食品中檸檬酸快速檢測試劑盒的研制

常平平，郝艷紅，周遵武，萬宇平*，劉 薇，錢 瑞，沈國棟

（1.北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京102206；2.山東春雪食品有限公司，山東萊陽265200）

食品中檸檬酸快速檢測試劑盒的研制

常平平1，郝艷紅1，周遵武2，萬宇平1*，劉 薇1，錢 瑞1，沈國棟1

（1.北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京102206；2.山東春雪食品有限公司，山東萊陽265200）

建立了一種酶法檢測食品中檸檬酸含量的快速檢測方法。將6 U L-蘋果酸脫氫酶、9.13 U L-乳酸脫氫酶、0.5 mg煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、2 mg硫酸鎂、3.783 mg海藻糖、5 mg聚乙二醇6000在0.2 mL 0.082 g/m L雙甘肽質(zhì)量濃度下-60℃冷凍5 h，室溫條件下抽真空18 h得到試劑Ⅰ，0.468 U檸檬酸裂解酶在0.2 m L水體系冷凍干燥得到試劑Ⅱ。結(jié)果表明，該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2=0.995，線性范圍1～80 μg/L；靈敏度0.25 mg/L；檢測限0.5 mg/L；各樣品回收率均在90%～110%。該試劑盒方法可以在20 m in實(shí)現(xiàn)樣品中檸檬酸的快速檢測，方法靈敏度高、特異性高、快速簡便，適合于食品生產(chǎn)企業(yè)對食品中的檸檬酸進(jìn)行快速檢測及對食品的質(zhì)量和品質(zhì)進(jìn)行評價。

食品；檸檬酸；快速檢測試劑盒；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸

在食品生產(chǎn)過程中往往需要添加防腐劑、甜味劑、抗氧化劑、保鮮劑、人工合成色素等化學(xué)物質(zhì)，它們的含量過高會對人體健康造成不利影響[1]。檸檬酸是有機(jī)酸中的第一大酸，由于其物理性能、化學(xué)性能、衍生物的性能，被廣泛應(yīng)用于一些食品加工領(lǐng)域。檸檬酸的含量對食品的味道有很大影響，并且是某些食品品質(zhì)的一項重要檢測指標(biāo)，因此食品中檸檬酸的定性與定量分析對食品營養(yǎng)的研究意義重大，而且在食品生產(chǎn)過程的質(zhì)量管理中也必不可少。目前，測定檸檬酸的方法有高效液相色譜法[2]、反相高效液相色譜法[3]、離子色譜法[4]、氣相色譜法[5]、毛細(xì)管電泳法[6-7]、微分電位溶出法[8]、阻抑動力學(xué)法[8]等。高效液相色譜法靈敏度較高，但是樣品前處理操作繁瑣，測定周期長、實(shí)驗(yàn)成本高。離子色譜法由于淋洗液和柱填料的特殊性，對樣品中蛋白質(zhì)含量有嚴(yán)格限定，不適合做復(fù)雜的樣品分析，而且柱子的容量小，進(jìn)樣量不宜太多。因此，對于含有復(fù)雜成分的食品，不適合用此方法檢測檸檬酸的含量。氣相色譜法由于不宜揮發(fā)或熱不穩(wěn)定的酸類在進(jìn)樣之前往往需要進(jìn)行衍生化反應(yīng)，導(dǎo)致樣品的前處理比較困難且費(fèi)時，成為氣相色譜檢測有機(jī)酸的瓶頸所在。毛細(xì)管電泳在靈敏度和重現(xiàn)性方面存在不足。酶法測定果汁中檸檬酸含量具有靈敏度高、專一性強(qiáng)、快速簡便的優(yōu)點(diǎn)，酶法測定食品中檸檬酸的原理是：檸檬酸在酶的作用下裂解，其裂解產(chǎn)物通過還原型輔酶Ⅰ，即煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）被還原，然后通過測定吸光度值的降低來測量NADH的消耗量，即相當(dāng)于檸檬酸的量。該方法不僅適用于果汁產(chǎn)品，還可以用于其他多種食品中檸檬酸含量的測定[10-11]。本實(shí)驗(yàn)采用酶法測定果汁、茶飲料、水果、奶酪、啤酒、食用油等食品中檸檬酸的含量，并將NADH、L-蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase，L-MDH）、L-乳酸脫2氫酶（L-lactic dehydrogenase，L-LDH）及相應(yīng)的凍干保護(hù)劑凍干作為試劑Ⅰ，將檸檬酸裂解酶（citrate lyase，CL）及相應(yīng)的保護(hù)劑凍干作為試劑Ⅱ進(jìn)行試驗(yàn)。凍干是復(fù)雜的相變過程，凍干制品在整個過程存在的各種應(yīng)力，包括低溫應(yīng)力、凍結(jié)應(yīng)力、干燥應(yīng)力等，常常是直接或間接導(dǎo)致制品中蛋白質(zhì)變性的因素，所以在凍干過程中需使用保護(hù)劑。凍干保護(hù)劑一般可分為多羥基化合物、糖、氨基酸、蛋白質(zhì)、聚合物和無機(jī)鹽等[12]，不僅要具有保護(hù)制品生物學(xué)活性的效果，而且要具有凍干賦形作用[13]，保護(hù)劑可改變生物樣品冷凍干燥時的物理、化學(xué)環(huán)境，減輕或防止冷凍干燥或復(fù)水對細(xì)胞的損害，盡可能保持原有的各種生理生化特性和生物活性[14-15]。本實(shí)驗(yàn)建立了一種食品中檸檬酸的快速檢測方法，該方法對樣品的前處理簡單，靈敏度高、特異性高、檢測時間短，適合于食品生產(chǎn)企業(yè)對食品中的檸檬酸進(jìn)行檢測及對食品的質(zhì)量和品質(zhì)進(jìn)行評價。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

純果樂、茉莉蜜茶、紅茶、綠茶、橘子、橙子、固體奶酪、青島啤酒、魯花花生油均購自超市。檸檬酸脫氫酶（C0897-100 UN）、L-蘋果酸脫氫酶（M 1567-5 kU）、L-乳酸脫氫酶（L-2625-2.5 kU）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（N2630-50 mg）、雙甘肽（G1002-25 g）、谷胱甘肽（G2299-100 g）、半胱氨酸（純度97%）：美國Sigma公司；檸檬酸、七水硫酸鎂、海藻糖、聚乙二醇2000、聚乙二醇6000、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀、鹽酸、咪唑、三羥甲基氨基甲烷、甘油、乙二胺四乙酸二鈉、L-酒石酸、甘露醇、硫酸銨、三氯乙酸和β-巰基乙醇均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UVmini-1240紫外分光光度計：島津企業(yè)管理（中國）有限公司；QL-901渦旋儀：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；LGJ-18A冷凍干燥機(jī)：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；XP205分析天平：梅特勒-托利多國際股份有限公司；SpS2001F電子天平：龍騰電子有限公司；PHS-3E pH計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 凍干方式

各試劑單獨(dú)凍干保護(hù)劑的篩選：分類別進(jìn)行凍干保護(hù)劑篩選，多羥基化合物（甘露醇、酒石酸）、糖類（蔗糖、海藻糖、葡萄糖）、氨基酸（谷胱甘肽、半胱氨酸）、聚合物（聚乙二醇2000、聚乙二醇6000），調(diào)整保護(hù)劑的濃度對NADH、L-MDH、L-LDH、CL分別進(jìn)行凍干。凍干前均進(jìn)行可行性驗(yàn)證，所加保護(hù)劑不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的條件下進(jìn)行凍干實(shí)驗(yàn)，凍干取出后即進(jìn)行吸光度值測定，并進(jìn)行保存性跟蹤。

試劑混合凍干保護(hù)劑及凍干體系的篩選：將NADH和L-LDH混合、NADH、L-MDH和L-LDH混合進(jìn)行凍干，篩選凍干保護(hù)劑及凍干體系。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

在5個10 m L的容量瓶中，分別準(zhǔn)確的加入0.40 m g/m L檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.10 m L、0.20 m L、0.50 m L、1.00 m L，用蒸餾水定容至刻度，混勻放置10 min。分別取各標(biāo)準(zhǔn)溶液0.20 m L，加入1.80 m L純水，1 m L用水復(fù)溶的試劑Ⅰ，同時做一組空白實(shí)驗(yàn)，即取2.00 m L純水、1 m L用水復(fù)溶的試劑Ⅰ，混勻后靜置10m in，在波長340 nm處測定吸光度值A(chǔ)1，加入用0.02 m L水復(fù)溶的試劑Ⅱ，混勻后靜置10 min，測定吸光度值A(chǔ)2。

1.3.3 樣品的前處理

針對不同的樣品進(jìn)行不同的處理，具體樣品前處理方法見表1。

表1 樣品前處理方法Table 1 Pretreatment methods of samples

1.3.4 各類樣品中檸檬酸回收率的測定

在合適的稀釋倍數(shù)下對樣品進(jìn)行測定，在該稀釋倍數(shù)下對樣品進(jìn)行0.5倍、1.0倍、2.0倍檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度的添加，測定并計算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 L-MDH、L-LDH、NADH單獨(dú)及混合凍干保護(hù)劑的篩選

將試劑Ⅰ中NADH、L-MDH、L-LDH單獨(dú)分別在200 μL保護(hù)劑甘露醇、酒石酸、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、谷胱甘肽、半胱氨酸、聚乙二醇2000、聚乙二醇6000等不同物質(zhì)下進(jìn)行凍干，凍干前后對同一濃度檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，測定吸光度差值ΔA［ΔA=（A2-A1）標(biāo)準(zhǔn)-（A2-A1）空白］無明顯差異，且隨著保存時間延長，吸光度差值變化不大，則凍干保護(hù)劑效果良好；凍干后粉劑無明顯氣泡，規(guī)則易于復(fù)溶解則凍干保護(hù)劑效果良好；凍干后保存時間越長，凍干保護(hù)劑效果越優(yōu)。

單獨(dú)凍干保護(hù)劑篩選結(jié)果見表2，混合凍干保護(hù)劑篩選結(jié)果見表3。

表2 單獨(dú)凍干保護(hù)劑種類、凍干后形態(tài)、凍干后保存性Table 2 Species of single cryoprotectant working reagents, lyophilized forms and preserving qualities

由表2可知，各濃度海藻糖、0.164 g/m L及0.082 g/m L雙甘肽、硫酸鎂、聚乙二醇6000作為保護(hù)劑的各試劑在凍干取出后形態(tài)較為規(guī)則，且保存時間相對較長，在保存中吸光度差值降低較緩慢，試劑Ⅱ（CL）在200 μL水體系下無需凍干保護(hù)劑凍干后在4℃保存3個月測定吸光度差值及形態(tài)均良好。

由表3可知，3.783 mg海藻糖+2 mg硫酸鎂+5 mg PEG6000+0.082 g/m L雙甘肽200 μL作為保護(hù)劑凍干NADH、MDH、L-LDH混合劑后保存性良好。該體系凍干后在4℃保存3個月測定無明顯差異。由于NADH見光遇熱氧化，凍干后的試劑需要避光低溫保存，且凍干程度及后期的密封性均會影響試劑保存性。

表3 試劑混合凍干保護(hù)劑種類篩選、凍干后形態(tài)、凍干后保存性Table 3 Species screening of cryoprotectant mixture reagents, lyophilized forms and preserving qualities

2.2 檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以吸光度差值ΔA（y）為縱坐標(biāo)［ΔA=（A2-A1）標(biāo)準(zhǔn)-（A2-A1）空白］，檸檬酸含量（x）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of citric acid

由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=0.051x-0.001 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.995，表明二者在1～80 μg/L內(nèi)線性相關(guān)。分光光度計在波長340 nm條件下測定的檸檬酸質(zhì)量濃度（靈敏度）為0.25 mg/L，檢測限為0.5 mg/L。

2.3 樣品中檸檬酸回收率實(shí)驗(yàn)

對不同樣本進(jìn)行回收率測定時，加入檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品后的體積均為0.4 m L，樣品中回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 加標(biāo)樣品中檸檬酸的回收率Table 4 Recovery rates of citric acid sam ples

續(xù)表

由表4可知，各樣品回收率均在90%～110%，表明該方法準(zhǔn)確度較好。

3 結(jié)論

將NADH、L-MDH、L-LDH及硫酸鎂、海藻糖、聚乙二醇6000、雙甘肽等凍干保護(hù)劑混合凍干作為試劑Ⅰ，將水體系的CL凍干作為試劑Ⅱ。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線可推算出樣品中檸檬酸含量。該方法的檢測線性范圍為1～80 μg/L，靈敏度為0.25 mg/L，檢測限為0.5 mg/L，測定的各樣品回收率均在90%～110%；試劑盒方法可以在20 m in實(shí)現(xiàn)樣品中檸檬酸的快速檢測，適合樣品的批量檢測。

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Development of rapid detection kit for citric acid in food

CHANG Pingping1,HAO Yanhong1,ZHOU Zunwu2,WAN Yuping1*,LIU Wei1,QIAN Rui1,SHEN Guodong1
(1.Beijing K winbon Biotechnology Co.,Ltd.,Beijing 102206,China;2.Shandong Spring Snow Food Co.,Ltd.,Laiyang 265200,China)

s:A rapid enzymatic detection method was developed for determination of citric acid in food.Reagent I was made by L-malate dehydrogenase 6 U,L-lactate dehydrogenase 9.13 U,nicotinamide adenine dinucleotide 0.5 mg,MgSO42 mg,trehalose 3.783 mg,PEG 6000 5 mg with 0.082 g/m l Gly-Gly 0.2 m l after freezing 5 h at-60℃,and then vacuumized for 18 h at room temperature.Reagent II was made by citrate lyase 0.468 U in 0.2 m l water system by freeze drying.Results showed the correlation coefficient of standard curve was 0.995,linearity range was 1-80 μg/L,the sensitivity of method was 0.25 mg/L,the limit of detection of method was 0.5 mg/L,and the recovery rate was 90%-110%.By this method,the citrate in the sample can be rapidly detected within 20 m in.The method was simple and fast with high sensitivity and specificity,which was suitable for rapid detection of citric acid in food and evaluation of food quality.

food;citric acid;rapid detection kit;nicotinamide adenine dinucleotide

TS207.3

A

0254-5071（2015）03-0111-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.026

2015-01-07

科技新星計劃（Z141105001814116）

常平平（1984-），女，工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称贩治雠c檢測。

*通訊作者：萬宇平（1982-），男，工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測技術(shù)研究。