桑白皮甾醇的萃取和純化工藝研究

徐艷陽，蔡森森，張凡，李越山

（吉林大學生物與農(nóng)業(yè)工程學院，吉林長春130022）

桑白皮甾醇的萃取和純化工藝研究

徐艷陽，蔡森森，張凡，李越山

（吉林大學生物與農(nóng)業(yè)工程學院，吉林長春130022）

為優(yōu)化桑白皮甾醇的提取工藝，分別考查萃取溶劑種類、乙醇粗提液與蒸餾水體積比、萃取時間、乙醇粗提液與萃取溶劑體積比對桑白皮甾醇得率的影響；采用二因素三水平正交試驗優(yōu)化萃取工藝，結(jié)果表明最佳萃取工藝條件為：乙醇粗提液與氯仿體積比1∶1、乙醇粗提液與蒸餾水體積比1∶1，此時桑白皮甾醇得率為（5.63±0.28）mg/g。通過對不同類型大孔吸附樹脂的比較，獲得D-900大孔吸附樹脂為較佳類型。氯仿萃取液采用D-900大孔吸附樹脂進行柱層析兩次，桑白皮甾醇純度可達（50.48±1.39）%。對純化后樣品采用薄層色譜法進行定性分析，純化樣品和β-谷甾醇標準品在同一位置有紫紅色斑點析出。應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定，桑白皮純化樣品含有羊毛甾醇、谷甾醇、β-香樹脂醇和α-香樹脂醇。

桑白皮；植物甾醇；提??；樹脂；柱色譜；薄層色譜

matography

植物甾醇是以甾核即環(huán)戊烷多氫菲為骨架、結(jié)構(gòu)上類似于膽固醇，來源于植物的甾體化合物，具有降低血膽固醇濃度、抑制腫瘤、抑制乳腺增生、防治前列腺肥大、調(diào)節(jié)免疫等生理功能[1]。國際生命科學學會把由植物甾醇和甾烷醇構(gòu)成的保健食品推薦為十大功能性食品之一。而且植物甾醇作為功能食品，已被美國食品藥品管理局（FDA）、歐盟食品科學委員會（SCF）等官方機構(gòu)認可和推薦，主要以膠囊、咀嚼片、片劑等形式在國外市場上流通，不僅把它添加在高脂產(chǎn)品中，也向低脂食品中發(fā)展。國內(nèi)金龍魚糧油知名企業(yè)于2009年率先將植物甾醇玉米油在中國市場推廣。2011年國際Wilmar&BASF營養(yǎng)與健康聯(lián)合研究院在上海建立，主要致力于植物甾醇的試驗研究與開發(fā)應(yīng)用。因此，對植物甾醇的研究開發(fā)具有廣闊的市場前景。

桑白皮（CortexMori）為?？粕僦参锇咨＃∕orus alba L.）的干燥根皮，是我國衛(wèi)生部于2002年公布的可用于保健食品的中藥之一[2]。全世界共有12種?？粕僦参?，其中中國有9種，在全國各地均有栽培，主要分布于新疆、四川、河北、山東、東北三省、云南和廣東等地。目前國內(nèi)外學者對桑白皮的研究主要集中在多糖、黃酮類化合物、多糖、生物堿等的提取及抗氧化性、降糖、平喘和治療肺疾病等方面[3-8]。對桑白皮甾醇的研究報道很少，僅有Piao Shu-juan[9]、胡葉梅[10]等學者應(yīng)用氣相色譜法對桑白皮甾醇的含量進行了研究。因此，本文對桑白皮甾醇的萃取工藝進行研究，應(yīng)用大孔樹脂柱層析對萃取液進行分離純化，為桑白皮甾醇的應(yīng)用開發(fā)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑白皮購于長春市同仁堂藥店；β-谷甾醇標準品（GC＞95%）阿拉丁試劑（中國）有限公司；大孔吸附樹脂購于滄州寶恩吸附材料科技有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

AL104型電子分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；CY-100微量進樣器：北京青云卓立精密設(shè)備有限公司；T22N紫外可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；SHA-C水浴恒溫振蕩器：金壇市恒豐儀器廠；LD4-2A型低速離心機：北京市雷勃爾離心機有限公司；PH070A干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；層析柱：長春市華泰玻璃儀器公司；5975-6890N氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑白皮甾醇萃取-柱層析純化工藝流程

桑白皮乙醇粗提液[11]→離心→取上清液加入蒸餾水和溶劑萃取→搖勻、靜置分層→水洗至中性→用無水硫酸鈉干燥→濃縮、回收溶劑→得到油膏狀物質(zhì)（甾醇粗制品）→配制2mg/mL桑白皮甾醇氯仿萃取液→過柱（大孔吸附樹脂）2次→濃縮、回收溶劑→桑白皮甾醇純化樣品

1.3.2 試驗指標與方法

1.3.2.1 硫磷鐵法測定桑白皮甾醇得率

參照文獻[11]硫磷鐵法測定，桑白皮甾醇得率的計算公式如下：

式中：y1為桑白皮甾醇得率，（mg/g）；c1為萃取液吸光度值對應(yīng)β-谷甾醇標準溶液質(zhì)量濃度，（mg/mL）；v1為萃取液體積，mL；b為稀釋倍數(shù)；m1為桑白皮質(zhì)量，g。

1.3.2.2 桑白皮甾醇含量計算

桑白皮甾醇含量的計算公式如下：

式中：yc為桑白皮甾醇純度，%；c2為純化后甾醇溶液的質(zhì)量濃度，（mg/mL）；v2為溶液體積，mL；b為稀釋倍數(shù)；m2為純化后桑白皮甾醇的質(zhì)量，g。

1.3.2.3 薄層色譜法定性分析

參照文獻[12]進行檢測，樣品比移植的計算公式如下：

式中：Rf為比移值，%；D1為原點與斑點中心的距離，cm；D2為原點與展開劑前沿的距離，cm。

1.3.2.4 氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）測定

氣相色譜條件：采用Agilent5975-6890N氣質(zhì)聯(lián)用儀，色譜柱為AgilentHP-5毛細管柱（30m×250μm，0.25μm），進樣量1.0μL，進樣溫度為280℃，分流比為30∶1，載氣為氦氣，流速為1.1mL/min。

質(zhì)譜條件：離子源為EI，電子能量為70 eV，離子源溫度為230℃，傳輸線溫度為280℃，質(zhì)量范圍20 amu～700 amu，全掃描方式。

1.3.3 桑白皮甾醇萃取試驗

1.3.3.1 萃取工藝的單因素試驗

選擇萃取溶劑種類、乙醇粗提液與蒸餾水體積比、萃取時間、乙醇粗提液與萃取溶劑體積比作為試驗的單因素。量取25m L桑白皮乙醇粗提液，依次加入一定量的蒸餾水、萃取溶劑，振蕩搖勻，靜置分層后取萃取溶劑層，用蒸餾水水洗至中性，采用無水硫酸鈉干燥，然后蒸餾濃縮、回收溶劑，并采用硫磷鐵法測定甾醇得率。各個因素的水平分別為：萃取溶劑氯仿、乙醚、石油醚、正己烷；乙醇粗提液與蒸餾水體積比1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8、1∶1、1∶1.2；萃取時間5、10、15、20、25、30min；乙醇粗提液與萃取溶劑體積比1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8、1∶1、1∶1.2、1∶1.4。在進行單因素試驗時，其他固定條件分別為萃取溶劑為氯仿、乙醇粗提液與蒸餾水體積比1∶1、萃取時間5min、乙醇粗提液與溶劑體積比1∶1。

1.3.3.2 萃取工藝優(yōu)化試驗

選擇乙醇粗提液與氯仿體積比、乙醇粗提液與蒸餾水體積比為考查因素，以甾醇得率為試驗指標，在L9（34）正交表上安排優(yōu)化試驗。試驗因素水平表見表1。

表1 試驗因素水平表Table1 Levelsof experim ental factors

1.3.4 桑白皮甾醇柱層析純化工藝試驗

1.3.4.1 大孔吸附樹脂的選擇

采用D-900、NKA-9、AB-8、D101、S-8大孔吸附樹脂對桑白皮甾醇萃取液進行純化；然后分別在紫外光區(qū)掃描各樣液，與β-谷甾醇標準溶液進行對比分析；選擇純化效果較優(yōu)的大孔吸附樹脂，以不同的樹脂質(zhì)量進行干法裝柱，比較脫色效果的優(yōu)劣。

1.3.4.2 純化試驗

以D-900大孔吸附樹脂進行分離純化，重復(fù)過柱兩次，測定桑白皮甾醇含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每次試驗重復(fù)3次，應(yīng)用SPSSV17.0對數(shù)據(jù)進行方差分析（Analysisof Variance，ANOVA），組間比較采用LSD法（Least-significant difference）和S-N-K法（Student-Newman-Keuls），p＜0.05表示存在顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取工藝單因素試驗及分析

2.1.1 萃取溶劑種類對甾醇得率的影響

在250mL帶塞錐形瓶中依次加入25mL桑白皮乙醇粗提液、25mL蒸餾水和25mL萃取溶劑（乙醚、石油醚、正己烷、氯仿），搖勻、萃取5min，結(jié)果見圖1（p＜0.01）。

圖1 萃取溶劑種類對甾醇得率的影響Fig.1 Effectsof typeof extraction solventon phytosterol extraction rate

在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，石油醚萃取部分經(jīng)蒸餾后為灰白色物質(zhì)，該物質(zhì)不溶于無水乙醇，無法進行硫磷鐵法檢測甾醇含量。其他三種溶劑經(jīng)蒸餾后得到黃色油膏狀物質(zhì)，顏色由深至淺依次為氯仿、正己烷、乙醚。但乙醚萃取部分隨水洗次數(shù)的增加，體積銳減，故不選擇乙醚作為萃取溶劑。由圖1可知，與正己烷相比，使用氯仿進行萃取，甾醇得率提高了46.92%，因此選擇氯仿。

2.1.2 乙醇粗提液與蒸餾水體積比對甾醇得率的影響

在250mL帶塞錐形瓶中加入25mL桑白皮乙醇粗提液，按照乙醇粗提液與蒸餾水體積比1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8、1∶1、1∶1.2分別加入10、15、20、25、30mL蒸餾水，再加入25mL氯仿，搖勻、萃取5min，試驗結(jié)果見圖2（p＜0.01）。

圖2 乙醇粗提液與蒸餾水體積比對甾醇得率的影響Fig.2 Effects of volume ratio ofethanolcrudeextract to distilled water on phytosterolextraction rate

由圖2可知，乙醇粗提液與蒸餾水體積比在1∶0.4～1∶0.8范圍內(nèi)甾醇得率緩慢增加，在1∶0.8～1∶1.2范圍內(nèi)甾醇得率增加地較快。因此，乙醇粗提液與蒸餾水體積比選擇1∶1～1∶1.2。

2.1.3 萃取時間對甾醇得率的影響

在250mL帶塞錐形瓶中依次加入25mL桑白皮乙醇粗提液、25mL蒸餾水和25mL氯仿，搖勻，分別萃取5、8、10、15、20min，試驗結(jié)果見圖3（p＞0.05）。

圖3 萃取時間對甾醇得率的影響Fig.3 Effectsof extraction tim eon phytosterolextraction rate

由圖3可知，根據(jù)ANOVA，p＞0.05表明萃取時間在5min～20min范圍內(nèi)對甾醇得率的影響沒有顯著性差異。因此，萃取時間選擇5min。

2.1.4 乙醇粗提液與氯仿體積比對甾醇得率的影響

在250mL帶塞錐形瓶中依次加入25mL桑白皮乙醇粗提液和25mL蒸餾水，按照乙醇粗提液與氯仿體積比1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8、1∶1、1∶1.2、1∶1.4分別加入10、15、20、25、30、35mL氯仿，搖勻、萃取5min，試驗結(jié)果見圖4（p＜0.01）。

圖4 乙醇粗提液與氯仿體積比對甾醇得率的影響Fig.4 Effectsofvolume ratio ofethanolcrudeextract to chloroform on phytosterolextraction rate

由圖4可知，乙醇粗提液與氯仿體積比在1∶0.4～1∶1范圍內(nèi)甾醇得率逐漸增加，在1∶1～1∶1.4范圍內(nèi)甾醇得率逐漸減少。這是由于分液漏斗容積有限，下方氯仿層無法充分萃取上層乙醇粗提液中的甾醇，導致甾醇得率下降。因此，乙醇粗提液與氯仿體積比選擇1∶1。

2.2 萃取工藝優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇乙醇粗提液與氯仿體積比（A）、乙醇粗提液與蒸餾水體積比（B）為考查因素，以甾醇得率為試驗指標，在L9（34）正交表上安排優(yōu)化試驗。試驗方案及結(jié)果見表2～表3。

表2 L9（34）正交試驗方案及結(jié)果Table2 Resultsof L9（34）or thogonalexperiments

表3 方差分析結(jié)果Table3 Resultsof ANOVA

由表2可知，根據(jù)極差分析，乙醇粗提液與氯仿體積比的優(yōu)水平為1∶1，乙醇粗提液與蒸餾水體積比的優(yōu)水平為1∶1.2；根據(jù)RA＞RB表明影響甾醇得率的主次順序為乙醇粗提液與氯仿體積比、乙醇粗提液與蒸餾水體積比。與蒸餾水體積比的優(yōu)水平1∶1.2相比，當加入蒸餾水體積比1∶1時，其yB2（5.23）與yB1（5.28）的值相差無幾，綜合考慮甾醇得率及節(jié)約蒸餾水用量，乙醇粗提液與蒸餾水體積比的優(yōu)水平選擇1∶1。

由表3可知，乙醇粗提液與氯仿體積比對甾醇得率有極顯著的影響，乙醇粗提液與蒸餾水體積比則有顯著的影響；這與表2分析結(jié)果一致。因此桑白皮甾醇萃取試驗的最優(yōu)工藝參數(shù)為：乙醇粗提液與氯仿體積比為1∶1、乙醇粗提液與蒸餾水體積比為1∶1。對優(yōu)組合的甾醇得率進行區(qū)間估計。計算點估計值y?優(yōu)= 5.12+0.58+0.12=5.82，誤差限εα=0.39。因此，優(yōu)組合的甾醇得率真值在5.43mg/g～6.21mg/g，此時的置信度為95%。在上述優(yōu)組合條件下進行3次驗證試驗，測得甾醇得率為（5.63±0.28）mg/g，在2.2.1 ANOVA得出的置信區(qū)間5.43mg/g～6.21mg/g，表明采用L9（34）正交試驗優(yōu)化的工藝參數(shù)是可靠的。

2.3 柱層析純化試驗及其結(jié)果分析

2.3.1 大孔吸附樹脂的確定

5種大孔吸附樹脂分別采用干法裝柱，樹脂質(zhì)量為5.0 g；將配制好的2mg/mL甾醇萃取液從柱頂加入，流速為0.5mL/min；洗脫液為4∶1氯仿：乙醇（體積比），洗脫速度為5mL/min。試驗結(jié)果見表4，各樣液的紫外掃描圖見圖5～圖6。

由表4可知，d樣液的純度最高，為48.71%。由圖5可知，β-谷甾醇標準溶液的最大吸收峰為244 nm，這與趙文竹等[13]學者的結(jié)果（243 nm）接近。由圖6可知，b、c、d、e、f和g樣液的最大吸收峰依次為：251、244、245、244、244、242 nm，其最大吸收峰與β-谷甾醇標準溶液的相近。根據(jù)樣液的甾醇純度及最大吸收峰位置，選擇D-900大孔吸附樹脂進行下一步的純化試驗。

由圖7可知，與a樣液相比，d、h和k樣液在可見光區(qū)400 nm～600 nm范圍內(nèi)吸光度值明顯下降，即脫色效果明顯。在波長244 nm處，k樣液（1.646）的吸光度值比a樣液（1.704）低3.40%，比d樣液（1.686）低2.37%，比h樣液（1.656）低0.60%，而其余波長處的吸光度值均低于a、d和h樣液，表明雜質(zhì)去除效果較優(yōu)。因此選擇10.0 g D-900大孔吸附樹脂、以流速0.25mL/min進行柱層析分離。

表4 經(jīng)不同樹脂處理后產(chǎn)品的純度Table 4 Thepurity of sam ples treated by different resins

圖5 β-谷甾醇標準溶液（氯仿溶劑）的紫外掃描圖Fig.5 UV scanning graphsofstandard solution ofβ-sitosterol（chloroform as solvent）

圖6 經(jīng)不同大孔吸附樹脂處理樣液的紫外掃描圖Fig.6 UV scanning graphsofsolutionsafter treated by different m acroporousadsorption resins

圖7 經(jīng)D-900大孔吸附樹脂處理樣液的紫外掃描圖Fig.7 UV scanning graphsofsolutionsafter treated by D-900 macroporous adsorption resins

2.3.2 D-900大孔吸附樹脂分離效果

桑白皮甾醇萃取液采用D-900大孔吸附樹脂進行分離純化兩次，甾醇含量達（50.48±1.39）%。

桑白皮甾醇溶液與β-谷甾醇標準溶液的薄層色譜圖見圖8。

圖8 β-谷甾醇標準溶液與桑白皮甾醇溶液的薄層色譜圖Fig.8 Thin layer chromatogram sof purified extractandβsitosterolstandard solution

由圖8可知，β-谷甾醇標準品Rf=（48.73±1.66）%，桑白皮甾醇Rf=（48.17±2.79）%，即純化樣品與β-谷甾醇標準品在同一位置有紫紅色斑點析出，表明純化樣品中含有桑白皮甾醇。桑白皮純化樣品的GC-MS總離子流見圖9。

根據(jù)質(zhì)譜庫檢索，并由文獻[14]中的甾醇類化合物可知，純化樣品中甾醇類化合物有羊毛甾醇、谷甾醇、β-香樹脂醇和α-香樹脂醇，它們的匹配因子（MF，最大值為1 000）依次為769、894、875和895，保留時間依次為26.448、27.794、28.779、30.376min。

3 結(jié)論

1）通過桑白皮甾醇萃取工藝的單因素試驗可知，與正己烷相比，氯仿萃取使桑白皮甾醇得率提高了46.92%；萃取時間在5min～20min內(nèi)對甾醇得率的影響不顯著。以乙醇粗提液與氯仿體積比、乙醇粗提液與蒸餾水體積比為考查因素，以桑白皮甾醇得率為試驗指標，通過二因素三水平正交試驗優(yōu)化桑白皮甾醇萃取工藝。結(jié)果表明，乙醇粗提液與氯仿體積比為1∶1、乙醇粗提液與蒸餾水體積比為1∶1，此時桑白皮甾醇得率為（5.63±0.28）mg/g，在95%置信區(qū)間5.43mg/g～6.21mg/g范圍內(nèi)，實驗測定值與理論預(yù)測值基本吻合。

圖9 桑白皮純化樣品的GC-M S總離子流圖Fig.9 Totalion chromatogram sofpurified extraction sam ple

2）對桑白皮甾醇萃取液采用D-900、NKA-9、AB-8、D101、S-8 5種大孔吸附樹脂進行分離純化，結(jié)果顯示D-900大孔吸附樹脂的純化效果最好。對桑白皮甾醇萃取液采用10.0 g D-900大孔吸附樹脂、以流速0.25mL/min進行分離純化2次，桑白皮甾醇含量達（50.48±1.39）%。

3）采用薄層色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對桑白皮甾醇純化樣品進行定性分析。結(jié)果顯示，桑白皮甾醇乙醇溶液的比移值Rf為（48.17±2.79）%，β-谷甾醇標準品的Rf為（48.73±1.66）%，二者在薄層色譜薄板上同一位置有紫紅色斑點析出，表明純化樣品中含有桑白皮甾醇。采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法鑒定，桑白皮純化樣品含有羊毛甾醇、谷甾醇、β-香樹脂醇和α-香樹脂醇。

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Extraction and Purification Process of Plant Sterol from M ulberry Root Bark

XUYan-yang，CAISen-sen，ZHANGFan，LIYue-shan
（CollegeofBiologicaland Agricultural Engineering，Jilin University，Changchun 130022，Jilin，China）

In order to optimize extraction process of plant sterol from mulberry root bark，effects of type of extraction solvent，volume ratio of ethanol crude extract to distilled water，extraction time，volume ratio of ethanol crude extract to extraction solventon phytosterol extraction yield were investigated respectively.Then，optimization parameterswere discussed by two-factor three-level orthoganol testanalysis.Results showed that optimum extraction conditionswere as follows：volume ratio ofethanol crude extract to chloroform of 1∶1，and ethanol crude extract to distilled water of1∶1.Under these conditions，phytosterol extraction yield of（5.63± 0.28）mg/gwas obtained.By comparison of differentmacroporous adsorption resin on purification effects，D-900 type ofmacroporus resinwaschoosed aspurification columnmaterial.Extraction sampleused by chloroform solution，reached a sterol purity of（50.48±1.39）%，purifed by twice of column chromatography.Purified extraction samplewas qualititively analyzed by thin layer chromatography，Then purified extract and standard compound ofβ-sitosterolshowed a similarmaximum absorption peak at the same spots position on the thin layer chromatography plates.Lanosterol，sitosterol，β-amyrin andα-amyrin were identified in the purified exaction samplebyGasChromatography-Massspectrometry（GC-MS）.

mulberry root bark；plant sterol；extraction；resin；column chromatography；thin layer chro

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.05.008

2013-08-21

吉林大學基本科研業(yè)務(wù)費項目（450060487500）；吉林大學本科教學改革研究項目（2013138）；吉林省高等教育教學改革研究項目（2014138）

徐艷陽（1972—），女（漢），副教授，博士，研究方向：食品營養(yǎng)與安全。