RP-HPLC法測(cè)定藍(lán)莓和黑莓中VC的含量

劉志剛，候浪，王瑞，岑順友，劉曉燕，謝曉林

（1.貴陽(yáng)學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550005；2.貴州省果品加工工程技術(shù)研究中心，貴州貴陽(yáng)550005）

RP-HPLC法測(cè)定藍(lán)莓和黑莓中VC的含量

劉志剛1，2，候浪1，王瑞1，2，岑順友2，劉曉燕1，2，謝曉林1

（1.貴陽(yáng)學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550005；2.貴州省果品加工工程技術(shù)研究中心，貴州貴陽(yáng)550005）

建立了藍(lán)莓和黑莓中VC含量的高效液相色譜測(cè)定方法。樣品用0.5%草酸溶液低溫振蕩提取后，進(jìn)行高效液相色譜分析，色譜柱為Agilent C18（4.6 mm×250 mm，5 m），流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液（5∶95），流速0.8 m L/min，檢測(cè)波長(zhǎng)242 nm。研究結(jié)果表明，VC在0.02mg/mL～0.4mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，r為0.999 6，平均加樣回收率為97.1%，RSD均小于3.0%。所建立方法快速簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高，能夠用于測(cè)定藍(lán)莓和黑莓中VC的含量。

藍(lán)莓；黑莓；VC；HPLC；含量測(cè)定

藍(lán)莓為杜鵑花科越橘屬（Vaccinium.spp）多年生灌木，藍(lán)莓果實(shí)呈深藍(lán)色，被白霜，含有豐富的維生素、花色苷和多酚等生物活性成分[1-3]，有“水果皇后”的美譽(yù)。黑莓為薔薇科懸鉤子屬灌木，果實(shí)為黑色或者暗紫色聚合果，富含VC和鐵等微量元素，具有的抗氧化等多種生理活性[4-5]。目前測(cè)定水果中VC含量的方法很多，國(guó)標(biāo)法采用2，6-二氯靛酚法測(cè)定，此外，還包括熒光光度法和分光光度法等[6-7]，但藍(lán)莓和黑莓果實(shí)均富含花色苷等天然色素，采用上述方法測(cè)定時(shí)干擾因素較多，有學(xué)者采用高效液相色譜法測(cè)定獼猴桃、刺梨等水果中VC的含量[8-9]，有文獻(xiàn)報(bào)道了藍(lán)莓中草酸、酒石酸、蘋(píng)果酸及鞣花酸等成分的HPLC含量測(cè)定方法[10-11]，而有關(guān)藍(lán)莓和黑莓中VC的HPLC測(cè)定方法鮮見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，本研究首次建立了RP-HPLC法快速測(cè)定藍(lán)莓和黑莓中VC的定量測(cè)定方法，并對(duì)7個(gè)不同品種藍(lán)莓和黑莓中的VC含量進(jìn)行了測(cè)定，從而為藍(lán)莓和黑莓相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇（色譜純）：美國(guó)TEDIA公司；冰醋酸、磷酸均為分析純：重慶川江化工有限公司；水：為重蒸水，自制；VC對(duì)照品（批號(hào)：HG/T1534F1994，純度：99.0 %）：上海試四赫維化工有限公司；藍(lán)雨、北陸、園藍(lán)、芭爾德溫、梯芙藍(lán)、粉藍(lán)、燦爛等品種藍(lán)莓和黑莓鮮果均于2013年8月10日采自貴州省麻江縣宣威鎮(zhèn)龍崩藍(lán)莓基地。

1.2 儀器與設(shè)備

SHIMADZU高效液相色譜儀（LC-20AT輸液泵，SPD-M20A紫外檢測(cè)器，LC solution色譜工作站）；AS3120A型超聲波提取器：天津奧特賽恩斯儀器有限公司；SHA-B恒溫振蕩器：常州澳華儀器有限公司；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵：上海亞榮生化儀器廠；BCFCO型電熱恒溫水浴鍋：北京長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司；JJ-2型組織搗碎機(jī)：金壇市易晨?jī)x器制造有限公司；AUW 120D型分析天平：日本島津公司。

1.3 樣品制備方法

1.3.1 對(duì)照品溶液制備

稱(chēng)取VC對(duì)照品10mg，精密稱(chēng)定，置50mL棕色容量瓶中，用0.1%磷酸溶液稀釋成濃度為0.2mg/mL的對(duì)照品溶液。

1.3.2 樣品溶液制備

稱(chēng)取藍(lán)莓果漿約5.0 g，精密稱(chēng)定，加入0.5%草酸溶液5mL溶解，5℃低溫下于振蕩器中提取20min，抽濾，濾液用0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，作為供試品溶液進(jìn)行HPLC定量分析，黑莓供試品溶液的制備方法同上。1.4 HPLC色譜條件

色譜柱采用AgilentHC-C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液（5∶95）；流速0.8mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)242 nm；進(jìn)樣量20μL；柱溫為室溫。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的VC對(duì)照品，精密稱(chēng)定，分別置50m L棕色量瓶中，以0.1%磷酸溶液溶解并稀釋定容，分別配制成濃度為0.02、0.1、0.2、0.3、0.4mg/mL的VC工作溶液，用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，按1.4項(xiàng)下色譜條件分析，由色譜峰面積和溶液濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果VC在0.02mg/mL～0.4mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，Y=4.32×107X-1.51×103，r=0.999 6。

2.2 精密度試驗(yàn)

取同一藍(lán)莓果漿樣品，按照1.3.2項(xiàng)下方法制備樣品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積，計(jì)算VC峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），其平均RSD為0.6%，說(shuō)明方法的精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，4℃低溫下放置24 h，分別在0、2、4、8、12、24 h測(cè)定，記錄色譜峰面積，計(jì)算得色譜峰峰面積的RSD值均小于2.0%，表明供試品溶液在4℃低溫下可保持24 h穩(wěn)定；另取供試品溶液，室溫下放置8 h，結(jié)果色譜峰峰面積的RSD值已大于8.0%，表明樣品中VC在室溫下放置8 h不穩(wěn)定。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批藍(lán)莓果漿樣品5份，按照1.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，記錄峰面積，VC峰面積的RSD為1.2%，說(shuō)明方法的重復(fù)性良好。

2.5 回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取同一批已知含量的藍(lán)莓樣品，精密加入濃度為10μg/mL的VC標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，按1.3.2項(xiàng)下制備方法供試液共5份，進(jìn)樣分析，由測(cè)得量與加入量計(jì)算回收率，結(jié)果VC的平均加樣回收率為97.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）不大于3.0%，表明方法準(zhǔn)確度良好。2.6 樣品測(cè)定

分別取所采集到7個(gè)不同品種藍(lán)莓和1個(gè)黑莓樣品，照1.3.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備樣品溶液，進(jìn)樣20μL，采用外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果藍(lán)莓中VC的含量分布在1.57mg/100 g～4.01mg/100 g范圍內(nèi)，黑莓中VC的含量較低（見(jiàn)圖2）。

圖2 不同品種藍(lán)莓和黑莓鮮果中VC的含量Fig.2 The vitamin C content of different varieties of blueberry and blackberry in fresh fruit

3 結(jié)論

本方法以0.5%草酸溶液作為提取溶液，低溫振蕩提取藍(lán)莓和黑莓樣品中的VC，操作簡(jiǎn)單快速，可避免樣品中VC被氧化和基質(zhì)成分的干擾。采用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定時(shí)，在流動(dòng)相中加入0.1%磷酸溶液作為酸抑制劑，色譜峰對(duì)稱(chēng)性良好，既能達(dá)到基線分離的要求，又有適宜的保留時(shí)間，結(jié)果穩(wěn)定準(zhǔn)確，且靈敏度高，適合用于鮮果樣品中VC的測(cè)定。

采用所建立分析方法分別對(duì)產(chǎn)自我國(guó)南方藍(lán)莓主產(chǎn)地貴州省麻江縣7個(gè)不同品種藍(lán)莓和1個(gè)品種黑莓中的VC含量進(jìn)行測(cè)定，由結(jié)果可知，不同品種藍(lán)莓中VC的含量相差十分懸殊，在所檢測(cè)7個(gè)品種中，粉藍(lán)中VC含量最高，藍(lán)雨VC含量最低，而各品種藍(lán)莓中VC的含量均遠(yuǎn)高于黑莓，上述研究結(jié)果為藍(lán)莓和黑莓相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

[1] Prior R L,WU X L,GU LW,et al.Whole berries versus berry anthocyanins:interactions with dietary fat levels in the C57BL/6J mouse model of obesity[J].Journal of agricultural and food chemistry, 2008,56(3):647-653

[2]YIW G,AKOH C C,FISCHER J,et al.Absorption of anthocyanins from blueberry extracts by caco-2 human intestinal cell monolayers [J].Journal of agricultural and food chemistry,2006,54(15):5651-5658

[3] 胡雅馨,李京,惠伯棣.藍(lán)莓果實(shí)中主要營(yíng)養(yǎng)及花青素成分的研究[J].食品科學(xué),2006,27(10):600-603

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[6]傅維,楊彩霞.熒光分光光度法測(cè)定幾種天津市售水果中維生素C的含量[J]．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(23):14392-14393,14411

[7]劉薇,王君,劉德明,等．分光光度法測(cè)定藍(lán)莓果中維生素C的含量[J]．湖南農(nóng)業(yè)科學(xué),2013(2):35-36

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[11]劉艷,宋立秋,范俊娟,等．HPLC法測(cè)定藍(lán)莓中鞣花酸含量[J]．江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,11(3):217-219

Determination of Vitamin C in Blueberry and Blackberry by RP-HPLC

LIU Zhi-gang1，2，HOU Lang1，WANG Rui1，2，CEN Shun-you2，LIU Xiao-yan1，2，XIE Xiao-ling1
（1.Department of Food and Pharmaceutical Engineering，Guiyang University，Guiyang 550005，Guizhou，China；2.Guizhou Engineering Research Center for Fruit Processing，Guiyang 550005，Guizhou，China）

To develop a method for the determination of Vitamin C in blueberry and blackberry．An HPLC method has been developed to determine Vitamin C on Agilent C18（4.6 mm×250mm，5 m）column with the mobile phase of consisting of5%（v/v）methanol and 0.1%phosphoric acid．The flow rate was 0.8m L/min and the UV detection wavelength was set at 242 nm．The result showed that linearity of Vitamin C was good in the ranges of 0.02mg/mL-0.4mg/mL（r=0.999 6）．The average recovery of Vitamin C was97.1%with RSD less than 3.0%．The method is sample and accurate and could be used to control the quality of blueberry and blackberry．

blueberry；blackberry；VC；HPLC；assay

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.01.025

2014-01-29

貴州省教育廳產(chǎn)學(xué)研基地項(xiàng)目（黔教合KY字[2012]033號(hào)）；貴陽(yáng)市科技局現(xiàn)代藥業(yè)計(jì)劃（筑科合同[2012204]31號(hào)）

劉志剛（1976—），男（漢），副教授，博士，主要從事食品質(zhì)量安全與藥物分析研究工作。