響應(yīng)面法優(yōu)化紫山藥色素提取工藝

王衛(wèi)東，朱連濤，孫月娥，高明俠

（1.徐州工程學(xué)院食品（生物）工程學(xué)院，江蘇徐州 221111；2.江蘇省食品資源開(kāi)發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州 221111）

響應(yīng)面法優(yōu)化紫山藥色素提取工藝

王衛(wèi)東1，2，朱連濤1，孫月娥1，2，高明俠1

（1.徐州工程學(xué)院食品（生物）工程學(xué)院，江蘇徐州 221111；2.江蘇省食品資源開(kāi)發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州 221111）

以紫山藥為原料，采用溶劑提取法提取紫山藥色素。結(jié)果表明，紫山藥色素的最大吸收波長(zhǎng)為540 nm，與丙酮和甲醇相比，體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇對(duì)色素的提取率最高。以吸光值為指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)分別考察了液料比、溫度和提取時(shí)間等三個(gè)因素對(duì)紫山藥色素提取率的影響，在此基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)乙醇提取色素的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳工藝條件為：液料比92（mL/g）、溫度58℃、提取時(shí)間128min。

紫山藥；色素；響應(yīng)面法

山藥（Dioscorea opposita）學(xué)名薯蕷，為薯蕷科薯蕷屬植物，是我國(guó)衛(wèi)生部公布的藥食兩用蔬菜。紫山藥屬于山藥的紫紅肉品種群，因其皮和肉質(zhì)含有豐富的花色苷，因此呈現(xiàn)紫紅色[1]。紫山藥比一般的山藥含有更多的維生素和微量元素，特別是它有含多種花色苷，并含有大量的蛋白質(zhì)、多糖、薯蕷皂甙元等較高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及藥理成分[2]?；ㄉ帐且活悘V泛存在于高等植物中的天然水溶性色素，存在于很多水果、蔬菜和花朵中，呈現(xiàn)紅、藍(lán)、紫或者黑的色澤。花色苷不但可以作為天然色素，而且在抗氧化[3]、抗炎癥[4]、抗突變[5-6]、抗腫瘤[7]、改善視力[8]、預(yù)防和治療心血管疾病[9]等方面具有良好的作用。從紫山藥中提取的色素或者其他多酚類化合物，可作為功能性食品配料或者天然著色劑使用。唐曉偉等[10]采用快速溶劑萃取技術(shù)對(duì)紫山藥色素提取工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。倪勤學(xué)等[11]采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化了溶劑提取法提取紫山藥色素的工藝參數(shù)。本文以新鮮的紫山藥為原料，采用溶劑提取法，利用Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)紫山藥色素提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為紫山藥中色素的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫山藥：市售；乙醇：國(guó)藥集團(tuán)上海試劑公司；其他試劑均為分析純。

722G型分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DHG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；RE5299真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；DF-15中藥粉碎機(jī)：溫嶺市大德中藥機(jī)械有限公司；LGJ―10真空冷凍干燥機(jī)：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料的預(yù)處理

新鮮的紫山藥清洗，瀝干，切片，冷凍干燥，粉碎，過(guò)40目篩，裝于密封袋中，4℃冷藏備用。

1.2.2 紫山藥色素最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定

稱取0.1 g紫山藥粉末，加入體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇100mL，超聲10min后離心。殘?jiān)?0%乙醇重復(fù)提取，直到提取液清澈無(wú)色。合并提取液，上層水相在30℃下真空濃縮除去乙醇，用水定容到250mL。將一定濃度的提取液在紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上掃描，波長(zhǎng)范圍為500 nm～700 nm，記錄最大吸收峰的位置。

1.2.3 提取溶劑對(duì)紫山藥色素提取率的影響

分別采用體積分?jǐn)?shù)為0%、20%、40%、60%、80 %、100%的乙醇、丙酮、甲醇提取紫山藥中的色素，真空濃縮除去有機(jī)溶劑后定容到100mL，測(cè)定提取液吸光值，比較提取劑對(duì)色素的提取效果。

1.2.4 紫山藥色素提取工藝優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以體積分?jǐn)?shù)40%的乙醇溶液為提取溶劑，以540 nm吸光值為指標(biāo)，對(duì)液料比、提取時(shí)間、溫度進(jìn)行單因素試驗(yàn)。根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以液料比、提取時(shí)間和溫度為影響因素，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。試驗(yàn)因素與水平如表1所示。

表1 因素水平表Table1 Independent variables and levels for optimization

2 結(jié)果與分析

2.1 紫山藥色素的最大吸收波長(zhǎng)

利用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)掃描色素提取液，結(jié)果如圖1所示。可見(jiàn)，紫山藥色素的最大吸收波長(zhǎng)在540 nm。曾哲玲等[12]采用40%的乙醇提取紫山藥色素，發(fā)現(xiàn)其在540 nm左右處出現(xiàn)特征吸收峰，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)中通過(guò)測(cè)定540 nm處的吸光值評(píng)價(jià)色素的提取效果，吸光值越大，表明色素的提取率越高。

圖1 紫山藥色素的可見(jiàn)光譜圖Fig.1 Vis spectra of purple yam pigment

2.2 提取劑對(duì)色素提取效果的影響

分別取0.2 g的紫山藥粉末，以提取劑與紫山藥液料比為100∶1（mL/g）的比例，加入不同濃度的乙醇、丙酮、甲醇，在30℃下攪拌提取30min，離心后取上清液，真空濃縮除去有機(jī)溶劑，定容到100mL，測(cè)定其在540 nm波長(zhǎng)處的吸光值，比較不同溶劑對(duì)色素提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 提取劑對(duì)色素提取率的影響Fig.2 Effect of extraction solvent on pigment extraction yield

由圖2可見(jiàn)，各溶劑濃度低于50%（體積分?jǐn)?shù)）時(shí)，乙醇對(duì)色素的提取率較高，其中以40%（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇提取效果最好；當(dāng)各溶劑高于50%（體積分?jǐn)?shù)）時(shí)，丙酮對(duì)色素的提取率較高，但隨提取劑濃度的增高呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，故選擇40%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇為提取劑。

2.3 紫山藥色素提取單因素試驗(yàn)

2.3.1 液料比對(duì)色素提取效果的影響

取0.2 g紫山藥粉末為原料，分別按液料比（m L/g）70、80、90、100的比例加入40%（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇溶液作為提取劑，30℃攪拌提取60min，離心后取上清液，測(cè)定其在540 nm波長(zhǎng)下的吸光值。為消除由于提取劑體積增加對(duì)色素提取液濃度的稀釋，以液料比70為基準(zhǔn)比例，其他比例下測(cè)得的吸光值換算成和它相同體積下的吸光值，比較液料比對(duì)提取效果的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 液料比對(duì)色素提取率的影響Fig.3 Effect of ratio of liquid：solid ration on pigment extraction yield

由圖3可見(jiàn)，隨著液料比的增大，提取液的吸光值也增加，當(dāng)液料比達(dá)到90時(shí)，吸光值最大。此后當(dāng)液料比繼續(xù)增加，吸光值基本不變，表明色素提取率不再增加。因此，當(dāng)選擇液料比為90時(shí)，既有利于紫山藥色素的提取，也利于減少溶劑的浪費(fèi)，減少后續(xù)濃縮步驟的成本。

2.3.2 提取溫度對(duì)提取率的影響

取0.2 g紫山藥粉末，按液料比90的比例加入40%（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇溶液作為提取劑，分別在30、40、50、60、70℃時(shí)攪拌提取60min，離心后取上清液，測(cè)定其在540 nm波長(zhǎng)下的吸光值，比較溫度對(duì)提取效果的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取溫度對(duì)色素提取率的影響Fig.4 Effect of temperature on extraction yield of pigment

由圖4可見(jiàn)，在一定范圍內(nèi)，隨著提取溫度的增加，紫山藥色素提取率不斷增加，當(dāng)提取溫度達(dá)到60℃時(shí)，提取率達(dá)到最大，隨后再增加提取溫度，提取率反而降低了。這是因?yàn)樽仙剿幧卦谳^高溫度下發(fā)生了降解，吸光值減小。因此，選擇提取溫度為60℃。

2.3.3 提取時(shí)間對(duì)色素提取率的影響

取0.2 g紫山藥粉末，按液料90的比例加入濃度為40%（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇作為提取劑，60℃恒溫?cái)嚢杼崛?0、60、90、120min，離心后取上清液，測(cè)定其在540 nm波長(zhǎng)下的吸光值，比較提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響，結(jié)果如圖5所示?？梢?jiàn)，隨著提取時(shí)間的增加，色素的提取率不斷增加。當(dāng)提取時(shí)間為120min時(shí)，提取率達(dá)到最高。因此選擇提取時(shí)間為120min。

圖5 提取時(shí)間對(duì)花色苷提取率的影響Fig.5 Effect of time on extraction yield of ACN

2.4 紫山藥色素提取的最佳工藝參數(shù)

2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⒓捌浣Y(jié)果

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取提取溫度（X1）、液料比（X2）和提取時(shí)間（X3）三個(gè)影響因素，采用三因素三水平的響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)花色苷提取率（y）進(jìn)行優(yōu)化[13]。設(shè)該模型通過(guò)最小二乘法擬合的二次多項(xiàng)方程為：

式中：B0為常數(shù)項(xiàng)，Bi為線性系數(shù)；Bij為交互項(xiàng)系數(shù)；Bii為二次項(xiàng)系數(shù)；ε為隨機(jī)誤差。按照 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，對(duì)上述方程的各項(xiàng)回歸系數(shù)進(jìn)行回歸擬合。試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Box-Behnken design with the observed responses

利用Design expert V 8.0統(tǒng)計(jì)軟件通過(guò)逐步回歸對(duì)表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到吸光值對(duì)以上 3個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸模型為：Y=1.43+ 0.093X1-0.18X2+0.13X3+0.022X1X2-0.01X1X3+0.025X2X3-0.19X12-0.46X22-0.25X32。對(duì)該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 二次回歸方程模型方差分析Table3 ANOVA for the regression model

由表3可知，模型具有高度顯著性（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（p＞0.05）以及RSN（信噪比）為17.416，可知回歸方程擬合度和可信度均很高，實(shí)驗(yàn)誤差較小，故可用此模型對(duì)紫山藥色素提取的工藝結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算原理可知，回歸方程相關(guān)系數(shù)R2為0.982 3，說(shuō)明模型能解釋98.23%響應(yīng)值的變化，說(shuō)明該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合程度良好，用該模型對(duì)乙醇提取紫山藥色素的提取過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化是合適的。

2.4.2 響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化

根據(jù)回歸方程，作響應(yīng)曲面圖，考察所擬合的響應(yīng)曲面的形狀，分析液料比、溫度以及提取時(shí)間對(duì)色素提取率的影響。模型的響應(yīng)面及其等高線如圖6、圖7和圖8所示。

等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反[14]。比較3組圖并結(jié)合表3中p值可知：模型的一次項(xiàng)X1（p＜0.05）顯著，X2、X3（p＜0.01）高度顯著，交互項(xiàng)均不顯著（P>0.05）；二次項(xiàng)均高度顯著（p＜0.01）。因此，各影響因素對(duì)紫山藥色素的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。液料比、溫度和提取時(shí)間對(duì)提取率有顯著的影響，各因素之間的交互作用對(duì)提取率沒(méi)有造成顯著影響。

圖6 液料比、溫度對(duì)色素提取率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.6 Response surface and contour plot showing effect of liquid: solid ration and temperature on extraction yield of pigment

圖7 提取時(shí)間、溫度對(duì)色素提取率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.7 Response surface and contour plot showing effect of time and temperature on extraction yield of pigment

圖8 提取時(shí)間、液料比對(duì)色素提取率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.8 Response surface and contour plot showing effect of time and liquid:solid ration on extraction yield of pigment

為進(jìn)一步確定最佳提取工藝參數(shù)，采用Design expertV 8.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)模型進(jìn)行優(yōu)化求解，可得最佳工藝參數(shù)為液料比92∶1（mL∶g），溫度58℃，提取時(shí)間128min，此時(shí)紫山藥色素提取液吸光值為1.477。

2.4.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為檢驗(yàn)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)所得結(jié)果的可靠性，采用上述最優(yōu)提取條件進(jìn)行紫山藥色素的提取實(shí)驗(yàn)，在此條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得提取液的平均吸光值為1.489，與預(yù)測(cè)值基本相符，因此，基于Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)所得的最佳工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值

3 結(jié)論

紫山藥色素最大吸收波長(zhǎng)為540 nm，不同提取劑對(duì)其提取效果不同，40%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇溶液提取效果最好。液料比、溫度和提取時(shí)間對(duì)紫山藥色素提取率有顯著影響，由單因素和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其分析結(jié)果獲得乙醇提取紫山藥色素的最佳工藝參數(shù)為液料比92∶1（g∶mL），溫度58℃，提取時(shí)間128min。

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Optimization of Extraction of Purple Pigment from Yam Using Response Surface Methodology

WANG Wei-dong1，2，ZHU Lian-tao1，SUN Yue-e1，2，GAO Ming-xia1
（1.College of Food and Biological Engineering，Xuzhou Institute of Technology，Xuzhou 221111，Jiangsu，China；2.Jiangsu Key Laboratory of Exploitation of Food Resources and Food Quality Safty，Xuzhou 221111，Jiangsu，China）

Purple yam pigment was extract by solvent extraction method.The results indicated that aqueous alcohol extracts produced the absorption maximas at 540 nm.A aqueous alcohol concentration of 40%（v/v）extracted maximum pigments，compared with acetone and methanol.Effects of three factors of liquid：solid ratio，temperature and extraction time were studied.Based on it，conditions of extraction were optimized by response surface design.The optimum conditions of extraction were a liquid∶solid ratio of 92∶1（mL/g），temperature of 58℃and extaction time of128min.

purple yam；pigment；response surface methodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.03.005

2013-12-07

國(guó)家科技富民強(qiáng)縣專項(xiàng)行動(dòng)計(jì)劃項(xiàng)目（BN2012105）

王衛(wèi)東（1971—），男（漢），副教授，研究生，研究方向：功能性食品配料與添加劑。