碳青霉烯類抗生素親水作用色譜方法研究及其應(yīng)用

朱銀芳， 紀(jì)順利， 李紹輝， 李 成， 章飛芳* ， 梁鑫淼，2

（1. 華東理工大學(xué)，上海200237；2. 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，遼寧 大連116023）

碳青霉烯類抗生素屬于非典型β-內(nèi)酰胺類抗生素，對大多數(shù)革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌具有廣譜抗菌活性［1-3］。該類抗生素通過與青霉素結(jié)合蛋白（PBPs）結(jié)合而抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，從而發(fā)揮抗菌作用。在臨床上，被廣泛用于各種嚴(yán)重細(xì)菌感染的治療，如腹內(nèi)、泌尿道、下呼吸道或皮膚感染等，市場前景良好［1-3］。然而抗生素類藥物的大量使用，不僅會使細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)，還會對環(huán)境生態(tài)和人類健康產(chǎn)生影響。有必要發(fā)展該類抗生素的快速、靈敏的分析方法。

目前國內(nèi)外已有很多關(guān)于碳青霉烯類抗生素的分析研究，主要包括生物基質(zhì)和藥物制劑中該類抗生素的含量測定及其質(zhì)量控制［4-7］。文獻(xiàn)報(bào)道的碳青霉烯類抗生素的分析方法包括反相色譜法（RPHPLC）［8-12］、液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）［13-15］、毛細(xì)管電泳法（CE）［16，17］和微生物學(xué)測定法［18］等。其中，RP-HPLC 是碳青霉烯類抗生素最常用的分析方法，但該模式常常需要使用高濃度磷酸鹽或醋酸鈉緩沖液作為流動相添加劑，這些不揮發(fā)性無機(jī)鹽與質(zhì)譜不兼容，故所發(fā)展方法無法與質(zhì)譜聯(lián)用。這就難以滿足某些痕量抗生素殘留檢測的需求。

1990 年Alpert 首次提出的親水作用色譜（HILIC）特別適合用來分離極性或堿性化合物［19］。隨著HILIC 的發(fā)展，它已被廣泛應(yīng)用于許多領(lǐng)域，如代謝組學(xué)研究［20，21］、藥品及其雜質(zhì)分析［22］和二維液相色譜分析［23，24］等。盡管如此，親水作用色譜法應(yīng)用于碳青霉烯類抗生素分析的文獻(xiàn)報(bào)道非常有限［25，26］。因此，本文系統(tǒng)考察了乙腈比例、緩沖鹽濃度和pH對4 種碳青霉烯類抗生素（比阿培南、美羅培南、多利培南、厄他培南）在XAmide 色譜柱上保留的影響，建立了測定尿液和自來水中4 種碳青霉烯類抗生素的HILIC 分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters Alliance 高效液相色譜儀（美國Waters公司），包括e2695 分離單元（自動進(jìn)樣器、在線脫氣器和四元泵）、2489 紫外檢測器；Milli-Q 純水凈化系統(tǒng)（美國Millipore 公司）；KH5200B 型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；pH 計(jì)（美國Mettler Toledo 公司）。

比阿培南、多利培南、美羅培南和厄他培南標(biāo)準(zhǔn)品（沈陽東北制藥總廠），于-70 ℃避光保存，其結(jié)構(gòu)如圖1 所示；乙腈（ACN）（HPLC 級，北京百靈威科技有限公司）；甲酸銨（HCOONH4）和甲酸（HCOOH）（純度分別為99% 和98%，美國Acros 公司）。實(shí)驗(yàn)中所用試劑至少為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q 純水凈化系統(tǒng)制備的超純水（電阻率18.2 MΩ·cm）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取4 種碳青霉烯類抗生素標(biāo)準(zhǔn)品適量，用水溶解并配制成1 g／L 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，分裝在冷凍管中，于-70 ℃冰箱中避光保存?zhèn)溆?。使用時(shí)待室溫融化后稀釋至所需濃度。準(zhǔn)確移取適量的4種抗生素標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用起始流動相配制成10 mg／L 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，于4 ℃下避光保存。用起始流動相逐級稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲備液，配制0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10、25、50、100 和250 mg／L 系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4 ℃避光保存。根據(jù)文獻(xiàn)［4］報(bào)道，該類抗生素由于其結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)β-內(nèi)酰胺環(huán)，在水溶液中不穩(wěn)定，且對光照和溫度敏感，易發(fā)生降解，故將其低溫避光保存。

圖1 4 種碳青霉烯類抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of the four carbapenems

1.3 色譜條件

色譜柱：XAmide 色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm，華譜新創(chuàng)科技有限公司），柱溫：25 ℃；流速：1 mL／min；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：293 nm；分離條件：流動相A 為水，B 為乙腈，C 為0.1 mol／L 甲酸銨（pH＝5.4）；梯度洗脫程序：0 ～15 min，90% B ～60% B，10% C；15 ～17 min，60% B ～90% B，10% C。

1.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)及空白試驗(yàn)

選用不含有上述4 種抗生素的健康志愿者尿液及自來水樣品，分別添加兩個(gè)含量水平（5 mg／L 和25 mg／L）的各抗生素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，進(jìn)行回收率試驗(yàn)，每個(gè)濃度設(shè)5 個(gè)平行樣品。其中尿液樣品在3 500 r／min 轉(zhuǎn)速下離心10 min 后，取上清液進(jìn)行HPLC分析。實(shí)驗(yàn)中選取超純水為試樣，進(jìn)行空白試驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

主要考察了乙腈比例、緩沖鹽濃度和pH 對4種碳青霉烯類抗生素保留的影響。

2.1.1 乙腈比例的影響

在HILIC 中，乙腈通常為弱洗脫溶劑，而水則是強(qiáng)洗脫溶劑。因此，流動相中乙腈比例是影響目標(biāo)組分保留的重要因素之一。通過保持流動相中甲酸銨濃度和pH 不變，考察了流動相中乙腈比例對抗生素保留的影響。如圖2 所示，隨著乙腈濃度的增加4 種組分的保留均不斷增加，這與RPLC 模式下正好相反，表明4 種抗生素在XAmide 色譜柱上的保留屬于典型的HILIC 保留機(jī)理。綜合分析時(shí)間、保留強(qiáng)度和對稱因子，選擇乙腈比例為0 ～5 min，80% ～65% ACN；5 ～12 min，65% ACN；12～14 min，65% ～80% ACN 以進(jìn)行后續(xù)研究。

圖2 乙腈體積分?jǐn)?shù)對保留的影響Fig.2 Effect of ACN volume percentage on the retention

為深入理解碳青霉烯類抗生素在XAmide 色譜柱上的親水保留行為，特考察如下：根據(jù)色譜分離中描述分配機(jī)理的理論方程（1）［27］和描述吸附機(jī)理的理論方程（2）［28，29］以及盧佩章等提出的液-固色譜保留值方程（3）［30，31］，對流動相中不同水含量條件下各個(gè)抗生素的保留因子（k）和水含量進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

方程（1）中，k 為溶質(zhì)保留因子，CB為流動相中水相的體積分?jǐn)?shù)，kw是弱洗脫溶劑為流動相時(shí)的溶質(zhì)保留因子，S 是一個(gè)依賴于溶質(zhì)和實(shí)驗(yàn)條件的常數(shù)；方程（2）中，k 為溶質(zhì)保留因子，kB是流動相采用強(qiáng)洗脫溶劑時(shí)的溶質(zhì)保留因子，AS和nB的比值為一常數(shù)，CB為流動相中水相體積分?jǐn)?shù)；方程（3）中，k 為溶質(zhì)保留因子，CB為流動相中水相的體積分?jǐn)?shù)，a、b 和c 是常數(shù)。從表1 中數(shù)據(jù)可見，4 種抗生素采用方程（3）得到的線性相關(guān)系數(shù)更高，這表明吸附機(jī)理在分離中起主導(dǎo)作用。

2.1.2 鹽濃度的影響

HILIC 流動相中通常加入一些揮發(fā)性緩沖鹽（甲酸銨或乙酸銨）以改善保留和峰形。保持乙腈比例和pH 不變，考察流動相中甲酸銨濃度的影響，如圖3 所示。隨著甲酸銨濃度的升高，美羅培南的保留先減弱后增加，多利培南和比阿培南的保留有增強(qiáng)的趨勢，總的來說，上述3 種抗生素的保留基本不變；而厄他培南隨著鹽濃度的升高保留減弱。緩沖鹽濃度的升高對保留主要有兩方面的影響：一是溶質(zhì)和固定相表面酰胺基和殘余的硅醇基之間的離子相互作用會受到干擾，導(dǎo)致離子交換對保留行為的影響降低，保留減弱；二是使固定相表面的富水層的親水作用（極性）增強(qiáng)，因而對溶質(zhì)的保留增強(qiáng)。因此，多利培南和比阿培南主要受第二種作用的影響，美羅培南受兩方面的綜合影響，而厄他培南主要受第一種作用的影響。此外，比阿培南、多利培南和美羅培南的保留隨鹽濃度的升高變化趨勢不明顯，這可能是因?yàn)榧姿徜@對離子交換作用的干擾減弱了甲酸銨對溶質(zhì)保留的影響。甲酸銨的存在可有效改善峰形，特別是美羅培南的峰形（美羅培南拖尾比較嚴(yán)重）。綜合考慮對稱因子和分離度，選擇在流動相中加入10% （v／v）的0.1 mol／L 甲酸銨。

圖3 鹽濃度對保留的影響Fig.3 Effect of salt concentration on the retention

表1 4 種抗生素在XAmide 色譜柱上基于不同回歸方程的回歸參數(shù)Table 1 Regression parameters of the four carbapenems on XAmide column based on different equations

2.1.3 緩沖鹽pH 的影響

圖4 是緩沖鹽pH 值對4 種抗生素在XAmide色譜柱上保留的影響。新配制的甲酸銨（0.1 mol／L）的pH 值約為6.25，使用甲酸調(diào)節(jié)pH 值從3.0 到6.0。可以看出，緩沖鹽pH 對4 種抗生素的保留影響較大。隨著緩沖鹽pH 的升高，4 種抗生素的保留呈現(xiàn)出先增強(qiáng)后減弱的趨勢，尤其是厄他培南趨勢最明顯。這可能是由于隨著pH 逐漸升高，填料表面由于酰胺基和殘余硅醇基存在而使凈的負(fù)電荷增多，與目標(biāo)樣品之間的靜電吸引作用加強(qiáng)最終導(dǎo)致分析物的保留增強(qiáng)。但與此同時(shí)，pH 升高也會抑制抗生素的解離。一方面，物質(zhì)的離子狀態(tài)比分子狀態(tài)更有利于保留；另一方面，抑制抗生素的解離也會減弱與固定相之間的靜電作用。而低pH 條件下，這種作用對抗生素解離的影響不大，在圖中表現(xiàn)為保留增強(qiáng)；較高pH 條件下，對抗生素的解離影響較大，在圖中呈現(xiàn)出保留減弱的趨勢。綜合考慮選擇pH 5.4 的緩沖鹽溶液。

圖4 緩沖液pH 對保留的影響Fig.4 Effect of buffer pH on the retention

2.2 方法的線性范圍、定量限和精密度

在優(yōu)化條件下的典型色譜圖如圖5 所示。4 種抗生素的出峰順序與其極性順序相匹配，進(jìn)一步印證了HILIC 的保留機(jī)理。在優(yōu)化條件下考察了4 種抗生素的線性范圍和定量限，具體數(shù)據(jù)見表2?？梢钥闯?，4 種抗生素的峰面積y 與其質(zhì)量濃度x（mg／L）存在良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)（R2）均在0.999 以上。4 種抗生素的定量限范圍為0.1～0.5 mg／L。同一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6 次，測得日內(nèi)精密度（RSD）小于3.5%。

圖5 4 種碳青霉烯類抗生素的典型色譜圖Fig.5 Typical chromatogram of the four carbapenems

表2 4 種抗生素的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)和定量限（n＝3）Table 2 Linear ranges，regression equations，correlation coefficients and limits of quantitation （LOQs）of the four carbapenems （n＝3）

2.3 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

為驗(yàn)證所發(fā)展方法的實(shí)用性，進(jìn)行了尿液和自來水中4 種抗生素的加標(biāo)回收率試驗(yàn)。對于尿液樣品，在5 mg／L 和25 mg／L 兩個(gè)加標(biāo)水平進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，所得回收率為100.4% ～111.9%，RSD＜1%。對于自來水樣品，在5 mg／L 和25 mg／L 兩個(gè)加標(biāo)水平所得回收率為79.6% ～107.4%，RSD ＜5%。

3 結(jié)論

本文建立了同時(shí)測定人尿液和自來水中4 種碳青霉烯類抗生素的HILIC 分析方法。通過優(yōu)化分離條件，4 種抗生素均得到了基線分離，且可在15 min 內(nèi)完成分離；結(jié)果表明4 種抗生素在XAmide色譜柱上的保留以吸附為主，符合典型HILIC 機(jī)理。本方法所使用的流動相與質(zhì)譜兼容，因此可拓展用于HILIC-MS 聯(lián)用技術(shù)實(shí)現(xiàn)對痕量抗生素的測定。這方面的工作尚在進(jìn)行中。

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