葡聚糖和腐植酸：對免疫系統(tǒng)的協(xié)同作用

葡聚糖和腐植酸：對免疫系統(tǒng)的協(xié)同作用

Key words: glucan; humic acids; immunity; phagocytosis

有據(jù)可查，使用β-1，3-葡聚糖作為一種免疫調節(jié)劑已經超過50年。實驗表明粗制的酵母細胞制備物通過補體系統(tǒng)的激活來刺激巨噬細胞，使得對多糖免疫調節(jié)特性的研究興趣第一次被提起來。實驗進一步研究確定的免疫調節(jié)活性成分為β-1，3-葡聚糖。隨后大量研究表明β-1，3-葡聚糖，無論是顆?；蚴侨芤?，均表現(xiàn)出免疫刺激特性，包括抗細菌和抗癌活性。2500多種出版物報道，β-1，3-葡聚糖的溶液或顆粒，均表現(xiàn)出顯著的免疫調節(jié)性能。目前，葡聚糖被認為是最有效的生物反應調節(jié)劑之一。

一些研究表明，與葡聚糖相結合的生物活性分子具有協(xié)同效應。大量報告顯示，當葡聚糖與維生素C結合會產生一些有益的影響。與維生素C表現(xiàn)出協(xié)同效應的主要原因是：該維生素顯示出與葡聚糖刺激完全相同的免疫反應，即巨噬細胞活性，自然殺傷細胞的活性，以及特定抗體的形成。一項研究顯示，在小鼠被感染科氏中殖孔絳蟲的治療過程中，葡聚糖-維生素C的組合具有顯著的治愈能力；治療對肝纖維化和病理生理學變化產生積極的調制作用。同組研究人員還發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵衍生的葡聚糖對幾種寄生蟲是一種前景廣闊的藥劑。至于肝病，裂褶菌胞外多糖葡聚糖被證明有助于抵抗肝臟的缺血再灌注損傷，這些影響機制可能是由于葡聚糖引起早期基因的表達減少了對肝臟的損傷。

腐植酸物質主要存于深度降解的泥炭中。腐植酸是一組由復雜的芳香族聚合物結構組成的高分子量的大分子物質，和黃腐酸代表了腐植酸物質中特定的組分，一些人認為是惰性的，而另一些人認為它們是生物毒素。更詳細的研究顯示出不同的結果：高劑量的腐植酸在腸細胞中會誘導染色體異常，造成DNA氧化損傷，抑制核因子κB的活性，刺激胸腺和中性粒細胞。另一方面，最近一些令人關注的、潛在的、臨床重要的生物活性物質與各種類型腐植酸有關，包括抗病毒的特性和淋巴細胞的增殖。也有研究將腐植酸添加到飼料中，促進了養(yǎng)殖動物的生長和健康。

最近的研究表明，白藜蘆醇能夠顯著改善葡聚糖的生物活性，所以我們評估葡聚糖與腐植酸對免疫反應可能有協(xié)同作用。

1 材料和方法

1.1 動物

6～10周齡的BALB/c雌性小鼠，購自杰克遜實驗室（美國緬因州巴爾港）。

所有動物實驗是根據(jù)美國肯塔基州路易斯維爾市路易斯維爾大學的動物管理委員會的規(guī)范進行。動物用CO2窒息處死。

1.2 材料

RPMI 1640培養(yǎng)基，檸檬酸鈉，卵白蛋白，抗生素，瑞氏色素，鱟溶解物試驗E-TOXATE，弗氏佐劑，伴刀豆球蛋白A（Con A）（從美國密蘇里州圣路易斯Sigma公司購買），胎牛血清（從美國猶他州洛根Hyclone實驗室購買）。

1.3β-1,3-葡聚糖

本研究使用的葡聚糖從以下公司購得：酵母型不溶性葡聚糖No.300來自轉運站（美國，南卡羅來納州，哥倫比亞），水溶性葡聚糖海帶多糖來自Sigma公司。

1.4 提取步驟

實驗中使用的兩種腐植酸：一個提取自捷克共和國的風化褐煤（HZ）；另一個提取自中國的褐煤（HC）。對不同的腐植酸進行分離，依據(jù)國際腐殖質學會的程序進行純化，并冷凍干燥。

1.5 固態(tài)13C-核磁共振(NMR)光譜

固態(tài)13C-核磁共振光譜，用Bruker（美國馬薩諸塞州比爾里卡）的Avance AV-400WB（9.4-T）型光譜儀測定，共振頻率為100.47 MHz，采用交叉極化磁性旋轉技術，旋轉頻率為12 KHz，脈沖寬度為90°，采樣時間為30 ms，延遲時間為4.0 s。

1.6 元素分析

凍干樣品中的碳、氫、氮含量，一式2份，采用LECO?（美國密歇根州圣若瑟）CHN 900型分析儀器進行元素分析。氧的含量通過差減法進行確定（無灰基）。

1.7 體外吞噬作用

在腹腔注射葡聚糖和/或如前面所述腐植酸之后，使用合成的微球（2-甲基丙烯酸羥乙酯[HEMA]顆粒），供體外測定吞噬作用，即，采用0.05 mL的HEMA粒子（5×108/mL）培養(yǎng)血液或分離的腹膜細胞。試管于37 ℃培養(yǎng)60 min，并間歇振蕩。涂片標本用瑞氏色素進行染色。細胞有3個或更多的HEMA粒子則認為呈陽性。同樣的涂片標本再被用于評價細胞的類型。

1.8 白細胞介素(IL)-2的生產評價

純化的脾細胞（2×106/mL和5%的胎牛血清在RPMI 1640培養(yǎng)基中）加入到24孔培養(yǎng)板中。在陽性對照孔加入1 μg 伴刀豆球蛋白A，將細胞在恒濕培養(yǎng)箱中（37 ℃，5% CO2）培養(yǎng)72 h。在培養(yǎng)結束后，收集上清液，過濾（孔徑0.45 μm），并測試IL-2的存在。IL-2水平使用Quantikine小鼠IL-2試劑盒（美國明尼蘇達州明尼阿波利斯研發(fā)體系）測定。

1.9 細胞因子陣列

單個細胞因子通過聯(lián)合生物技術（美國馬里蘭州維爾）在小鼠血清中進行測定。小鼠注射試驗組合物24 h后，將小鼠處死，并收集血清，儲存在-80 ℃冰箱中。對于細胞因子的分析，我們采用聯(lián)合生物技術所提供的蛋白質微陣列服務。簡言之，該服務使用夾層的基于抗體的蛋白被用于多重測定。一個共軛鏈霉親和素-Cy5被用于分析檢測，該方法在每個芯片的陽性和陰性對照中進行，一式4份測定。該測定法檢測下列細胞因子：IL-2，干擾素-γ，腫瘤壞死因子（TNF）-α，IL-8，IL-12 p70，IL-12 p40，IL-4，IL-6，IL-10，IL-5，干擾素誘導蛋白-10，巨噬細胞炎性蛋白-1β，IL-13，IL-1β和單核細胞趨化蛋白（MCP）。

1.10 體內腫瘤抑制

每只小鼠在皮下脂肪墊中注射磷酸緩沖鹽水（PBS）配置的1×106Ptas64細胞。在明顯發(fā)現(xiàn)腫瘤后（一般在細胞注射14天后），將小鼠分配給實驗組。用PBS稀釋過測試樣品后，采用腹膜注射稀釋樣品，處理完成之后將小鼠處死，從其身上取出腫瘤并稱重。

1.11 抗體的形成

小鼠用100 μg卵清蛋白注射2次（間隔2周），在最后1次注射7天后收集血清。特異性抗體對抗卵清蛋白的水平通過酶聯(lián)免疫吸附測定法進行檢測。采用弗氏佐劑作為陽性對照。

1.12 統(tǒng)計

采用學生t-檢驗對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結果

在元素分析，特別是在13C-核磁共振分析中能夠觀察到，在芳香族和脂肪族結構部分，HZ呈現(xiàn)出比HC更多的功能性基團，主要體現(xiàn)在酚基碳、羰基碳、O-烷基碳的含量較高。但是，HC呈現(xiàn)出顯著的芳香性，而HZ呈現(xiàn)出芳香性顯著的脂肪族排列。因此得到了2個結構完全不同的腐植酸：HZ具有更多的含氧官能團，并與芳香族和脂肪族基團結合，HC具有較少功能性基團，但具有高芳香性（表1和表2）。

表1 腐植酸樣品的元素分析Tab.1 Elementary analysis of HA samples %

表2 腐植酸樣品的13C-核磁共振光譜分析Tab.2 13C-NMR spectroscopy of HA samples

首先，測試腐植酸和腐植酸-葡聚糖對腹腔內一些細胞的影響。在隨后的所有實驗中，使用相同組合方式，觀察到無論是腹腔注射或口服（數(shù)據(jù)未顯示），細胞結構（關于二者總數(shù)和分類計數(shù)）沒有變化。在所有情況下，葡聚糖、腐植酸、或葡聚糖-腐植酸能溶解在PBS中，被用作陰性對照。

各種葡聚糖對巨噬細胞的影響是公認的。然而，為了證明免疫調節(jié)劑的新組合確實表現(xiàn)出免疫調節(jié)特性，對吞噬作用進行評價是必要的。首先，我們測量了葡聚糖和/或腐植酸對末梢血中合成的HEMA微球體外吞噬作用的影響（圖1）。葡聚糖和腐植酸均刺激合成顆粒的內部轉化，但該組合制劑，特別是在比例為1∶1時，對血液中性粒細胞表現(xiàn)出顯著的協(xié)同效應。

圖1 腹腔內注射葡聚糖和/或腐植酸合成微球(HEMA粒子)對體外吞噬作用增強效果Fig.1 Potentiation of in vitro phagocytosis of synthetic microspheres (HEMA particles) by intraperitoneally injected glucans and/or HAs

當測試腹腔巨噬細胞的體外吞噬作用時，得到了相同的結果（圖2）。在這兩種情況下，將細胞與注射了葡聚糖和/或腐植酸的小鼠身體分離。

圖2 腹腔內注射葡聚糖和/或腐植酸合成微球(HEMA粒子)對體外吞噬作用增強效果Fig.2 Potentiation of in vitro phagocytosis of synthetic microspheres (HEMA particles) by intraperitoneally injected glucans and/or HA

免疫調節(jié)活性也能通過對由脾細胞產生的IL-2的影響得到證明（圖3）。從對照組和實驗組小鼠分離出來的的脾細胞在體外培養(yǎng)72 h后測定IL-2的產生。此外，葡聚糖和腐植酸結合的處理小鼠對IL-2的產生有顯著的刺激效果。在采用HZ的情況下，當HZ與葡聚糖為9∶1時表現(xiàn)出最高的刺激效果；而在采用HC的情況下，HZ與葡聚糖為1∶9時IL-2獲得最高的產生量。與單獨使用葡聚糖或腐植酸相比，所有這些組合都表現(xiàn)出更高的刺激效果。由于無刺激的脾細胞（PBS組）IL-2的分泌量為零，所以即使是最低量的刺激在統(tǒng)計學上產生的影響也是顯著的。

圖3 葡聚糖-腐植酸結合物對伴刀豆球蛋白A刺激脾細胞分泌IL-2的影響Fig.3 Effects of glucan–HA combinations on Con A-stimulated secretion of IL-2 by spleen cells

初步實驗之后，我們測量取自24 h前腹腔內注射的小鼠的細胞因子分泌物。由表3所示的結果可清楚地觀察到幾個重要的結論：在測試的14種細胞因子中，腐植酸和葡聚糖只刺激其中6種細胞因子的分泌（IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，TNF-α和MPC-1）；在HC中有個例外，它不刺激MCP-1的產生。關于H Z，相對于單獨使用H Z或葡聚糖，HZ與葡聚糖結合對IL-5， IL-6和TNF-α具有更高的刺激。稍微有點不同的是，HC-葡聚糖結合物僅僅在1∶9時才能提高IL-5， IL-6和TNF-α的分泌。在這兩種情況下，對MCP-1分泌的刺激都是微小的。

然后，我們專注利用輔助的組合物實驗模型，采免疫卵清蛋白、葡聚糖、腐植酸、腐植酸和葡聚糖與兩種腹膜劑量的抗原一起使用；用弗氏佐劑作為一個額外的陽性對照。所得結果表明（圖4），組合物在所有情況下對抗原都表現(xiàn)出顯著的佐劑活性（光密度，0.311±0.026）。對于HZ，在9∶1時表現(xiàn)出最高的刺激性，而HC，在1∶1和1∶9時表現(xiàn)出最高的刺激性。然而必須指出，沒有一個葡聚糖增效的體液免疫值達到了弗氏佐劑的水平（光密度，1.67±0.22）。

最后，對接種了Ptas64乳腺腫瘤的小鼠，每日在腹膜內注射待測試的物質以測試其治療效果（圖5）。實驗重復3次（每個實驗組3只小鼠），獲得了相似的結果。對照組（僅PBS）腫瘤的平均重量為699.7±38.5 mg。實驗數(shù)據(jù)表明，對于HZ實驗組，對腫瘤生長起強烈抑制作用的分子很明顯是葡聚糖，因為單獨用葡聚糖的抑制性與HZ-葡聚糖的抑制性是一樣的。而對HC實驗組，測試樣品在1∶1的比例對腫瘤生長表現(xiàn)出強烈抑制性。這兩種情況下，單獨使用腐植酸都沒表現(xiàn)出顯著的抑制活性。

表3 腐植酸樣品和葡聚糖對細胞因子分泌的影響Tab.3 Effect of HA samples and glucan on cytokine secretion

圖4 腹腔注射兩種腐植酸-葡聚糖組合對抗卵清蛋白抗體形成的影響Fig.4 Effects of two intraperitoneal injections of tested HA–glucan combinations on formation of antibodies against ovalbumin

圖5 腐植酸-葡聚糖對接種Ptas64乳腺腫瘤的BALB/c小鼠的治療效果Fig.5 HA-glucan therapy of BALB/c mice with Ptas64 mammary carcinoma

3 討論

腐植酸物質是土壤中腐殖質的主要成分。它們是動植物遺骸中有機物經化學和微生物降解的產物。它們的溶解度隨pH值而不同。這3個主要的有機腐植酸組分可以分為：腐植酸，在堿性pH下可溶，酸性pH下不可溶；黃腐酸，任何pH值下均可溶；棕腐酸在任何pH值下均不可溶。這些腐植酸物質的結構是不明確的。從定性的角度看，它們呈現(xiàn)相同類型的官能團和結構。然而，由于系統(tǒng)的多分散性，難于表明其確切的結構。一般而言，它們是具有不同分子量和分子大小的酸聚合電解質，并具有不同的芳香族特性。這些物質的特點是它們能影響不同生物的代謝和發(fā)育。因此，腐植酸物質能影響植物代謝，微生物活動和動物發(fā)育，這在許多其他的研究中已進行過描述。然而，對結構特征和生物活性的相關研究卻很少。

不同的研究表明，表征腐植酸物質的實效方法是13C-核磁共振和元素分析法互補使用。我們將這些技術應用于本實驗使用的兩種腐植酸，在元素分析，特別是在13C-核磁共振（NMR）中能夠觀察到，在芳香族和脂肪族結構部分，HZ呈現(xiàn)出比HC更多的功能性基團。這種功能性基團主要體現(xiàn)在酚、羰基碳、O-烷基碳的含量較高。但是，HC呈現(xiàn)出顯著的芳香性，而HZ呈現(xiàn)出芳香性（占主導）和顯著的脂肪族排列。因此我們使用了兩個結構完全不同的腐植酸：HZ具有更多的和芳香族和脂肪族基團結合的含氧官能團，HC具有較少官能團，但具有高芳香性（表1和表2）。

各種類型的免疫調節(jié)劑，尤其是葡聚糖，刺激吞噬作用是公知的。因此，通過評估這類免疫反應，來判定有生物活性的免疫調節(jié)劑效果是重要的。我們測試了血液周邊白細胞和巨噬細胞在吞噬作用中使用HEMA合成微球后的變化。這些微粒具有輕微的負電荷，且也沒有特別的附著到細胞表面，這保證了只有活性吞噬細胞內部轉化這些惰性粒子。該現(xiàn)象通過相差顯微鏡，電子顯微鏡，以及猝滅法已經驗證。我們發(fā)現(xiàn)，測試的這兩種物質引起體外吞噬作用的顯著增加，且這兩種物質的組合物顯示出對巨噬細胞和中性粒細胞的協(xié)同效應顯著。所示數(shù)據(jù)不但反映了單次注射試驗物質的效果，類似的效果在口服給藥后（數(shù)據(jù)未顯示出）也可以觀察到。觀察這些實驗中由于直接的細胞活化，其血液或腹膜腔中各細胞總數(shù)和比例都沒有變化。

除了直接影響免疫系統(tǒng)中的各種細胞，β-葡聚糖的免疫刺激和其他的免疫導致一些細胞因子的釋放和合成作用增強。首先，我們注意到通過體外脾細胞的刺激產生了IL-2，發(fā)現(xiàn)β-葡聚糖對免疫系統(tǒng)中的各種細胞有直接作用，葡聚糖和其他免疫調節(jié)劑的免疫刺激作用是增強合成作用和釋放若干細胞因子來起作用的。并且發(fā)現(xiàn)，腐植酸-葡聚糖的組合物刺激比單獨測試時釋放更高的IL-2，而90%的HZ在與葡聚糖組合的情況下，釋放的IL-2比HZ與伴刀豆球蛋白A組合時更高。

我們評估了對血清中14種不同細胞因子的影響。HC-葡聚糖刺激效果依賴于其比例，所以HZ比HC的刺激效果更明顯，而且在所有情況下都比單獨使用腐植酸刺激所產生細胞因子的效果高。刺激效果最高的細胞因子是IL-5，IL-6和TNF-α，而14個細胞因子中的8個沒有檢測到刺激效果。

細胞因子是細胞間信息交流的重要載體，它們在不同免疫系統(tǒng)間的信息流動中起著極其關鍵的作用。報告中顯示癌癥中的ILs可以表現(xiàn)出對腫瘤生長的抑制功能及對癌癥生長的促進功能。腫瘤惡化過程的性質是復雜的，由惡性細胞產生的細胞因子可作為自分泌生長因子和免疫調節(jié)劑。

最近的一些研究證實，葡聚糖也可以作為一種佐劑輔助體液免疫反應。我們通過比較測試葡聚糖-腐植酸組合物和弗氏佐劑的佐劑活性，試驗結果表明，盡管活性總是低于弗氏佐劑，但還是很重要的，其中葡聚糖-HC二者組合的活性是最高的。

最后，我們決定測試腐植酸-葡聚糖的組合對小鼠體內乳腺腫瘤細胞Ptas64生長的影響。我們先前的研究工作表明，小鼠和人類CR3對葡聚糖響應有極高的相似性，這使得小鼠腫瘤模型適合于葡聚糖的研究。我們采用了與之前發(fā)表的文章相同的實驗設計，即采用發(fā)酵衍生的葡聚糖。類似于抗體應答，發(fā)現(xiàn)1∶1的HC-葡聚糖具有最高的抑制效果，我們觀察到有92%以上的抑制率。該結果表明，腐植酸的芳香性在抗腫瘤作用中發(fā)揮重要作用，因為HZ的芳香性遠遠低于HC，HZ沒有表現(xiàn)出高的抑制活性。

脂多糖污染可能掩蓋任一免疫調節(jié)劑的實際效果。因此，我們檢測了研究方案中的脂多糖污染，測定的結果都小于10 EU。另外，我們通過用10 μg/mL多粘菌素B處理葡聚糖和腐植酸，消除脂多糖的功能，兩種情況下得到了相同的結果。從常規(guī)的和無脂的多糖材料中取得的結果也相似，表明微量脂多糖的存在對提高免疫活性和抗腫瘤反應無影響。

總結我們的數(shù)據(jù)，結果表明腐植酸具有生物免疫調節(jié)活性，影響體液和細胞免疫反應。另外，H Z和H C在免疫反應的刺激中起著協(xié)同作用，這一發(fā)現(xiàn)為這些天然免疫調節(jié)劑的進一步研究提供了支持。

略)

譯自：Journal of Medicinal Food，2010，13（4）：863～869。

Vaclav Vetvicka1，Roberto Baigorri2，Angel M. Zamarre?o2，Jose M. Garcia-Mina2，3，Jean-Claude Yvin4著周霞萍5樊興明5譯

（1 美國路易斯維爾大學病理學系 肯塔基州 40292
2 鈦美農業(yè)國際魯利耶集團研發(fā)部 奧爾科延 999019
3 西班牙納瓦拉大學化學和土壤化學系 潘普洛納 999023
4 法國鈦美農業(yè)國際研發(fā)部 迪納爾 999019
5 華東理工大學科學技術發(fā)展研究院 上海 200237）

腐植酸是由有機物質分解產生的混合物。盡管它們普遍存在，但對它們的生物學效應了解有限，且目前的研究結果存在爭議。因此對來源不同且具有不同的生化特性的兩種類型的腐植酸的免疫效果進行評估。單獨使用這兩種腐植酸或與已知發(fā)酵衍生的免疫調節(jié)劑葡聚糖結合使用，并測其在細胞(吞噬作用和腫瘤抑制)和體液(抗體的產生和細胞因子的分泌)的免疫反應。研究結果表明，腐植酸是具有生物活性的免疫調節(jié)劑，影響體液免疫和細胞免疫反應。此外，本文研究的兩種腐植酸在免疫反應的刺激下具有協(xié)同效應，為這些天然免疫調節(jié)劑的進一步研究提供了支持。

葡聚糖 腐植酸 免疫力 吞噬作用

Glucan and Humic Acid: Synergistic Effects on the Immune System

Vaclav Vetvicka1, Roberto Baigorri2, Angel M. Zamarre?o2, Jose M. Garcia-Mina2,3, Jean-Claude Yvin4write Zhou Xiaping5, Fan Xingming5translate
(1 Department of Pathology, University of Louisville, Louisville, Kentucky, USA, 40292
2 R&D Department, Timac Agro International-Roullier Group, Orcoyen, 999019
3 Department of Chemistry and Soil Chemistry, University of Navarra, Pamplona, Spain, 999023
4 R&D Department, Timac Agro International, Dinard, France, 999019
5 Institute of Science and Technology Development, East China University of Science and Technology, Shanghai, 200237)

Humic acids are compounds resulting from decomposition of organic matter. Despite their common presence, our knowledge of their biological effects is limited, and current findings are controversial. We decided to evaluate the immunological effects of two different types of humic acids, differing in source and biochemical characteristics. Using both components either alone or in combination with the well-established yeast-derived immunomodulator glucan, we measured their effects on both the cellular (phagocytosis and tumor suppression) and humoral (antibody production and cytokine secretion) branches of immune reactions. In summary, our results suggest that humic acids are biologically active immunomodulators affecting both the humoral and cellular branches of immune reactions. In addition, the two humic acids studied here are working in synergy in stimulation of the immune reaction, supporting further studies of these natural immunomodulators.

TQ314.1，R979.5

A

1671-9212(2015)06-0034-07

2014-10-18

周霞萍，女，1953年生，教授，主要從事煤、生物質(腐植酸)基礎及應用化學研究，E-mail：zxp@ecust.edu.cn。