?；撬嵬ㄟ^激活PI3K/Akt信號通路抑制高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡

梁棟 劉云峰 章毅 尹建紅 許林鑫 楊靜

論著

?；撬嵬ㄟ^激活PI3K/Akt信號通路抑制高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡

梁棟 劉云峰 章毅 尹建紅 許林鑫 楊靜

目的 探討?；撬釋Ω咛钦T導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響及其信號途徑。方法 取健康產(chǎn)婦分娩后12 h內(nèi)的臍帶分離人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC），進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)并分為5組：正常葡萄糖組（5 mmol/LD-葡萄糖，NG組）；高糖組（30 mmol/LD-葡萄糖，HG組）；NG+TAU組（5 mmol/LD-葡萄糖 +5 mmol/L?；撬幔?；HG+TAU組（30 mmol/L D-葡萄糖+5 mmol/L?；撬幔籋G+TAU+Wo組（30 mmol/L D-葡萄糖+5 mmol/L?；撬?50 nmol/Lwortmannin）。干預(yù)48 h后應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況，Western印跡檢測磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）蛋白的表達(dá)水平，2，7-二氯二氫熒光素二乙酯（H2DCF-DA）探針技術(shù)及熒光倒置顯微鏡檢測活性氧簇的相對含量。結(jié)果 與NG組相比，HG組細(xì)胞的凋亡率顯著增加（P＜0.05）。與HG組相比，HG+TAU組的凋亡率下降（P＜0.05）。與HG+TAU組相比，HG+TAU+Wo組的凋亡率較高（P＜0.05）。與NG組相比，HG組磷酸化-Akt蛋白表達(dá)下降（P＜0.05）。與HG組比較，HG+TAU組磷酸化-Akt蛋白表達(dá)增加（P＜0.05）。與HG+TAU組相比，HG+TAU+Wo組磷酸化-Akt蛋白表達(dá)下降（P＜0.05）。?；撬峥山档透咛钦T導(dǎo)的活性氧簇生成（P＜0.05），這一作用亦可被wortmannine所阻斷（P＜0.05）。結(jié)論 ?；撬嵬ㄟ^PI3K/Akt信號途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)活性氧簇生成，進(jìn)而在高糖環(huán)境下發(fā)揮其抗凋亡作用。

?；撬?；內(nèi)皮細(xì)胞；磷脂酰肌醇3激酶；蛋白激酶B；細(xì)胞凋亡

2型糖尿病發(fā)病率顯著增加并逐漸成為一個公共健康問題，給社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來沉重負(fù)擔(dān)[1]。高血糖是糖尿病血管病變的高危因素，而后者是糖尿病患者的主要死因[2]。內(nèi)皮細(xì)胞功能受損及活性下降在很大程度上導(dǎo)致動脈粥樣硬化斑塊的形成。研究證實，高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡與升高的活性氧簇含量及隨后的多重信號系統(tǒng)的激活密切相關(guān)[3-4]。?；撬崾且环N含硫半必需氨基酸，參與多種生理功能的調(diào)節(jié)，有助于預(yù)防糖尿病、肥胖、脂代謝紊亂和高血壓的發(fā)生。研究報道，?；撬嶙鳛橐环N內(nèi)源性的抗氧化劑，通過一系列機制保護(hù)細(xì)胞（包括抗氧化、調(diào)節(jié)離子轉(zhuǎn)運、滲透壓等）。另有報道表明牛磺酸能夠預(yù)防高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，并且與削弱內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)活性氧簇形成相關(guān)，但其詳細(xì)的信號機制尚不明確[5-6]。有學(xué)者提出，?；撬峥赏ㄟ^調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶B（Akt/PKB）的磷酸化水平減少細(xì)胞內(nèi)活性氧簇的生成[7-8]。本研究擬進(jìn)一步證實在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，牛磺酸是否經(jīng)由調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Akt/PKB磷酸化水平而發(fā)揮其抗凋亡作用。

1 材料和方法

1.1 材料 牛磺酸購自Sigma公司。AnnexinV-FITC凋亡試劑盒購自BD公司?；钚匝醮貦z測試劑4，5-二氨基熒光素二乙酸酯（DAF-2DA）購自Cayman公司。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）特異性阻斷劑wortmannin購自Calbiochem公司。磷酸化-Akt（Ser473）抗體為Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品。Actin抗體購自NeoMarker公司。

1.2 方法

1.2.1 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）的分離培養(yǎng)取山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院產(chǎn)科健康產(chǎn)婦分娩后12 h內(nèi)的臍帶，依據(jù)文獻(xiàn)的方法分離HUVEC[9]。采用M199培養(yǎng)基，其中含10%FBS，青霉素100 IU/ml，鏈霉素0.1 μg/L，肝素 0.1 g/L，ECGS 75 mg/L。細(xì)胞在 37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時，用0.25%胰蛋白酶0.02%EDTA消化傳代。

1.2.2 實驗分組及干預(yù) 實驗分組如下：正常葡萄糖組（5 mmol/LD-葡萄糖，NG組）；高糖組（30 mmol/L D-葡萄糖，HG組）；NG+TAU組（5 mmol/LD-葡萄糖+5 mmol/L牛磺酸）；HG+TAU組（30 mmol/L D-葡萄糖+5 mmol/L?；撬幔?；HG+TAU+Wo組（30 mmol/L D-葡萄糖+5mmol/L?；撬?50nmol/Lwortmannin）；培養(yǎng)板中細(xì)胞融合至80%時用含1%FBS的M199培養(yǎng)基過夜同步。之后，各組不同因素干預(yù)48 h。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 HUVEC接種于6孔板，細(xì)胞同步后加上述不同因素處理，每組設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后棄培養(yǎng)液，胰酶消化后收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗2次，annexin-Ⅴ/PI雙染試劑盒染色，流式細(xì)胞儀定量分析。早期細(xì)胞凋亡率=早期凋亡細(xì)胞數(shù)/所測細(xì)胞總數(shù)×100%，實驗重復(fù)3次。

1.2.4 活性氧簇生成檢測 35 mm培養(yǎng)皿中細(xì)胞分組及干預(yù)同前。之后在正常葡萄糖濃度無酚紅培養(yǎng)液中，37℃細(xì)胞負(fù)載2，7-二氯二氫熒光素二乙酯（H2DCF-DA，5 μmol/L）30 min。PBS沖洗 3 次，避光。加入預(yù)熱的無酚紅培養(yǎng)基。熒光倒置顯微鏡觀察并攝片。ISO200，曝光時間1/4.5s，亮度、對比度固定。每樣品隨機選取4個視野，綠色熒光強度平均積分光密度使用Image Pro圖像分析軟件定量分析，實驗重復(fù)3次。

1.2.5 Western印跡分析 35 mm細(xì)胞培養(yǎng)板中細(xì)胞分組及干預(yù)同前。加入100 μl細(xì)胞裂解液裂解5min。收集細(xì)胞裂解液至1.5mlEP管中（4℃）。超聲3×5s，沸水中煮沸5min。10000r/min 離心（r=165mm）5min。BCA法檢測總蛋白含量。每樣品取30 μg，加等體積2×SDS上樣緩沖液，混勻，上樣。進(jìn)行SDS-PAGE分離蛋白（分離膠濃度10%）。之后轉(zhuǎn)至PVDF膜。室溫下，5%脫脂奶封閉液封閉1 h。1∶1 000的兔抗人磷酸化-Akt（Ser473）抗體 4℃過夜孵育。之后，1∶2 000的HRP-標(biāo)記的羊抗兔抗體室溫下孵育1h。ECL試劑盒孵育2min，X光片感光，顯影。應(yīng)用Image J圖像處理系統(tǒng)對膠片進(jìn)行掃描測量感光區(qū)帶的感光密度，并進(jìn)行積分處理，β-actin作為內(nèi)參，實驗重復(fù)3次，計算相對含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計學(xué)分析軟件，正態(tài)分布的計量資料以±s表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，檢驗水準(zhǔn)：α=0.05。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ?；撬釋Ω咛钦T導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響 與NG組相比，HG組細(xì)胞的凋亡率顯著增加（P＜0.05）；與HG組相比，HG+TAU組的凋亡率下降（P＜0.05）；與HG+TAU組相比，HG+TAU+Wo組的凋亡率較高（P＜0.05）。見圖1，表1。

2.2 ?；撬釋Ω咛钦T導(dǎo)的HUVEC磷酸化-Akt蛋白表達(dá)的影響 與NG組相比，HG組磷酸化-Akt蛋白表達(dá)下降（P＜0.05）；與HG組比較，HG+TAU組的磷酸化-Akt蛋白表達(dá)增加（P＜0.05）；與 HG+TAU組相比，HG+TAU+Wo組的磷酸化-Akt蛋白表達(dá)下降（P＜0.05），見圖2。

圖1 不同組別HUVEC的凋亡率比較

表1 不同組別HUVEC的凋亡率（±s，%）

表1 不同組別HUVEC的凋亡率（±s，%）

注：與 NG組相比，aP＜0.05；與 HG組相比，bP＜0.05；與HG+TAU組相比，cP＜0.05；HUVEC：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；NG組：正常葡萄糖組；HG組：高糖組；NG+TAU組：正常葡萄糖+牛磺酸組；HG+TAU組：高糖+牛磺酸組；HG+TAU+Wo組：高糖+?；撬?wortmannin組

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圖2 ?；撬釋Ω咛钦T導(dǎo)的HUVEC磷酸化-Akt蛋白表達(dá)的影響

2.3 ?；撬釋Ω咛钦T導(dǎo)的HUVEC活性氧簇生成的影響 與NG組相比，HG組活性氧簇生成增加（P＜0.05）；與HG組相比，HG+TAU組的活性氧簇生成下降（P＜0.05）；與HG+TAU組相比，HG+TAU+Wo組的活性氧簇生成增加（P＜0.05），見表3。

表3 各組活性氧簇?zé)晒鈴姸绕骄e分光密度（±s）

表3 各組活性氧簇?zé)晒鈴姸绕骄e分光密度（±s）

注：與 NG組相比，aP＜0.05；與 HG組比，bP＜0.05；與 HG+TAU組相比，cP＜0.05；NG組：正常葡萄糖組；HG組：高糖組；NG+TAU組：正常葡萄糖+?；撬峤M；HG+TAU組：高糖+?；撬峤M；HG+TAU+Wo組：高糖+?；撬?wortmannin組

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3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞作為一個重要的自分泌和旁分泌器官，通過調(diào)節(jié)血管張力，局部細(xì)胞生長和細(xì)胞外基質(zhì)沉積而維持血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是動脈粥樣硬化過程的起始步驟，也是啟動糖尿病大血管病變的重要環(huán)節(jié)[6]。糖尿病患者內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的主要特征為細(xì)胞增殖、屏障功能、循環(huán)細(xì)胞黏附能力的改變及凋亡的發(fā)生[10-11]。?；撬岵粌H參與維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，而且對多種組織細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用。研究顯示，口服?；撬崮芨纳奇滊遄艟卣T導(dǎo)的糖尿病模型鼠主動脈內(nèi)皮依賴的舒張功能。?；撬崮茱@著改善1型糖尿病模型鼠左室收縮及舒張功能，并伴隨Akt/PKB信號通路活性及超氧化物歧化酶、血紅素加氧酶-1蛋白水平的持續(xù)升高[7]。進(jìn)一步研究顯示，?；撬崮茴A(yù)防高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，其抗凋亡效應(yīng)與降低細(xì)胞內(nèi)活性氧簇和穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)鈣水平相關(guān)[5]。在內(nèi)皮細(xì)胞，Akt活化可激活內(nèi)皮型一氧化氮合酶，減少細(xì)胞內(nèi)活性氧簇的生成，發(fā)揮抗凋亡作用。還有學(xué)者證實，細(xì)胞內(nèi)鈣離子過多或細(xì)胞外鈣離子流入胞內(nèi)過多均可損傷細(xì)胞，而牛磺酸可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)、外鈣離子流動，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[12]。但牛磺酸是否可通過減少活性氧簇及Akt生成而發(fā)揮抗凋亡作用，目前尚無定論。

本研究以HUVEC為研究對象，結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率顯著高于NG組。與HG組相比，經(jīng)過?；撬崽幚淼膬?nèi)皮細(xì)胞凋亡率顯著下降，說明?；撬釋ρ軆?nèi)皮具有一定的保護(hù)作用。細(xì)胞中的Akt在無外來因素刺激時處于去磷酸化狀態(tài)，只有磷酸化-Akt才具有生物學(xué)特性，而高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡可能與絲裂原活化蛋白激酶信號途徑的激活及Akt磷酸化活性的減弱有關(guān)[13-14]。本研究顯示，高糖可下調(diào)HUVEC中磷酸化-Akt蛋白的表達(dá)水平，而牛磺酸可顯著增加高糖環(huán)境下磷酸化-Akt蛋白的表達(dá)，提示?；撬峥赡芡ㄟ^此途徑發(fā)揮抗凋亡作用。

活性氧簇是一種重要的細(xì)胞內(nèi)信使和氧化還原反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，研究發(fā)現(xiàn)在心血管疾病及神經(jīng)退行性疾病患者的細(xì)胞內(nèi)有過量的活性氧簇，當(dāng)活性氧簇產(chǎn)生過量或機體自身抗氧化能力被削弱時，將導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生?；钚匝醮乜赡苁翘悄虿〔l(fā)癥的元兇[15]。本研究觀察到與HG組相比，HG+TAU組活性氧簇的表達(dá)量顯著降低，提示?；撬峥赏ㄟ^下調(diào)活性氧簇含量，減少氧化應(yīng)激反應(yīng)而保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞。Wortmannin通過與 PI3K的催化亞單位p110結(jié)合，抑制PI3K活性，從而阻斷PI3K/Akt信號通路。本研究中，HG+TAU+Wo組細(xì)胞內(nèi)磷酸化-Akt的表達(dá)顯著下降，而活性氧簇含量顯著增加，說明?；撬峥赡芙?jīng)由PI3K/Akt信號途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)活性氧簇生成，進(jìn)而在高糖環(huán)境下發(fā)揮其抗凋亡作用。綜上所述，防止血管內(nèi)皮功能障礙對預(yù)防糖尿病血管病變的發(fā)生、改善糖尿病患者生活質(zhì)量至關(guān)重要，而?；撬嵩诒Ｗo(hù)血管內(nèi)皮并預(yù)防糖尿病方面的作用應(yīng)受到越來越多關(guān)注。

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Taurine inhibits endothelial cell apoptosis induced by high glucose through activating PI3K/Akt pathway

Liang Dong*，Liu Yunfeng，Zhang Yi，Yin Jianhong，Xu Linxin，Yang Jing.*Department of Endocrinology，The First Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

Yang Jing，Email：yangjlm@126.com

ObjectiveTo observe the effects and signalling pathway of taurine on high glucose induced endothelial apoptosis.MethodsThe umbilical cord from the healthy puerperal woman delivered in 12 hours was taken and the human umbilical vein endothelial cells（HUVECs）were isolated.HUVECs were cultured and divided into 5 groups：normal glucose group（5 mmol/L D-glucose,NG group），high glucose group（30 mmol/L D-glucose，HG group），NG+TAU group（5 mmol/L D-glucose+5 mmol/L taurine），HG+TAU group（30mmol/LD-glucose+5mmol/Ltaurine），HG+TAU+Wogroup（30 mmol/LD-glucose+5 mmol/Ltaurine+50 nmol/Lwortmannin）.After 48 hours，the apoptosis was tested byFlowCytometryand expressionofphosphorylated-protein kinase B（p-Akt）was examined by Western blot.At the same time，the relative content of reactive oxygen species（ROS） was tested by 2'-7'-Dichlorofluorescein diacetate（H2DCF-DA） probe technique and fluorescent inverted microscope.ResultsCompared with NG group，apoptosis rates in HG group were markedly enhanced（P＜0.05）.Compared with HG group，the apoptosis rates in HG+TAU group were decreased（P＜0.05）.Compared with HG+TAU group，apoptosis rates in HG+TAU+Wo group were increased（P＜0.05）.Compared with HG group，expression of p-Akt protein in NG+TAU group was increased（P＜0.05）.Compared with HG+TAU group，expression of p-Akt protein was reduced in HG+TAU+Wo group（P＜0.05）.Taurine could decrease the production of ROS induced by hyperglycemia（P＜0.05），and the effects were blocked by wortmannin（P＜0.05）.ConclusionsTaurine can regulate the generation of intracellular ROS by PI3K/Akt pathway，then prevent apoptosis of endothelial cell induced byhigh glucose.

Taurine；Endothelial cells；Phosphatidylinositol 3-kinase；Potein kinase B；Apoptosis

（Int J Endocrinol Metab，2015，35：73-76）

10.3760/cma.j.issn.1673-4157.2015.02.001

國家自然科學(xué)基金資助項目（81373464，812708822）；山西省自然科學(xué)基金資助項目（2013011047-3,2012011039-8）；山西省衛(wèi)生廳科研課題（201201062）；山西省回國留學(xué)人員科研資助項目（2013-111）；山西省留學(xué)人員擇優(yōu)啟動項目（2011-762,2013-68）；中華醫(yī)學(xué)會臨床醫(yī)學(xué)科研專項資金資助項目（13040440429）

030001 太原，山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院內(nèi)分泌科（梁棟，劉云峰，尹建紅，許林鑫，楊靜）；030001 太原，山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室（章毅）

楊靜，Email：yangjlm@126.com

2014-11-11）