白簕葉不同極性部位的體外抗氧化活性分析

楊慧文，張旭紅，陳健媚，潘育方，*，錢婧

（1.廣東藥學院藥科學院，廣東廣州510006；2.揚州工業(yè)職業(yè)技術學院文理系，江蘇揚州225000）

白簕葉不同極性部位的體外抗氧化活性分析

楊慧文1，張旭紅1，陳健媚1，潘育方1，*，錢婧2

（1.廣東藥學院藥科學院，廣東廣州510006；2.揚州工業(yè)職業(yè)技術學院文理系，江蘇揚州225000）

利用不同溶劑對白簕葉各極性部位進行提取、顯色鑒定和薄層色譜分析，并考察其中乙酸乙酯、正丁醇和水3個不同極性部位提取液的體外抗氧化活性，通過測定其鐵還原力、對DPPH·的清除率、總抗氧化力，篩選出主要的抗氧化活性部位。結果表明，白簕葉3個不同極性部位的成分的種類和含量差別均較大，體外抗氧化結果顯示各部分體外抗氧化活性也存在較大差異，其中正丁醇部位抗氧化活性最高。

白簕葉；黃酮；抗氧化活性

白簕Acanthopanax trifoliatus（Linn.）Merr.，為五加科（Araliaceae）五加屬（Acanthopanan）攀援狀灌木，又稱鵝掌簕、刺三加、白刺尖，分布于兩廣、福建、云南、貴州等地，東南亞如泰國、越南等也有分布[1]。白簕味苦、辛、涼，具有清熱解毒、祛風利濕、止咳平喘、散瘀止痛之功效[2-3]，其主要化學成分為槲皮甙、黃酮、多糖、咖啡?？鼘幩岬萚4-6]。經(jīng)研究，白簕具有消炎抑菌、防齲固齒、治療新生兒濕疹等作用[7-9]。五加屬植物多有抗氧化作用，刺五加可抑制鼠巨噬細胞中一氧化氮的產生[10]，其莖提取物在四氯化碳中毒大鼠模型中具有抗氧化功效[11]。而白簕同為刺五加屬，其抗氧化功效，尤其是關于其活性部位的篩選，少有研究。

因此，本實驗通過測定鐵還原力、對DPPH的清除率、總抗氧化力[12-14]，將測定結果與維生素C進行對比，從三個方面研究白簕葉不同極性部位的抗氧化活性，篩選抗氧化活性部位，為進一步研究開發(fā)白簕提取物的抗氧化功效提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

白簕莖購自恩平響山簕菜茶廠（經(jīng)廣東藥學院中藥學院中藥資源系劉基柱副教授鑒定為五加屬植物白簕，標本保存于廣東藥學院中藥學院標本室）、鎂粉（40目～90目）：鶴壁市江浪金屬有限公司；DPPH.（分析純）：美國Sigma公司；維生素C（VC）（分析純）：天津市石英鐘廠霸州市化工分廠；三氯化鋁、磷酸三鈉、鉬酸銨、香草醛、三氯化鐵、硫酸、無水乙醇、正丁醇等均為分析純。

1.1.2 主要儀器

KQ5200超聲儀：東莞市科橋超聲波設備有限公司；XW-80A微型漩渦混合儀：上海滬西分析儀器廠；HH-2恒溫水浴鍋：常州澳華儀器有限公司；RE-52AA旋轉蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SHZD-DⅢ循環(huán)式水泵：鞏義市予華儀器有限責任公司；LD4-2A低速離心機：北京醫(yī)用離心機廠；UV-1200紫外可見光分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；萬分之一天平：FA2104A上海精天電子儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備

40 g白簕葉粉碎，過60目篩。200m L石油醚在50℃下攪拌提取1 h，抽濾，反復提取，直至提取液近于無色，將葉渣自然風干；再用200mL氯仿在40℃下提取1 h，更換提取溶劑，共提8次，直至提取液近于無色，將葉渣自然風干。

用200mL乙酸乙酯在50℃下攪拌提取該葉渣1 h，收集提取液，重復數(shù)次直至乙酸乙酯提取液顏色很淺，合并提取液，在40℃下減壓旋蒸，得白簕葉乙酸乙酯部位50mL。

自然風干葉渣后，200 mL 95%乙醇超聲提取60 min，每次超聲20min，過濾，重復操作，至乙醇提取液近于無色，合并提取液，40℃下減壓旋蒸濃縮，用蒸餾水少量多次復溶，得白簕葉水提部位100mL。

用50mL水飽和正丁醇對上述水溶液進行萃取，萃取3次，合并萃取液，得正丁醇部位150mL。

將上述3個不同極性部位提取液在4℃下密封保存，備用。

1.2.2 顯色反應

采用顯色反應的方法，對1.2.1項下3個不同極性部位提取液進行定性鑒定。

1.2.2.1 鹽酸-鎂粉反應

分別取白簕葉各極性部位提取液2mL于不同試管中，各加入適量乙醇、少許鎂粉振搖，滴加幾滴濃鹽酸，觀察顏色反應。

1.2.2.2 堿性試劑顯色反應

取兩張濾紙，均點上白簕葉各極性部位提取液，其中一張用濃氨水熏，與另外一張對比觀察顏色變化，于空氣中放置一段時間后，再觀察顏色變化。

1.2.2.3 鋁鹽反應

分別取白簕葉各極性部位提取液2mL于不同試管中，各加入2滴1%AlCl3醇溶液，與對照管對比觀察顏色變化。用毛細管取樣點于硅膠板上，于紫外燈下觀察熒光。

1.2.2.4 Molish反應

分別取白簕葉各極性部位提取液2mL于不同試管中，各加入適量乙醇，2滴α萘酚溶液，斜置試管，沿管壁加入濃硫酸約1mL，靜置，觀察二層溶液界面的變化。

1.2.2.5 三氯化鐵反應

分別取白簕葉各極性部位提取液4mL于不同試管中，各加入1滴5%三氯化鐵溶液，與對照管對比觀察顏色變化。

1.2.2.6 三氯甲烷-濃硫酸檢驗（Salkowski反應）

分別取白簕葉各極性部位提取液1mL于不同試管中，各加入1m L三氯甲烷混勻，沿管壁加入等體積濃硫酸，與對照管對比觀察顏色的變化。

1.2.3 聚酰胺薄層色譜

取乙酸乙酯、正丁醇和水這3個部位的濃縮液于相同的聚酰胺薄膜上點樣，每個樣品點兩個點。使用正丁醇-乙酸-水-石油醚（4∶1∶1∶2）系統(tǒng)進行展開，于紫外燈下觀察展開效果。用濃氨水作為顯色劑，同樣在紫外燈下觀察熒光效果。

1.2.4 體外抗氧化活性的測定

取一定體積白簕葉3個不同極性部位提取液各自減壓旋干后，用5mL 70%乙醇復溶，分別得到乙酸乙酯部位待測液（32、80、160、240、320mg/m L）5個濃度梯度，水部位待測液（13、17、24、40、60mg/mL）5個濃度梯度，以及正丁醇部位待測液（3.0、3.9、5.4、9.0、13.5mg/mL）5個濃度梯度。其中濃度代表每毫升提取液相當于原藥材的質量（mg）。

按照以下操作評價各部分樣品的總抗氧化力和鐵還原力、對DPPH·自由基清除率。制備濃度為20、30、40、50、60mg/mL的VC溶液作對比試驗。

1.2.4.1 鐵還原力的測定

取待測液1m L置于試管中，加入2.5m L磷酸緩沖液（0.2mol/L，pH=6.6）和2.5mL 1%鐵氰化鉀，放入50℃水浴鍋中20min后取出急速冷卻，加入10%三氯乙酸溶液2.5mL。將上述溶液離心10min（3000 r/min），取上清液5mL。再加入4mL蒸餾水及1mL 0.1%FeCl3混勻，靜置10min后測定吸光值（λ=700 nm），吸光度值越大表明還原力越強[12]。

1.2.4.2 總抗氧化能力測定

取待測液1m L置于試管中，依次滴加1m L 0.6mol/L硫酸溶液、1.5mL 28mmol/L磷酸鈉、1.5mL 4mmol/L鉬酸銨，隨后向試管中加入0.6mL蒸餾水，搖勻。95℃水浴90min，取出急速冷卻。另取一支試管，加入除待測液外的上述溶液，作為空白對照。在λ=695 nm測定吸光度值。

1.2.4.3 對DPPH．自由基清除率的測定

取2.0mL待測液、2mL 0.15mmol/L的DPPH·乙醇溶液加入試管，充分混勻后靜置30min。以70%乙醇作為空白對照，在517 nm下測定樣品吸光度。根據(jù)公式計算出3個不同極性部位提取液對DPPH·的清除率[13]。

式中：A0為2.0mLDPPH·溶液+2.0mL 70%乙醇吸光度值；A為樣品吸光度值；A1為2.0mL待測液+ 2.0mL 70%乙醇吸光度值。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

2 結果

2.1 顯色反應

對白簕葉不同極性部位提取液進行七個顯色反應，從而定性鑒定不同部位中所含的物質種類，其結果如表1所示。

表1 白簕葉不同極性部位提取液顯色反應結果Table 1 Chromogenic reaction of different fractions from Acanthopanax trifoliatus（Linn.）Merr.leaves

鹽酸-鎂粉反應是檢查樣品中是否含有黃酮類化合物的最常用方法之一。由于黃酮具有鄰酚羥基，可與鎂離子形成紅色或橙色絡合物。表中結果顯示除正丁醇部位提取液顯現(xiàn)紅色現(xiàn)象外，其余無明顯反應，說明正丁醇部位很可能含有黃酮類物質。

堿液反應是在日光及紫外光下，通過紙斑反應，觀察樣品用堿性試劑處理后的顏色變化情況，對于鑒別黃酮類化合物有一定意義。其結果顯示，正丁醇部位斑點顏色由淡黃色變?yōu)辄S色，在空氣中放置，黃色逐漸褪去，進一步驗證了正丁醇部位黃酮類化合物的存在。

同樣，鋁鹽反應也是較為經(jīng)典的黃酮鑒別反應，結果顯示正丁醇部位具有黃色熒光，說明該部位黃酮類化合物的存在。

Molish反應常用于糖類和苷的檢測反應。實驗結果發(fā)現(xiàn)，正丁醇部位和水提部位液在兩層溶液交界面均出現(xiàn)棕色環(huán)，乙酸乙酯部位不存在此現(xiàn)象，說明正丁醇部位和水提部位可能含有苷類物質。

三氯化鐵反應常用來判斷酚羥基的有無，酚羥基可與三氯化鐵中Fe3+形成配合物，顯藍紫色。香豆素類常含有酚羥基，可與三氯化鐵形成綠色或墨綠色沉淀。實驗現(xiàn)象顯示，經(jīng)三氯化鐵試驗，正丁醇部位顯深藍色，水提部位顯淺墨綠色，乙酸乙酯部位顯淺綠色，說明正丁醇部位、水提部位和乙酸乙酯部位可能均含有不同濃度的酚羥基。

Salkowski反應用于鑒別甾體、三萜類化合物陽性現(xiàn)象為硫酸層呈現(xiàn)紅色或者藍色，氯仿層有綠色熒光。經(jīng)Salkowski反應后，正丁醇部位的氯仿層有綠色熒光出現(xiàn)，而兩層溶液的交接出呈紅色；水提部位的氯仿層和兩溶液交界處分別出現(xiàn)淺綠色熒光和淺紅色，可初步判斷正丁醇部位和水提部位可能均含有不同濃度的三萜類或甾體類化合物。

2.2 聚酰胺薄層色譜

為進一步驗證乙酸乙酯、正丁醇和水這3個不同極性部位的成分，對3個部位進行薄層鑒定，結果如下圖1。

圖1 聚酰胺薄層色譜結果Fig.1 Result of polyamide TLC chromatogram of different fractions from Acanthopanax trifoliatus（Linn.）Merr.leaves

由圖可見，3個部位熒光的位置和顏色都有所不同，同一區(qū)段不同部位的熒光強弱也不同，說明3個部位所含的成分有明顯區(qū)別，但也存在一定的交叉。

2.3 白簕葉各極性部位的鐵還原力分析

還原力大小常作為評價抗氧化性強弱的指標之一，具有較強還原力的樣品可使Fe3+還原為Fe2+。本實驗測定不同極性部位提取液的還原力，與VC進行比較，結果見圖2。

圖2 白簕葉不同極性部位樣品鐵還原力的測定結果Fig.2 Reducing power of Fe3+of different polarity fractions from Acanthopanax trifoliatus（Linn.）M err.leaves

樣品還原鐵氰化鉀后，與Fe3+反應生成普魯士藍，生成量越多，吸光度越大，說明樣品還原力越強。由圖2-A可知，白簕葉各極性部位和VC均表現(xiàn)出不同程度的鐵還原力，比較圖2-A各曲線可得，相同濃度下，正丁醇部位的鐵還原力最強，水提部位次之，乙酸乙酯部位的鐵還原力并不顯著。在吸光度為0.33～0.37之間時，正丁醇、水提、乙酸乙酯部位和VC的樣品濃度分別為3、13、320、40mg/mL。同樣鐵還原力強度對應的白簕葉不同極性部位提取液濃度差異較大，該現(xiàn)象可能是因為各部位所含具有鐵還原力的物質種類不同或含量不同造成的。

將正丁醇、水提部位以及VC三種樣品的鐵還原力比較得圖2-B，從圖中可見，隨著濃度的增加，正丁醇和水提部位樣品的吸光度均隨之增加，表明樣品的鐵還原力與濃度在試驗范圍內存在較好的相關性，鐵還原力具有明顯的量效關系。正丁醇和水提部位的鐵還原力在試驗范圍內均高于VC。

2.4 白簕葉各部位的總抗氧化力

采用改良后的Prieto法測定白簕葉各部位抗氧化力，其原理是磷鉬酸銨被具有抗氧化性的物質還原，得到最大吸收波長為695 nm的磷鉬絡合物。物質還原活性越強，即抗氧化性越強，生成物吸光度越大[15]，測定結果如圖3。

圖3 白簕葉各極性部位的總抗氧化力Fig.3 Total antioxidant activity of different polarity fractions from Acanthopanax trifoliatus（Linn.）Merr.leaves

圖3結果顯示，白簕葉不同極性部位對磷鉬酸銨均具有較好的還原能力。隨著樣品濃度的增加，各產物吸光度均逐漸增大，說明濃度增加該還原能力逐漸增強，各極性部位的抗氧化力呈現(xiàn)了良好的量效關系。與經(jīng)典抗氧化劑VC相比，各極性部位對磷鉬酸銨的還原能力均強于VC。在濃度為40mg/mL以上時，3個極性部位的抗氧化能力強弱依次為，正丁醇部位＞水提部位＞乙酸乙酯部位＞VC。

2.5 白簕葉各部位對DPPH·自由基的清除率測定

DPPH·在是一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，具有孤對電子，易自行結合成為穩(wěn)定的分子；其醇溶液呈紫色，最大吸收波為517 nm。當加入抗氧化劑時，其單電子被配對，溶液顏色變淺，導致其吸光值下降。根據(jù)吸光度值的降低計算清除率，清除率越大，抗氧化性越強，從而評價樣品的抗氧化能力[16]，結果如圖4。

由圖4-A可得，白簕葉各極性部位對DPPH·均具有較好的清除能力，對DPPH·的清除率隨著濃度的增加而逐漸增大，但當濃度升高到一定值時，清除率上升明顯緩慢或不再上升。由圖4-B可得，在濃度低于9mg/mL時，正丁醇部位對DPPH·的清除具有較好的量效關系。當濃度到達試驗范圍最高值時，正丁醇、水和乙酸乙酯三個部位對DPPH·的清除率分別為97.40%、86.05%和90.10%，與VC的最高清除率92.43%均較為接近。其中正丁醇部位對DPPH·的清除能力，無論是最佳清除效果還是低濃度時的清除率，均高于經(jīng)典抗氧化物VC。而乙酸乙酯和水提部位在低濃度時的清除能力和最佳清除效果均低于VC?？傮w來說，各樣品的清除能力依次為，正丁醇部位＞VC＞水提部位＞乙酸乙酯部位。該現(xiàn)象可能由于正丁醇部位中對DPPH·有清除能力的物質活性較強或含量較高。

圖4 白簕葉不同極性部位樣品對DPPH·清除率的測定結果Fig.4 Scavenging capacities for DPPH·of different polarity fractions from Acanthopanax trifoliatus（Linn.）Merr.Leaves

3 討論

五加屬（Acanthopanan）植物是一類藥用價值較高的植物，大多分布在亞洲，其中的刺五加更是有“木本人參”的稱號，臨床上具有益氣健脾、補腎安神等功效[17]。白簕是五加屬中的一種，由于其兼具營養(yǎng)價值和藥用價值，在產地已成為日常生活的特色蔬菜之一。本文利用溶劑萃取法對白簕葉不同極性部位做初步分離，并對不同部位的成分及抗氧化功效進行了研究。

本實驗分離得到白簕葉的乙酸乙酯、正丁醇，及水提部位，對3個部位進行顯色鑒定和聚酰胺薄層色譜鑒定結果表明，3個部位中所含成分種類和含量均有不同，在成分種類上有少許交叉。

對3個部位體外抗氧化實驗結果表明，3個部位均具有不同程度的體外抗氧化活性，且三者的鐵還原力和總抗氧化力均與濃度之間存在較好的相關性，有量效關系。正丁醇部位對DPPH·清除率在低濃度時具有量效關系，隨著濃度的逐漸升高，到達9mg/mL以上時，清除率不再增加。3個部位的體外抗氧化活性強弱依次為：正丁醇部位＞水提部位＞乙酸乙酯部位，說明正丁醇部位具有體外抗氧化力的物質活性較強或含量較高。VC是一種公認的經(jīng)典抗氧化物質，具有很強的抗氧化能力，實驗中取VC進行相比，發(fā)現(xiàn)正丁醇部位的總抗氧化力、鐵還原力以及對DPPH·清除率均明顯高于VC；而水提部位除DPPH·清除率與VC接近，其鐵還原力和總抗氧化力均高于VC。結果提示正丁醇部位和水提部位是白簕葉中抗氧化活性的主要部位，值得重點進一步研究，可通過進一步分離分析，確定白簕葉抗氧化活性的主要物質基礎。

[1]梁明標,吳青,孫遠明.保健野蔬——簕菜[J].蔬菜,2005(1):38

[2]江蘇新藥學院.中藥大辭典[M].上海:上海人民衛(wèi)生出版社,1977

[3]朱立新．中國野生蔬菜開發(fā)與利用[M].北京:金盾出版社,1996

[4]杜江,高林.白簕葉的化學成分研究[J].中國中藥雜志,1992,17(6): 356-357,383

[5] Kiem P V,Minh C V,Cai X F,et al.A new 24-nor-lupane-glyco side of Acanthopanax trifoliatus[J].Arch Pharm Res,2003,26(9): 706-708

[6] P Sithisarn,S Muensaen,S Jarikasem.Determination of Caffeoyl Quinic Acidsand Flavonoids in Acanthopanax trifoliatus Leaves by HPLC[J].Natural Product Communications,2011,6(9):1289-1291

[7]黃曉慧,黃俊生,衷明華,等.白簕含氟牙膏的制作[J].韓山師范學院學報,2007(3):74-76

[8] 肖杭,黎云祥,蔡凌云,等.白簕葉總黃酮的提取和純化及其抑菌試驗初探[J].光譜實驗室,2010(6):2130-2134

[9] 陳小菊.簕菜療法在新生兒濕疹治療中的應用和護理成效[J].實用醫(yī)學雜志,2006(13):1587-1588

[10]Lin QY,Jin L J,Ma Y S，et al.Acanthopanax senticosus inhibits nitrc oxide production in murine macrophages in vitro and in vivo[J]. Phytother Res,2007,21:879-883

[11]Lee S,Son D,Ryu Jet al.Antioxidant activities of Acanthopanax senticosu stems and their lignan components[J].Arch Pharmacol Res,2004,27:106-110

[12]Ozsoy N,Can A,Yanardag R,et al.Antioxidant Activity of Smilax Excelsa L.Leaf Extracts[J].Food Chemistry,2008,110(3):574

[13]Leong L P,Shui G.An Investigation of Antioxidant Capacity of Fruits in Singapore Markets[J].Food Chemistry,2002,76:69-75

[14]彭惠惠,李呂木,錢坤,等.發(fā)酵芝麻粕中芝麻小肽的分離純化及其體外抗氧化活性[J].食品科學,2013,34(9):66-69

[15]Pan YM,He CH,Wang HS,et al．Anti-oxidant activity of microwaveassisted extract of Buddleia officinalis and its major active component[J]．Food Chemistry,2010,121:497-502

[16]彭長連,陳少薇.用清除有機自由基DPPH.法評價植物抗氧化能力[J].生物化學與生物物理進展,2000,27(6):658-661

[17]張瓊,王長江.刺五加高產栽培技術[J].農村科學實驗,2012(10): 15-16

Research on Antioxidant Activity of Different Fractions of Acanthopanax trifoliatus Leaves in Vitro

YANG Hui-wen1，ZHANG Xu-hong1，CHEN Jian-mei1，PAN Yu-fang1，*，QIAN Jing2
（1.College of Pharmacy，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，Guangdong，China；2.Department of Arts and Science，Yangzhou Polytechnic Institute，Yangzhou 225000，Jiangsu，China）

To study the antioxidant activity of different fractions from Acanthopanax trifoliatus leaves in vitro，the leaves were extracted and separated into three parts with different polarity.Three methods including 2，2-diphenyl-1-picrylhyd-razyl radical scavenging assay，ferric reducing power and total antioxidant power were performed to detect the antioxidant activity.The results showed that among the three fractions，n-butanol layer exhitbited the strongest antioxidant activitie comparing with ethyl acetate，and water layer.

Acanthopanax trifoliatus leaves；flavonoid；antioxidant activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.03.004

2013-12-28

楊慧文（1983—），女（漢），實驗師，碩士，主要從事藥學及新藥開發(fā)的研究

*通信作者：潘育方（1966—），男，教授，主要從事藥物新劑型及安全性評價的研究。