inner Mongolia，China；2.College of Food Science and Engineering，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，Jilin，China）

In this experiment，perilla seed protein isolate as raw material，through alkaline protease（Alcalase）was prepared by hydrolysis of Perilla antibacterial peptide.Using Escherichia colias indicator bacteria，based on single factor experiments，using response surface （RSM）to optimize the hydrolysis method，we study the relationship between the Perilla antipeptide antibacterial property，thermal stability and hydrolytic degree and bacteriostasis.Results：in 6.89%of the amount of enzyme，hydrolysis temperature 52.68℃，substrate concentration 4.17%，pH 8.98，3h hydrolysis conditions，prediction theory of enzymatic hydrolysate of RSM valuewas19.33mm，the actual measured value is19.40mm.Antibacterial tests showed that：perilla inhibition effects of antibacterial peptides on Salmonella，bacillus and Staphylococcus aureus were.Show that the degree of hydrolysis and the Bacteriostatic Experiment：the antibacterial activity was increased with the increasing degree of hydrolysis，then tended to be stable.

Perilla；antibacterial peptide；response surface；enzymatic hydrolysis

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.03.035

2014-11-16

姜文鑫（1988—），男（漢），碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工程。

*通信作者：閔偉紅（1971—），女，教授，博士，研究方向：發(fā)酵工程、糧油科學(xué)與深加工技術(shù)。