基于GC/MS技術(shù)的小青龍湯證大鼠尿液代謝物的動態(tài)分析

趙小華，何麗清，蓋江華

（1.山西中醫(yī)學(xué)院，山西太原030024； 2.山西省長治市中醫(yī)院，山西長治046000）

基于GC/MS技術(shù)的小青龍湯證大鼠尿液代謝物的動態(tài)分析

趙小華1，何麗清1，蓋江華2

（1.山西中醫(yī)學(xué)院，山西太原030024； 2.山西省長治市中醫(yī)院，山西長治046000）

目的：采用GC-MS技術(shù)檢測造模及治療前后大鼠的尿液并進(jìn)行比較，尋找小青龍湯證的小分子標(biāo)記物。方法：隨機(jī)將36只雄性Wistar大鼠分為空白對照組10只、模型組和小青龍湯組各13只，在飼養(yǎng)1 w后，制作小青龍證模型。分別于造模前、造模后和灌藥后，即在第7天、第36天及第51天取大鼠尿液進(jìn)行GC/MS技術(shù)檢測。通過對尿液數(shù)據(jù)進(jìn)行PLS-DA分析，得到散點圖和載荷圖，結(jié)合NIST軟件譜庫及相關(guān)文獻(xiàn)，找到與小青龍湯證相關(guān)的小分子標(biāo)記物。結(jié)果：找出乳酸、甘氨酸、松醇、反丁烯二酸、脯氨酸、山梨醇、尿苷、琥珀酸、亞麻酸、丙氨酸等10個顯著性標(biāo)記物，這些標(biāo)記物在大鼠尿液動態(tài)觀察過程中發(fā)生了明顯的變化。結(jié)論：小青龍湯證的病理機(jī)制主要與能量代謝、機(jī)體免疫和炎癥反應(yīng)三方面相關(guān)。標(biāo)記物為小青龍湯證本質(zhì)的研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

氣相色譜質(zhì)譜；尿液；小青龍湯證

目前代謝組學(xué)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于中醫(yī)藥領(lǐng)域，氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC/MS）更是被廣泛應(yīng)用。GC/ MS源于具有比較標(biāo)準(zhǔn)的代謝物圖譜庫，且方便解析圖譜［1］。這些為本課題的研究提供了基礎(chǔ)。本課題主要是應(yīng)用GC/MS技術(shù)動態(tài)考察大鼠在不同時間段整體內(nèi)源性代謝物的變化軌跡，找出具有顯著性的標(biāo)記物，并且對其主要標(biāo)記物進(jìn)行多元統(tǒng)計分析，找到小青龍湯證本質(zhì)的標(biāo)記物，為小青龍湯證的研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗儀器 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC/MS），真空干燥箱DZF-1B型（上海躍進(jìn)醫(yī)療醫(yī)械廠），高速臺式冷凍離心機(jī)TGL-6（長沙湘儀離心機(jī)有限公司），數(shù)控超聲儀KQ2200型（昆山超聲儀器有限公司），電子天平ESJ120-4（沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司）。

1.1.2 實驗試劑 MSTFA［N-甲基-N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺］，含1%TMCS（三甲基氯硅烷），購自美國Thermo pierce公司；吡啶、甲氧胺鹽酸鹽、正庚烷、乙腈均為分析純，購自北京化工試劑公司；二十四烷購自上海索萊寶生物科技有限公司。內(nèi)標(biāo)液的配制：精密稱取1 mg二十四烷，置于10 mL的容量瓶中，加入甲醇溶解定容，即得濃度為內(nèi)含0.1 mg/mL二十四烷的內(nèi)標(biāo)工作液。

1.2 實驗方法

具體造模與取樣方法參照文獻(xiàn)［2］，雄性Wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為空白對照組10只、模型組和小青龍湯組各13只，制作小青龍湯證（外寒內(nèi)飲）模型，將模型組和小青龍湯組大鼠放置于寒冷環(huán)境（控制室內(nèi)溫度在10℃左右）中喂養(yǎng)，每天在低溫環(huán)境下［（0±4）℃左右］冷凍1 h，并將大鼠放入冰水中游泳，水面淹沒大鼠鼻尖時將大鼠撈出，同時進(jìn)寒涼飲食（冷凍飼料及冰水），持續(xù)4 w?？瞻讓φ战M不做任何處理。

4 w后，小青龍湯組大鼠按7.7 g/kg體重（相當(dāng)于成人用量的7倍）灌服小青龍湯，連續(xù)用藥15 d。同時，空白對照組和模型組大鼠灌服等容量蒸餾水。

1.2.1 生物樣品制備 尿液：解凍樣品，取上清液200 μL加入30 U尿素酶，37℃孵育15 min。600 μL甲醇，4℃10 000 g條件下離心10 min，取上清液300 μL，30℃真空干燥12 h。加入30 μL（15 mg/mL）甲氧胺吡啶溶液，70℃反應(yīng)1 h。加入50 μL MSTFA，40℃反應(yīng)90 min。加入1 200 μL內(nèi)標(biāo)工作液，渦旋。1.2.2 GC-MS條件 進(jìn)樣量1 μL；進(jìn)樣口溫度260℃，離子源溫度200℃；載氣：氦氣；載氣流速：1 mL/min；DB-5MS毛細(xì)管柱，不分流進(jìn)樣。質(zhì)譜檢測條件：電離方式EI，電子能量70 eV；質(zhì)譜掃描范圍：全掃描模式，50～650m/z。程序升溫條件：60℃，3min；7℃/min，140℃，4 min；5℃/min，180℃，6 min；5℃/min，280℃，2 min。1.2.3 模式識別分析 運(yùn)用SIMCA-P+軟件進(jìn)行有監(jiān)督的模式識別方法，即偏最小二乘法判別分析（PLS-DA），得出散點圖和載荷圖。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

通過SPSS17.0軟件對載荷圖遠(yuǎn)端物質(zhì)進(jìn)行分析，組間配對采用t檢驗，得到顯著性標(biāo)記物，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，以P＜0.05或P＜0.01為判斷差異存在統(tǒng)計學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。再結(jié)合VIP值（生物標(biāo)記物的VIP值＞1，具有意義），最終得到小青龍湯組有10個代謝物在服用小青龍湯前后差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。模型組在成功造模后，在小青龍湯組灌藥同時，給予蒸餾水，考察隨時間變化模型組代謝物的變化。

2 結(jié) 果

2.1 代謝物的鑒定

通過NIST軟件數(shù)據(jù)庫，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)［3-10］，鑒定了空白對照組（飼養(yǎng)第7天）大鼠尿液37個代謝物，結(jié)果見表1。

表1 空白對照組大鼠尿液代謝物

2.2 多元統(tǒng)計

2.2.1 模型組與小青龍湯組尿液3個不同時間段的多元統(tǒng)計分析 分別在飼養(yǎng)的第7天、第36天（即造模后）、第51天（即治療后）取得模型組及小青龍湯組大鼠尿液的GC-MS數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所得小青龍湯組與模型組得分散點圖、載荷圖，分別見圖1、圖2；所得小青龍湯組與模型組得分直線圖，分別見圖3、圖4。

圖1 小青龍湯組得分散點圖、載荷圖

由圖1可見，第36天（造模后）小青龍湯組大鼠尿液的代謝狀態(tài)明顯偏離第7天（造模前），說明大鼠機(jī)體內(nèi)代謝物發(fā)生明顯變化，進(jìn)一步說明了造模成功。而在服用15 d小青龍湯后，第51天大鼠代謝物明顯靠近造模前的代謝狀態(tài)。

圖2 模型組得分散點圖、載荷圖

由圖2可見，模型組第36天、第51天的大鼠尿液代謝物軌跡與第7天分布在t［1］軸兩側(cè)。

圖3 模型組得分直線圖

圖4 小青龍湯組得分直線圖

由圖3可明顯看出，模型組大鼠造模前后體內(nèi)代謝物發(fā)生變化，與第36天比較，第51天部分樣本有靠近第7天健康大鼠的趨勢，說明二者部分代謝物可能存在差異。由圖4可明顯看出造模后（第36天）的尿液樣本與造模之前（第7天）比較代謝物發(fā)生變化，在服用藥物15 d后（即第51天）尿液樣本較造模后明顯恢復(fù)，代謝物變化靠近造模前。

2.2.2 3次不同時間段尿液的兩兩比較 運(yùn)用多元統(tǒng)計，分別對小青龍湯組第51天與第7天尿液、第51天與第36天尿液，模型組第51天與第7天尿液、第51天與第36天尿液的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析比較，得到得分圖，見圖5、圖6。

圖5 小青龍湯組尿液代謝物比較得分圖

圖6 模型組尿液代謝物比較得分圖

2.2.3 不同時間段代謝物比較 模型組第51天與第7天比較，乳酸、亞麻酸仍較高（P＜0.05），但是較第36天降低（P＜0.01）；其他代謝物第36天與第7天比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；第51天與第36天比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。小青龍湯組第51天與第7天比較乳酸、亞麻酸仍然較高（P＜0.05），但是與36天比較明顯下降（P＜0.01）；松醇、甘氨酸、檸檬酸、尿苷、脯氨酸、琥珀酸第51天明顯高于第36天，山梨醇、反丁烯二酸明顯低于第36天（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

3 分析與討論

表2 模型組與小青龍湯組大鼠尿液代謝物不同時間段比較 （x±s）

模型組大鼠第36天尿液中松醇濃度較第7天明顯降低，說明機(jī)體內(nèi)存在炎癥，這一結(jié)果與現(xiàn)代哮喘炎癥反應(yīng)研究相符。有文獻(xiàn)報道，松醇對于哮喘有一定的治療作用［11-12］，且具有抗炎作用［13］。在服用小青龍湯后，第51天松醇濃度明顯升高，接近于造模前的代謝狀態(tài)，說明小青龍湯證病理機(jī)制與炎癥反應(yīng)相關(guān)。模型組大鼠第36天亞麻酸濃度明顯高于第51天與第7天，更加說明了機(jī)體內(nèi)炎癥的存在。小青龍湯組大鼠第51天亞麻酸濃度與第36天比較顯著下降，說明在服用藥物后機(jī)體能量得到恢復(fù)，抵抗力提高，使得機(jī)體的哮喘癥狀得到緩解，精神好轉(zhuǎn)，食欲增加。亞麻酸是一種必須脂肪酸，具有提高免疫力等功效［14-15］，作為n-3類不飽和脂肪酸能夠與短鏈脂肪酸共同作用于機(jī)體，降低炎癥反應(yīng)［16］。與第51天、第7天比較，模型組大鼠第36天檸檬酸、順烏頭酸、戊二酸、琥珀酸、蘋果酸濃度明顯下降，說明三羧酸循環(huán)出現(xiàn)異常，機(jī)體出現(xiàn)能量代謝障礙，進(jìn)而大鼠因機(jī)體能量不足出現(xiàn)倦怠、反應(yīng)遲鈍等表現(xiàn)。山梨醇大部分經(jīng)腎臟排除，模型組大鼠第36天尿液中山梨醇增加明顯，說明出現(xiàn)水液代謝障礙，腎功能不全，進(jìn)而說明全身可能存在三焦水道不通，解釋了大鼠大小便異常、四肢腫等癥狀。研究結(jié)果表明大鼠在服用藥物15 d后，機(jī)體代謝物發(fā)生明顯變化，有積極恢復(fù)到健康狀態(tài)的趨勢。主要表現(xiàn)為能量代謝、機(jī)體免疫和炎癥反應(yīng)三方面。松醇、亞麻酸、反丁烯二酸在第7天、第36天、第51天的濃度變化，機(jī)制可能主要是機(jī)體本身存在水飲，水液代謝障礙，又感受外邪，寒邪侵襲，機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)，降低了免疫力，寒邪上先犯肺，一系列哮喘癥狀大量消耗了機(jī)體能量，三羧酸循環(huán)出現(xiàn)異常，機(jī)體表現(xiàn)能量代謝障礙，抵抗外邪能力降低，出現(xiàn)“外寒內(nèi)飲”證。

采用基于GC/MS代謝組學(xué)方法考察大鼠不同時間段的尿液，得到代謝指紋圖譜，分析結(jié)果顯示，小青龍湯組在服用藥物后代謝物發(fā)生明顯變化，與造模后第36天發(fā)生明顯偏離，代謝物軌跡明顯靠近第7天造模前的代謝狀態(tài)，有明顯恢復(fù)趨勢，說明小青龍湯的治療效果是明顯的。隨著時間變化，動態(tài)觀察模型組代謝物的變化，第51天與第36天的代謝物發(fā)生變化，說明可能存在機(jī)體免疫恢復(fù)的情況。

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（編輯：梁葆朱）

A dynamic analysis of the rats urine metabolites of Xiaoqinglong decoction syndrome based on GC/MS

Zhao Xiaohua1，He Liqing1，Gai Jianghua2
（1.Shanxi College of TCM，Taiyuan Shanxi 030024；2.Changzhi City TCM Hospital，Changzhi Shanxi 046000）

Objective：Small molecular markers of Xiaoqinglong decoction syndrom were searched before and after modling and treatment through detecting consentration of metabolites in urine of rats by GC/MS.Methods：36 male Wistar rats were randomly divided into the blank control group with 10 rats，model group and Xiaoqinglong decoction group with 13 rats in each group.1 w after feeding，model rats of Xiaoqinglong decoction syndrom were made.At the 7thdays、the 36thdays and the 51stdays after feeding，urine of rats were respectively colleted and analyzed by PLS-DA，then molecular markers related to Xiaoqinglong decoction syndrome were found out through NIST library software spectrum and related literature.Results：10 kinds of significant molecular markers were found out，which were lactic acid，glycine，pinitol，fumaric acid，proline，sorbitol，uridine，succinic acid，linolenic acid，alanine.The consentration of these markers in the urine of rats changed in the process of dynamic observation.Conclusion：Xiaoqinglong decoction syndrome mainly relates to energy metabolism，the body's immune and inflammatory response.The study laid a solid material foundation for research on essence of Xiaoqinglong decoction syndrome.

GC/MS；urine；Xiaoqinglong decoction syndrome

R285.5

A

1671-0258（2015）01-0015-04

國家自然科學(xué)基金資助項目（81102538）；山西中醫(yī)學(xué)院臨床基礎(chǔ)項目（2011JC05）

趙小華，在讀碩士，E-mail：1179726326@qq.com

何麗清，教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：hlqyx@163.com