重組乳酸克魯維酵母產磷脂酶A2發(fā)酵條件的優(yōu)化

王 輝，張 梁,*，李由然，顧正華，丁重陽，石貴陽，陳國安，楊盛榮

（1.江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122；3.無錫江大百泰科技有限公司，江蘇 無錫 214122）

重組乳酸克魯維酵母產磷脂酶A2發(fā)酵條件的優(yōu)化

王 輝1,2，張 梁1,2,*，李由然2，顧正華2，丁重陽2，石貴陽2，陳國安3，楊盛榮3

（1.江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122；3.無錫江大百泰科技有限公司，江蘇 無錫 214122）

利用重組乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）GG799表達磷脂酶A2，對其產酶發(fā)酵條件進行研究。采用單因素試驗和正交試驗對培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，確定了重組菌產酶的最佳發(fā)酵條件。結果表明：最優(yōu)培養(yǎng)基組成為葡萄糖30 g/L、酵母粉20 g/L、蛋白胨30 g/L、Kh2PO43 g/L；最優(yōu)培養(yǎng)條件為：發(fā)酵溫度30 ℃、接種量2%（V/V）、初始ph 7.0、裝液量90 mL/250 mL三角瓶、搖床轉速220 r/min，在此條件下發(fā)酵培養(yǎng)，酶活力由（1.87±0.12）U提高到（5.35±0.27）U。

乳酸克魯維酵母；磷脂酶A2；發(fā)酵

磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2，EC 3.1.1.4）廣泛存在于各種生物組織中，它可催化磷脂甘油分子二位酰基水解生成溶血卵磷脂和游離脂肪酸，而溶血卵磷脂比磷脂具有更高的親水性[1-2]。磷脂酶A2可以廣泛應用于食品、化妝品及醫(yī)藥等領域中，如面包制作、蛋黃改性以及植物油脫膠等[3-4]。早期，磷脂酶A2可以從一些哺乳動物的胰腺組織中提取，但是來源少，提取過程復雜且成本較高[5]。

目前，對于磷脂酶A2的研究主要集中在哺乳動物磷脂酶A2基因（pla2）的重組表達方面[6-7]，但存在易形成包涵體，表達量低以及宿主無法完成復雜的哺乳動物重組蛋白后加工等問題[3,8-10]，同時，宿主菌的遺傳背景是否安全也影響著重組磷脂酶A2在食品等領域的應用。另外，據報道，由于磷脂酶A2對磷脂的水解作用，因此，可能會對大腸桿菌等宿主菌有毒害作用[6,11]。乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）是美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration，FDA）認定為GRAS（generally regarded as safe）的微生物，具有良好的外源蛋白分泌性能以及高密度發(fā)酵的特點，相對于其他表達宿主菌，對于外源蛋白的重組表達具有很大的優(yōu)勢[12]。近年來，乳酸克魯維酵母在食品領域已成功用于凝乳酶的重組表達[13]，在醫(yī)藥領域也已成功實現了人血清白蛋白、白細胞介素的重組表達[14-15]，因此，乳酸克魯維酵母在實現外源蛋白的表達及應用等方面具有巨大的潛力。

本實驗室前期已成功實現了原核微生物Lactobacillus casei DSM20011 pla2基因在乳酸克魯維酵母GG799中的分泌表達。因此，本實驗在此基礎上對乳酸克魯維酵母重組表達磷脂酶A2的發(fā)酵條件進行優(yōu)化研究，以提高重組酶產量及活性，降低生產成本，為工業(yè)化生產提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）重組菌株GG799/pKLAC1-pla2由糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室前期構建并保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基組成：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母粉10 g/L、瓊脂20 g/L；種子液培養(yǎng)基組成：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母粉10 g/L，ph 7.0；發(fā)酵培養(yǎng)基組成：葡萄糖30 g/L、酵母粉20 g/L、蛋白胨30 g/L、Kh2PO43 g/L，ph 7.0。

1.1.3 試劑

卵磷脂 Acros公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

hyL-C組合式搖床 太倉市強樂實驗設備有限公司；生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；電子滴定儀上海羽通儀器儀表廠；水浴恒溫振蕩器 太倉市醫(yī)療器械廠；可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

從甘油保藏管取一定量的菌液，在固體培養(yǎng)基上劃線轉接，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d后，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 種子液制備

將活化的菌種接入裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在振蕩培養(yǎng)箱中30 ℃、250 r/min培養(yǎng)22 h，作為種子液。

1.3.3 菌體生物量測定

生物量以菌體干質量表示，取發(fā)酵液于12 000 r/min離心5 min，棄上清液，無菌水重新懸浮菌體，反復3 次，菌體75 ℃烘箱烘至恒質量，稱質量。

1.3.4 酶活力的測定

酶活力的測定[16]：采用酸堿滴定法測定磷脂酶A2酶活力，取1 mL酶液加入9 mL用Tris-HCl（50 mmol/L，ph 8.0）配制的含質量分數4%的卵磷脂、體積分數1%的Triton X-100、30 mmol/L CaCl2的反應體系中，37 ℃、200 r/min準確反應15 min，反應完成后加入10 mL無水乙醇終止反應，生成的游離脂肪酸用20 mmol/L的NaOh滴定。酶活力單位（U）定義：1 mL酶液1 min催化卵磷脂生成1 μmol游離脂肪酸定義為一個酶活力單位。

1.3.5 單因素試驗

1.3.5.1 不同碳源對菌體生長及產酶的影響

在初始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎上，分別以乳糖、半乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘油、麥芽糖和糊精為唯一碳源，添加量均為20 g/L，以酵母粉和蛋白胨為氮源，添加量分別為10 g/L和20 g/L，于ph 7.0、30 ℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)72 h，測定菌體生物量及發(fā)酵上清磷脂酶A2酶活性。

1.3.5.2 碳源添加量對菌體生長及產酶的影響

以酵母粉、蛋白胨為氮源，添加量分別為10 g/L和20 g/L，葡萄糖為碳源，添加量分別為10、15、20、25、30、40 g/L，于ph 7.0、30 ℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)72 h，測定菌體生物量及發(fā)酵上清磷脂酶A2酶活性。

1.3.5.3 不同氮源對菌體生長及產酶的影響

以葡萄糖為碳源，添加量為20 g/L ，分別以魚粉蛋白胨、酵母粉、蛋白胨、蛋白胨+酵母粉（2∶1，m/m）、牛肉浸膏、硝酸鈉和氯化銨為氮源，添加量為30 g/L，于ph 7.0、30 ℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)72 h，測定菌體生物量及發(fā)酵上清磷脂酶A2酶活性。

1.3.5.4 氮源質量配比對菌體生長及產酶的影響

以葡萄糖為碳源，添加量為20 g/L，以酵母粉和蛋白胨為復合氮源，添加量為30 g/L，添加質量比例分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、2∶1、2∶3，于ph 7.0、30 ℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)72 h，測定菌體生物量及發(fā)酵上清磷脂酶A2酶活性。

1.3.5.5 無機鹽對菌體生長及產酶的影響

以酵母粉和蛋白胨為復合氮源，添加量為30 g/L，添加質量比例為1∶2，分別以Kh2PO4、MgCl2、MnCl2、ZnCl2、FeCl2、NaCl、NiCl2和CaCl2為唯一無機鹽，于ph 7.0、30 ℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)72 h，測定菌體生物量及發(fā)酵上清磷脂酶A2酶活性。

1.3.5.6 Kh2PO4添加量對菌體生長及產酶的影響

以Kh2PO4為無機鹽，添加量分別為0.1、1.0、3.0、5.0、8.0、10.0 g/L，于ph 7.0、30 ℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)72 h，測定菌體生物量及發(fā)酵上清磷脂酶A2酶活性。

1.3.5.7 培養(yǎng)溫度對菌體生長及產酶的影響

在已優(yōu)化的培養(yǎng)基成分基礎上，250 mL搖瓶裝50 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度分別為24、27、30、33 ℃，于ph 7.0、200 r/min搖瓶培養(yǎng)72 h，測定菌體生物量及發(fā)酵上清磷脂酶A2酶活性。

1.3.5.8 接種量對菌體生長及產酶的影響

培養(yǎng)溫度30 ℃，接種量（V/V）分別為1%、2%、3%、4%、5%，于ph 7.0、200 r/min搖瓶培養(yǎng)72 h，測定菌體生物量及發(fā)酵上清磷脂酶A2酶活性。

1.3.5.9 初始ph值對菌體生長及產酶的影響

接種量2%，調節(jié)培養(yǎng)基初始ph值分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0，于30 ℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)72 h，測定菌體生物量及發(fā)酵上清磷脂酶A2酶活性。

1.3.5.10 裝液量對菌體生長及產酶的影響

調整250 mL搖瓶中培養(yǎng)基裝液量分別為40、50、60、70、80 mL，于ph 7.0、30 ℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)72 h，測定菌體生物量及發(fā)酵上清磷脂酶A2酶活性。

1.3.5.11 搖床轉速對菌體生長及產酶的影響

裝液量為70 mL，調節(jié)搖床轉速分別為140、160、180、200、220、240 r/min，于ph 7.0、30 ℃、搖瓶培養(yǎng)72 h，測定菌體生物量及發(fā)酵上清磷脂酶A2酶活性。

1.3.6 正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上，以葡萄糖添加量、酵母粉添加量、蛋白胨添加量、Kh2PO4添加量、接種量和裝液量為自變量，以PLA2酶活力為指標，進行L18（37）正交試驗，其中設置一個空列項。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 不同碳源對菌體生長及產酶的影響

圖1 不同碳源對重組菌生長及產酶的影響Fig.1 Effect of different carbon sources on cell growth and PLA2activity

由圖1可知，不同碳源對重組菌的產酶和生長影響較大，糊精不利于重組酵母的生長和產酶，這主要與其作為碳源較難被酵母吸收利用有關；當碳源為蔗糖、甘油和麥芽糖時重組酵母雖然生長較好，但產酶能力較乳糖、半乳糖和葡萄糖為碳源時低，這主要是因為碳源不僅會影響乳酸克魯維酵母的生長代謝，而且會影響該過程蛋白質的分泌，適宜的碳源有利于重組菌外源蛋白的表達[17]。因為葡萄糖為碳源時酶活性最高，故選取葡萄糖為發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源。

2.1.2 碳源添加量對菌體生長及產酶的影響

圖2 碳源質量濃度對重組菌生長及產酶的影響Fig.2 Effect of carbon source concentration on cell growth and PLA2activity

由圖2可知，當碳源添加量為10 g/L時，不利于菌體的生長繁殖，菌體量及產酶量均很低。隨著碳源質量濃度的增加，菌體量及產酶量也隨之增加，但當碳源質量濃度高于25 g/L時，重組菌的產酶量有所下降，這可能是因為較高質量濃度的碳源對微生物生長有抑制作用，延長發(fā)酵周期，不利于發(fā)酵產物的積累[18]。當碳源質量濃度為20 g/L時，重組菌產酶量最大，故選取發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源的質量濃度為20 g/L。

2.1.3 不同氮源對菌體生長及產酶的影響

圖3 不同氮源對重組菌生長及產酶的影響Fig.3 Effect of different nitrogen sources on cell growth and PLA2activity

由圖3可知，有機氮源對菌體的生長和產酶都較為有利，而重組菌對無機氮源的利用較差，復合氮源條件下，菌株生長和產酶均高于單一氮源，這主要是因為氮源能夠影響酵母重組蛋白的表達，而且酵母粉可以提高外源蛋白的分泌量和積累量[19]，當蛋白胨和酵母粉同時作為氮源時酶活性最高，因此，選取蛋白胨和酵母粉復合氮源作為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源。

2.1.4 復合氮源質量配比對菌體生長及產酶的影響

圖4 氮源質量配比對重組菌生長及產酶的影響Fig.4 Effect of nitrogen source concentration on cell growth and PLA2activity

由圖4可知，復合氮源酵母粉和蛋白胨以不同的質量比例加入發(fā)酵培養(yǎng)基中時，對菌體的生長量影響較小，當m（酵母粉）∶m（蛋白胨）＝2∶3時最不利于重組菌產酶，這可能是因為不同的氮源比例可以通過菌體代謝影響發(fā)酵培養(yǎng)基的ph值，從而影響代謝產物的形成[20]。當m（酵母粉）∶m（蛋白胨）＝1∶2時，重組菌產酶量最高，故選取酵母粉和蛋白胨的添加比例為1∶2。

2.1.5 無機鹽對菌體生長及產酶的影響

圖5 無機鹽對重組菌生長及產酶的影響Fig.5 Effect of different mineral salts on cell growth and PLA2activity

由圖5可知，ZnCl2和FeCl2的加入有利于菌體的生長，而Kh2PO4的加入對菌體的生長影響不大，但卻對重組菌產酶能力有促進作用，這可能是因為無機鹽如MgCl2、Kh2PO4等主要參與一些酶的組成成分，對維持酶的活性等有重要作用[21]。因此，選取Kh2PO4作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的無機鹽。

2.1.6 無機鹽添加量對菌體生長及產酶的影響

圖6 無機鹽添加量對重組菌生長及產酶的影響Fig.6 Effect of mineral salt concentration on cell growth and PLA2activity

由圖6可知，當Kh2PO4的添加量為5.0 g/L時，菌體生物量最高，說明該添加量下有利于菌體的生長，而添加量為1.0 g/L時，酶活力最高，故發(fā)酵培養(yǎng)基中無機鹽的添加量為1.0 g/L。

2.1.7 接種量對菌體生長及產酶的影響

圖7 接種量對重組菌生長及產酶的影響Fig.7 Effect of inoculum amount on cell growth and PLA2activity

由圖7可知，接種量為1%時，不利于重組菌的產酶，但當接種量達到3%及以上時，重組菌產酶能力下降，這是因為接種量可以影響微生物生長的延遲期，接種量過小，菌體不足，延遲期較長；接種量過大，菌體繁殖快，由于培養(yǎng)基營養(yǎng)物質消耗過快，不利于微生物的持續(xù)生長，并進而影響產物的合成[22]。接種量為2%時，酶活力最高，選取發(fā)酵培養(yǎng)基的接種量為2%。

2.1.8 培養(yǎng)溫度對菌體生長及產酶的影響

圖8 培養(yǎng)溫度對重組菌生長及產酶的影響Fig.8 Effect of cultivation temperature on cell growth and PLA2activity

由圖8可知，在所選溫度條件下，重組菌的生長量基本不受影響，但在24、33 ℃條件下酶活性較低，這可能是因為溫度過低會減緩菌株的生長代謝，而過高會影響重組酶的穩(wěn)定性以及后續(xù)的加工過程[23]，這些均不利于重組菌產酶。當溫度為30 ℃時，酶活力最高，故選取的發(fā)酵培養(yǎng)溫度為30 ℃。

2.1.9 初始ph值對菌體生長及產酶的影響

圖9 初始pH值對重組菌生長及產酶的影響Fig.9 Effect of initial pH on cell growth and PLA2activity

由圖9可知，重組菌對ph值的耐受范圍較廣，在所選ph值范圍內菌株生長基本不受影響，當培養(yǎng)基初始ph值為8時，酶活性較其他ph值條件下的低，這可能是因為在酵母發(fā)酵培養(yǎng)過程中，不同ph值對其分泌的蛋白酶活性影響不同，培養(yǎng)基中蛋白酶活性高時，可能會對重組酶產生降解，進而影響其活性[24]。ph值為7.0時，有利于產酶，此條件下酶活性最高，因此，調節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基初始ph值為7.0。

2.1.10 裝液量對菌體生長及產酶的影響

由圖10可知，裝液量對菌株生長及產酶均有影響，且對產酶影響較大。當裝液量為40 mL/250 mL搖瓶時，不利于重組菌產酶，隨著裝液量的增加，酶活力逐漸提高，而裝液量增加到80 mL/250 mL搖瓶時，酶活力降低，這可能是因為裝液量影響酵母發(fā)酵過程的溶氧，從而影響菌體對營養(yǎng)物質的吸收利用以及代謝產物的形成[25]。當裝液量為70 mL/250 mL搖瓶時，酶活力達到最高。因此，選取搖瓶裝液量為70 mL/250 mL搖瓶。

圖10 裝液量對重組菌生長及產酶的影響Fig.10 Effect of medium volume on cell growth and PLA2activity

2.1.11 搖床轉速對菌體生長及產酶的影響

圖11 搖床轉速對重組菌生長及產酶的影響Fig.11 Effect of shaking speed on cell growth and PLA2activity

由圖11可知，當搖床轉速為140 r/min時，酶活力較低，隨著搖床轉速的提高，菌體生物量以及酶活力均逐漸增加，這可能是因為當裝液量一定時，轉速過低，發(fā)酵過程溶氧不足，影響菌體生長以及發(fā)酵周期[26]，而當搖床轉速達到240 r/min時酶活性有所下降，這可能是轉速過快加快了發(fā)酵過程中營養(yǎng)物質的揮發(fā)損失，從而影響了重組菌的產酶。當轉速達到220 r/min時，重組菌酶活力最高，故選取搖床轉速為220 r/min。

2.2 正交試驗分析

根據正交設計原理以及發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的單因素試驗結果，采用L18（37）進行六因素三水平的正交試驗，試驗結果與方差分析見表1、2。

由表1極差分析可知，各因素對重組菌發(fā)酵酶活力的影響大小為：Kh2PO4添加量＞葡萄糖添加量＞裝液量＞酵母粉添加量＞接種量＞蛋白胨添加量，比較每個因素的3 個不同水平，并考慮實際的取值情況，得到最佳組合為A2B3C3D3E2F3。

由表2方差分析可知，葡萄糖及Kh2PO4對重組菌產酶影響顯著，因此，由正交試驗得到了最佳發(fā)酵條件，即各因素添加量為葡萄糖30 g/L、酵母粉20 g/L、蛋白胨30 g/L、Kh2PO43 g/L、接種量2%以及裝液量90 mL/ 250 mL搖瓶。在該條件下進行驗證實驗，重組酶酶活力達到（5.35±0.27） U。

表1 正交試驗設計方案及結果Table 1 Orthogonal array design with experimental results

表2 正交試驗結果方差分析Table 2 Analysis of variance of the experimental results of orthogonal array design

3 結 論

對重組菌K. lactis GG799/pKLAC1-pla2產磷脂酶A2培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化。得到的最佳產酶發(fā)酵條件為：葡萄糖30 g/L、酵母粉20 g/L、蛋白胨30 g/L、Kh2PO43 g/L、培養(yǎng)溫度30 ℃、初始ph 7.0、接種量2%（V/V）、裝液量90 mL/250 mL搖瓶、轉速220 r/min。優(yōu)化后酶活力由（1.87±0.12） U提高到（5.35±0.27） U，高于已報道的利用大腸桿菌和曲霉表達系統(tǒng)得到的PLA2酶活性[8,27]，為進一步的規(guī)?；a提供理論依據。

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Optimization of Fermentation Conditions for the Production of Phospholipase A2by Recombinant Kluyveromyces lactis

wANG hui1,2, ZHANG Liang1,2,*, LI Youran2, GU Zhenghua2, DING Zhongyang2, SHI Guiyang2, ChEN Guoan3, YANG Shengrong3
(1. Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China; 2. National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China; 3. Wuxi Jiangda Baitai Technology Co. Ltd., Wuxi 214122, China)

Fermentation conditions for the production of phospholipase A2(PLA2) by recombinant Kluyveromyces lactis GG799 were optimized using single factor and orthogonal design experiments. The optimal fermentation medium was composed of 30 g/L glucose, 20 g/L yeast extract, 30 g/L peptone and 3 g/L KH2PO4. The best fermentation conditions were determined as 30 ℃,2%, 7.0, 90 mL and 220 r/min for temperature, inoculum amount, initial pH, medium volume in a 250 mL flask and shaking speed, respectively, resulting in an increase of PLA2activity from (1.87±0.12) U to (5.35±0.27) U.

Kluyveromyces lactis; phospholipase A2; fermentation

Q939.97

A

1002-6630（2015）21-0111-06

10.7506/spkx1002-6630-201521022

2015-02-13

國家高技術研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2011AA100905）；江蘇省“六大人才高峰”計劃項目（2012-NY-002）

王輝（1988—），男，碩士研究生，研究方向為工業(yè)微生物學與酶工程。E-mail：wanghui8753@126.com

*通信作者：張梁（1978—），男，教授，博士，研究方向為酶制劑和生物能源。E-mail：zhangl@jiangnan.edu.cn