TTC-脫氫酶還原法測定螺旋藻細胞活性的條件優(yōu)化

李 迷， 王素英， 董世瑞， 汪群梅， 吳躍梅， 侯惠靜

(天津商業(yè)大學生物技術(shù)與食品科學學院 天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津 300134)

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TTC-脫氫酶還原法測定螺旋藻細胞活性的條件優(yōu)化

李 迷， 王素英*， 董世瑞， 汪群梅， 吳躍梅， 侯惠靜

(天津商業(yè)大學生物技術(shù)與食品科學學院 天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津 300134)

為確定氯化三苯基四氮唑(TTC)-脫氫酶還原法測定螺旋藻細胞活性的最優(yōu)條件，首先通過單因素實驗對影響藻細胞活性測定的TTC質(zhì)量分數(shù)、緩沖液pH、提取劑(乙醇)體積分數(shù)、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度進行分析，選定各因素的變化范圍，再利用正交試驗設(shè)計方法，在藻細胞活性測定的最適培養(yǎng)溫度下，對TTC質(zhì)量分數(shù)、緩沖液pH、提取劑體積分數(shù)、培養(yǎng)時間進行3水平優(yōu)化試驗。最后確定優(yōu)化的TTC-脫氫酶還原法測定螺旋藻細胞活性的條件為TTC質(zhì)量分數(shù)0.1%、緩沖液pH 8.0～8.5、乙醇體積分數(shù)60%、培養(yǎng)時間5 h、培養(yǎng)溫度35 ℃。在此條件下所測藻細胞活性最高，為螺旋藻細胞活性的評價提供了一定參考。

螺旋藻；細胞活性檢測；氯化三苯基四氮唑(TTC)；脫氫酶

藻種保藏是螺旋藻研究和規(guī)模化養(yǎng)殖的重要環(huán)節(jié)，細胞活性是評價各種保藏方法的關(guān)鍵指標。已有的研究表明，藻種細胞活性的測定有間接法和直接法，其中間接法包括藻細胞密度、含藻水中溶解氧含量、葉綠素含量、光密度值等指標的測定[1-3]；直接法是對藻進行再培養(yǎng)，根據(jù)再培養(yǎng)時藻體的生長狀態(tài)判斷細胞的活性。間接法不能對細胞的活性進行直接判斷，結(jié)果存在一定誤差，而直接法消耗的時間較長。為了尋找靈敏、快速、簡便的藻細胞活性直接檢測手段，本課題組在螺旋藻藻株保藏方法研究中，借鑒已在生物學研究中廣泛應(yīng)用的脫氫酶活性檢測法——氯化三苯基四氮唑(TTC)法對藻細胞活性進行檢測。該方法能夠反映生物體的細胞活性，常用于植物種子或根莖的細胞活力測定[4-7]、活性污泥的活性監(jiān)測[8-9]、動物細胞及細菌活性的測定[10-13]。在藻細胞活性測定方面，Chang等[14]用TTC-脫氫酶還原法測定了大型海藻帶石莼(Ulvafasciata)在不同鹽度環(huán)境下的活性狀況。Nam等[15]將TTC法應(yīng)用于測定海藻細胞活性。梁文艷等[16]發(fā)現(xiàn)TTC-脫氫酶活性測定法可用于銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)活性檢測，并能很好地進行定量測定。解軍[17]對藻類TTC-脫氫酶活性檢測法的研究表明，該法可很好地應(yīng)用于實際水樣中藻含量的測定及殺藻處理后的活體藻的檢測。但是，不同生物體利用TTC作為氫受體的能力不同，因此反應(yīng)的最佳條件也有所不同。本文擬對影響TTC-脫氫酶還原法測定螺旋藻細胞活性的條件進行優(yōu)化，旨在尋找簡便、省時、規(guī)范的螺旋藻細胞活性評價方法，為螺旋藻的相關(guān)研究和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻種 鹽澤螺旋藻(Spirulinasubsalsa),購自中國科學院武漢水生植物研究所，編號為FACHB351。

1.1.2 培養(yǎng)基 改進的Zarrouk培養(yǎng)基(AB培養(yǎng)基)，1 L AB培養(yǎng)基包括993 mL (A、B、C)、6 mL PIV、1 mL A5。其中A: NaHCO313.61 g，Na2CO34.03 g，KH2PO40.5 g，NaNO32.5 g；B:K2SO41 g，NaCl 1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g；C:CaCl2·2H2O 0.04 g;PIV (g/L): C10H16N2Na2O80.75，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.097，MnCl2·4H2O 0.041，ZnCl20.005，CoCl2·6H2O 0.002，Na2MoO4·2H2O 0.004；A5 (g/L):H3BO32.86，NaCl·4H2O 1.81，Na2CO30.22，MnSO4·7H2O 2.5，CuSO4·5H2O 0.007 4， Na2MoO40.002 1。將A、B、C、PIV、A5分別濕熱滅菌(121 ℃,20 min)，待冷卻后混勻使用。

1.1.3 主要試劑及配制 0.2%TTC溶液的配制：稱取0.2 g TTC溶于100 mL Tris-HCl(pH 7.5)緩沖溶液中，避光保存。氫氧化鈉、乙醇、正己烷均為分析純。

1.1.4 儀器 PHSJ-5型酸度計(上海雷磁儀器廠)，Neofuge 18R臺式高速冷凍離心機(香港力康發(fā)展有限公司)，單列六孔電熱恒溫水浴鍋(天津市中環(huán)實驗電爐有限公司)，U-5100分光光度計(日本 Hitachi 公司)。

1.2 方法

取4 mL藻液(細胞密度約為2×105個/mL)于10 mL離心管中，10 000 r/min離心20 min，去除培養(yǎng)基后用蒸餾水清洗2次，加入5 mL 0.2% TTC，置于35 ℃恒溫水浴，暗處發(fā)色培養(yǎng)8 h后10 000 r/min離心20 min獲得藻泥，并用蒸餾水清洗2次后于沉淀中加入5 mL體積分數(shù)為50%的乙醇溶液(含0.01 mol/L NaOH)，室溫放置30 min后，加入3 mL正己烷震蕩2～3 min進行三苯基甲臢(TPF)的萃取。穩(wěn)定數(shù)分鐘后測定正己烷萃取液在485 nm處的吸光度值，所有試驗均重復(fù)3次。

1.2.1 單因素實驗 在保持其他因子不變的條件下，變化單一因子，研究TTC質(zhì)量分數(shù)(0%、0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%)、緩沖液pH (6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0)、提取劑(乙醇)體積分數(shù)(0%、20%、40%、60%、80%、100%)、培養(yǎng)溫度(20、25、30、35、40、45和50 ℃)和培養(yǎng)時間(0、2、4、6、8、10和12 h)對藻細胞脫氫酶活性測定的影響。

1.2.2 正交試驗設(shè)計 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，在藻細胞活性測定的最適培養(yǎng)溫度下，選擇TTC質(zhì)量分數(shù)、緩沖液pH、提取劑體積分數(shù)和培養(yǎng)時間為考察因素，以單因素實驗結(jié)果獲得的各因素適宜范圍作為參考依據(jù)，每個因素各取3個水平，以485 nm處吸光度值作為篩選酶活性測定條件的指標，按L9(34)正交試驗表進行實驗設(shè)計，每個處理重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果與分析

2.1.1 TTC質(zhì)量分數(shù)對酶活性測定的影響 用不同質(zhì)量分數(shù)的TTC溶液進行脫氫酶活性的測定(圖1)，結(jié)果表明TTC質(zhì)量分數(shù)為0.2%時吸光度最大，達到1.43；低于0.2%時，因TTC氫受體不足，生成的TPF較少，吸光度較低；當TTC質(zhì)量分數(shù)大于0.2%時，TPF的生成量隨著TTC質(zhì)量分數(shù)的增加逐漸減少，這是由于TTC對細胞存在一定的毒性，過高的TTC質(zhì)量分數(shù)會抑制酶活性，使反應(yīng)終止。通過單因素方差分析，發(fā)現(xiàn)0%與1.0% TTC對脫氫酶活性測定的影響無顯著差異(P>0.05)，說明TTC質(zhì)量分數(shù)為1.0%時由于其對細胞的毒性，致使脫氫酶反應(yīng)幾乎沒有發(fā)生。

圖1 TTC質(zhì)量分數(shù)對酶活性測定的影響

2.1.2 緩沖液pH對酶活性測定的影響 pH值可改變底物的帶電狀態(tài)，從而影響底物分子與酶的結(jié)合。 由圖2可知，TTC作為人工氫受體，當反應(yīng)體系的pH值小于7. 5時，很難被細胞呼吸過程中產(chǎn)生的氫原子還原生成TPF；pH大于7.0時， TPF的生成量明顯增加，當pH值大于8.0時，TTC-脫氫酶還原反應(yīng)開始受到抑制，吸光度值呈下降趨勢。對緩沖液pH進行單因素方差分析，并對其進行多重比較，pH 6.0與pH 6.5對酶活性測定的影響無顯著差異(P>0.05)，其他不同pH的緩沖液對酶活性測定的影響均存在顯著差異(P<0.01)，說明當緩沖液pH介于6.5～8.0時，隨著pH值的增加，脫氫酶活性顯著增加，超過8.0后，脫氫酶活性則明顯下降。

圖2 緩沖液pH對酶活性測定的影響Fig.2 Effect of buffer solution pH on viability detection

2.1.3 提取劑(乙醇)體積分數(shù)對酶活性測定的影響 TTC-脫氫酶還原反應(yīng)生成的TPF由于不溶于水溶液而沉積在細胞中，需要用有機溶液提取后測定。實驗選擇不同體積分數(shù)的乙醇進行了提取效率的比較，結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，乙醇的體積分數(shù)低于50%時提取效率較低，當高于50%后提取效率明顯增大。100%的乙醇由于與正己烷完全互溶，從而使吸光度值下降。通過單因素方差分析，可知50%與60%的乙醇對酶活性測定的影響無顯著差異(P>0.05)，略低于80%乙醇的提取效率，考慮到增加乙醇體積分數(shù)會增大藻細胞中其他色素的干擾，故正交試驗中提取劑體積分數(shù)設(shè)為50%、55%、60%。

圖3 提取劑體積分數(shù)對酶活性測定的影響

2.1.4 培養(yǎng)時間對酶活性測定的影響 根據(jù)酶活性的測定原則，培養(yǎng)時間應(yīng)盡量短些，以避免因基質(zhì)濃度下降、產(chǎn)物的形成以及酶的變性所帶來的不良影響。但培養(yǎng)時間過短會使酶促反應(yīng)生成的被檢測物質(zhì)的量太少，難以定量檢測，因此應(yīng)選擇適宜的培養(yǎng)時間。由圖4可知，當培養(yǎng)時間為4 h時，TPF的生成量最大，此時吸光度值達到1.38；隨著培養(yǎng)時間的繼續(xù)延長，吸光度小幅下降，但趨于平衡，說明生成的TPF比較穩(wěn)定，在一定的時間內(nèi)不會被空氣中的氧氧化而褪色。對培養(yǎng)時間進行單因素方差分析，可知培養(yǎng)時間為4 h和6 h時脫氫酶活性無顯著差異(P>0.05)，但培養(yǎng)時間4 h與8、10、12 h的脫氫酶活性存在顯著差異(P<0.01)，所以培養(yǎng)時間應(yīng)控制在4～6 h。

圖4 培養(yǎng)時間對酶活性測定的影響

2.1.5 培養(yǎng)溫度對酶活性測定的影響 酶的催化作用，只有在一定溫度下才能表現(xiàn)出來。通常酶的作用速度隨溫度升高而加速，但溫度升高到一定限度后，酶的活性就要鈍化，直至完全失活。由圖5可看出，脫氫酶反應(yīng)在發(fā)色培養(yǎng)溫度為35 ℃時吸光度最大(為1.37)，隨后隨著溫度的上升吸光度值逐漸降低。此溫度也與螺旋藻的最適生長溫度一致。對培養(yǎng)溫度進行單因素方差分析，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)溫度為20、25與40 ℃時的脫氫酶活性無顯著差異(P>0.05)，且明顯低于培養(yǎng)溫度為35 ℃時的脫氫酶活性(P<0.01)，所以脫氫酶反應(yīng)的最適溫度為35 ℃。

圖5 培養(yǎng)溫度對酶活性測定的影響

2.2 正交試驗結(jié)果

由單因素實驗可知脫氫酶反應(yīng)的最適溫度為35 ℃，且大量的研究表明Spirulina subsalsa的最佳生長溫度為35～38 ℃，考慮到在螺旋藻的最適生長溫度下細胞內(nèi)脫氫酶活性也最高，因此本研究在固定發(fā)色培養(yǎng)溫度為35 ℃的前提下，考察TTC質(zhì)量分數(shù)、緩沖液pH值、提取劑體積分數(shù)和培養(yǎng)時間的相互作用對TTC-脫氫酶法測定藻細胞活性的影響，以獲得各種條件的最優(yōu)組合。因素水平見表1。

極差R反映了影響因素對反應(yīng)體系的影響，R越大，影響越顯著。由表2直觀分析可知，各因素水平的變化對TTC-脫氫酶還原法測定螺旋藻細胞活性影響的次序由大到小依次為TTC質(zhì)量分數(shù)、培養(yǎng)時間、緩沖液pH、提取劑體積分數(shù)。由表3方差分析可知因素A、B、C、D對酶活性的測定均有極顯著影響(P<0.01)。對4個因素進行多重比較，并結(jié)合直觀效應(yīng)分析可知，TTC質(zhì)量分數(shù)0.1%、0.2%、0.3%存在極顯著差異(P<0.01)，且酶活性由高到低為0.1%、0.2%、0.3%，故TTC質(zhì)量分數(shù)的最優(yōu)水平選擇0.1%；在緩沖液pH為8.0和8.5時，脫氫酶活性明顯高于pH 7.5(P<0.01)，但前兩者差異不顯著(P>0.05)，說明脫氫酶活性測定時緩沖液的最適pH為8.0～8.5；提取劑體積分數(shù)為60%時，酶活性明顯高于50%、55%(P<0.01)，而后兩者酶活性差異不顯著(P>0.05)，所以提取劑體積分數(shù)以60%為宜；培養(yǎng)時間為5 h時酶活性明顯高于3 h與4 h(P<0.01)，其中培養(yǎng)時間為3 h、4 h時酶活性差異不顯著(P>0.05)，因此培養(yǎng)時間選擇5 h。

表1 正交試驗因素水平表

表2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果分析

表3 正交設(shè)計方差分析表

注：F0.95(2,18)=3.55,F0.99(2,18)=6.01,**表示存在極顯著性差異

3 討 論

通過單因素和正交試驗，在脫氫酶反應(yīng)的最適培養(yǎng)溫度35 ℃條件下，TTC-脫氫酶還原法測定藻細胞活性的最優(yōu)條件組合為TTC質(zhì)量分數(shù)0.1%、緩沖液pH 8.0～8.5、提取劑(乙醇)體積分數(shù)60%、培養(yǎng)時間5 h。為螺旋藻細胞活性的評價提供了一種省時、操作簡單、現(xiàn)象直觀的方法。但在實驗中也發(fā)現(xiàn)，通過不同方法保藏的Spirulinasubsalsa在細胞活性較低時，TPF生成量較少，被乙醇提取的細胞色素所占的比例增加，因而對測定結(jié)果產(chǎn)生較大的影響，因此實驗參考了梁文艷等[18]的研究結(jié)論，即采用含0.001～0.01 mol/L NaOH的乙醇提取TPF后，再用正己烷進行萃取，這樣可在一定程度上去除細胞色素的干擾，但要使TTC-脫氫酶法更準確反映細胞活力的大小，作為評價螺旋藻保藏方法的唯一依據(jù)，還需要對測定的前處理過程進行進一步的實驗研究。

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Condition Optimization of TTC-Dehydrogenase Reduction Method To DetermineSpirulinaCell Activity

LI Mi, WANG Su-ying, DONG Shi-rui, WANG Qun-mei, WU Yue-mei, HOU Hui-jing

(Coll.ofBio-Technol&FoodSci.,TianjinUni.ofCommerce,TianjinKeyLab.ofFoodBio-Technol.,Tianjin300134)

In order to determine the optimal conditions of 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (TTC)-dehydr-ogenase reduction method onSpirulinacell activity (SCA), the variable range of TTC mass fraction, pH of buffer solution, volume fraction of extractant (ethanol), incubation temperature and time that affected SCA were analyzed using single factor experiment. Then under the most suitable incubation temperature of the determination of SCA, the optimal conditions of TTC-dehydrogenase assay on SCA activity including the mass fraction of the TTC, pH of buffer solution, volume fraction of extractant content and incubation time were obtained by orthogonal experiment. The optimized conditions of TTC-dehydrogenase reduction method to determine SCA were finally confirmed that TTC mass fraction at 0.1%, pH of buffer at 8.0～8.5, the volume fraction of ethanol at 60%, incubated for 5 h at 35 ℃. Under this condition the SCA reached the highest. The experiment results provided a certain theoretical basis for evaluating SCA.

Spirulina; cell activity detection; 2,3,5-triphenyl tetrazolium Chloride (TTC); dehydrogenase

國家自然科學基金項目(31270050)；天津市高等學校創(chuàng)新團隊項目(TD12-5049)

李迷 女，碩士研究生。研究方向為微生物資源。E-mail:limi512@163.com

* 通訊作者。女，教授，博士。研究方向為微生物資源開發(fā)與利用。E-mail:wsying@tjcu.edu.cn

2014-12-18；

2015-01-15

Q949.22

A

1005-7021(2015)06-0033-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.06.006