美洲大蠊內(nèi)生菌的分離鑒定及酶活性、抑菌作用測定

阮傳清， 劉 波* ， 吳珍泉， 蘇明星， 蔡懷錦， 李 濤

(1．福建省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福建 福州 350003; 2.福建農(nóng)林大學 植物保護學院，福建 福州 350002)

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美洲大蠊內(nèi)生菌的分離鑒定及酶活性、抑菌作用測定

阮傳清1， 劉 波1*， 吳珍泉2， 蘇明星1， 蔡懷錦1， 李 濤2

(1．福建省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福建 福州 350003; 2.福建農(nóng)林大學 植物保護學院，福建 福州 350002)

分離美洲大蠊內(nèi)生細菌并測定菌體的淀粉、纖維素降解酶活性及抑菌特性。對蟲體表面消毒，以LB和高氏一號培養(yǎng)基分離蟲體內(nèi)部細菌并進行16S rRNA基因序列分析。變色圈法測定降解酶活性，抑菌圈法測定抑菌活性。結(jié)果共分離到11株細菌，4株屬于鏈霉菌屬(Streptomyces)，6株分別屬于腸桿菌屬(Enterbacter)、變形菌屬(Proteus)、腸球菌屬(Enterococcus)、沙雷氏菌屬(Serratia)、芽胞桿菌屬(Bacillus)和漫游球菌屬(Vagococcus)。另有1株菌在NCBI中與腸桿菌的相似度最高, 為95%，可能代表著一個潛在的新種。4株鏈霉菌均有淀粉和纖維素降解能力。有3株菌對青枯雷爾氏菌有抑制效果。研究結(jié)果表明，美洲大蠊內(nèi)生菌具有某些功能，甚至含有尚未發(fā)現(xiàn)的新菌種，是重要的菌種資源。

美洲大蠊；內(nèi)生菌；鏈霉菌；酶活性；抑菌作用

美洲大蠊(Periplanetaamericana(Linnaeus))屬蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲，俗稱蟑螂，是一種世界性衛(wèi)生害蟲，為我國南方室內(nèi)蜚蠊的優(yōu)勢種群[1]。該蟲食性雜，可咬壞衣物，傳播多種人、畜病原生物[2]。但它更是一種重要的藥材，《神農(nóng)本草經(jīng)》記載其“味咸、寒，生川澤，治血瘀堅、寒熱，破積聚、咽喉痹、內(nèi)寒無子”，《本草綱目》記載，干燥或新鮮全體入藥，有活血化瘀、解毒消疳、利水消腫等功效[3]。大量研究報道，美洲大蠊含有抗菌肽、P10蛋白、脂多糖結(jié)合蛋白、外源凝集素等多種活性物質(zhì)，可抑制多種細菌、真菌、病毒、原蟲，對多種癌細胞及動物實體瘤具有明顯的殺傷效果，且對正常細胞溫和[1,4]。除了藥用價值之外，美洲大蠊還因抗病力強，易飼養(yǎng)，富含蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸、微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)，被作為優(yōu)質(zhì)蛋白飼料而進行工廠化大量生產(chǎn)[5]。昆蟲體內(nèi)存在著大量的正常微生物(以下稱作昆蟲內(nèi)生菌)，這些微生物有助于昆蟲維持正常生命活動[6]，為昆蟲合成某些必需的維生素，或者分泌多種消化酶，促進昆蟲對脂肪和碳水化合物的吸收與利用。昆蟲內(nèi)生菌在昆蟲抵御外來病菌的侵入與定殖，提高昆蟲免疫系統(tǒng)的功能中也起著重要作用。研究昆蟲內(nèi)生菌不僅有利于深入了解昆蟲生命活動規(guī)律，促進昆蟲資源的開發(fā)利用及害蟲防治，而且可以從中挖掘有特殊功能的微生物資源[9]。美洲大蠊攜帶著大量的細菌。Rivault 等[7]從不同區(qū)域的美洲大蠊蟲體中分離出56種細菌。Lamiaa 等[8]分析了不同區(qū)域美洲大蠊體表攜帶的細菌組成。但這些研究主要關(guān)注美洲大蠊攜帶者和傳播病菌的潛力，分離細菌時未對其體表進行消毒。本研究以美洲大蠊成蟲為研究材料，對其體表進行嚴格消毒后，分離、純化蟲體內(nèi)的可培養(yǎng)性細菌，對獲得的菌株進行16S rRNA基因序列分析，再初步測定所分離菌株對纖維素、淀粉的分解效果，及對青枯雷爾氏菌的抑菌效果，由此了解美洲大蠊內(nèi)生細菌種類及功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲源 美洲大蠊為福建農(nóng)林大學生物防治研究所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB平板培養(yǎng)基、高氏一號平板培養(yǎng)基[9]；檢測培養(yǎng)基[10]：蛋白胨10 g，牛肉膏3.0 g，NaCl 5 g，可溶性淀粉20.0 g，瓊脂20 g，加蒸餾水定容至1 000 mL, pH 7.2～7.4，121 ℃滅菌20 min，倒平板；路戈氏碘液：0.5 g碘和5.0 g碘化鉀研磨溶于少量蒸餾水中，定容至100 mL，貯于棕色瓶中備用。

1.2 方法

1.2.1 美洲大蠊內(nèi)生菌分離 選取美洲大蠊成蟲10只，蟲體表面用自來水沖洗干凈，然后在75%酒精里浸泡30 s。在無菌操作條件下取出蟲體，轉(zhuǎn)至10%次氯酸鈉浸泡5 min，再用無菌水漂洗10次，達到蟲體表面消毒的效果。為了檢驗表面消毒效果，將最后一次清洗過的無菌水涂板后30 ℃培養(yǎng)2 d，若無菌落出現(xiàn)，證明該蟲體表面滅菌徹底，該樣品得到的結(jié)果可信。將上述經(jīng)過表面消毒的蟲體放在滅菌研缽中研磨，將研磨液用滅菌水稀釋至10-1～10-4。取10-3和10-4的稀釋液，在LB和高氏一號平板培養(yǎng)基上進行內(nèi)生菌的涂布分離培養(yǎng)，每個濃度每塊平板涂布100 μL，重復3次。涂布好的平板置于STK BI-250AG培養(yǎng)箱28 ℃培養(yǎng)。LB和高氏一號平板分別放置2 d和2周后取出，挑取表征各異的菌落在相應的新平板上劃線、純化、培養(yǎng)。將純化的菌落再移植到相應的斜面培養(yǎng)基上，編號保存。

1.2.2 美洲大蠊內(nèi)生菌的16S rRNA基因序列分析 從斜面培養(yǎng)基上分別挑取純化的內(nèi)生菌菌株，采用TRIS飽和酚提取DNA模板[11]。采用細菌16S rRNA基因序列通用引物9f (5′-GAG TTT GAT CCT GGC TCA G-3′)和1542R (5′-AGA AAG GAG GTG ATC CAG CC-3′)進行PCR擴增、測序。通用引物合成及PCR擴增產(chǎn)物測序均由上海博尚生工生物工程技術(shù)服務有限公司完成。獲得各菌株16S rRNA基因序列后，通過NCBI BLAST(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov)與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行比對，下載相似度高的序列。采用BioEdit軟件的Clustal W對測定和下載的多序列進行匹配排列，再通過MEGA 4.1軟件[12]利用鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析各菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位，將16S rRNA基因序列相似度大于98%的歸于同一個物種[13-14]。

1.2.3 美洲大蠊內(nèi)生菌淀粉酶、纖維素酶及抑菌活性的檢測 ①淀粉酶的檢測：用滅菌的竹簽挑取保存在斜面培養(yǎng)基的分離菌株，點于檢測培養(yǎng)基上。將處理好的檢測培養(yǎng)基平板放入28 ℃恒溫箱靜置培養(yǎng)。細菌培養(yǎng)2 d，放線菌培養(yǎng)5 d。取出平板，加入路戈氏碘液，涂布均勻，觀察平板上的菌落旁是否出現(xiàn)水解圈，記錄菌株號。②內(nèi)生菌纖維素酶的檢測：參考江意義等[15]的方法，配制剛果紅纖維素瓊脂培養(yǎng)基(K2HPO40.5 g，MgSO40.25 g，瓊脂 20 g，羧甲基纖維素1.88 g，剛果紅0.2 g，水1 000 mL，pH 7.5)。從斜面培養(yǎng)基上挑取待測菌株，點于剛果紅纖維素瓊脂培養(yǎng)基平板上，28 ℃恒溫靜置培養(yǎng)，細菌培養(yǎng)2 d，放線菌培養(yǎng)5 d。觀察平板上的菌落旁是否出現(xiàn)透明圈，記錄菌株號。③抑菌活力的測定：以本實驗室分離的青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum) FJAT-91為指示菌，測定所分離菌株對指示菌的抑菌效果。測定前用LB培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)FJAT-91，并通過血球計數(shù)法調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的菌體濃度至8.0×108cfu/mL。在200 mL LB半固體培養(yǎng)基(45 ℃)中加入20 mL FJAT-91培養(yǎng)液，搖勻后加入事先制好的LB平板上，制成雙層培養(yǎng)基。待凝固后，在每個雙層培養(yǎng)基平板上打5個孔(?=0.5 cm)，分別加入100 μL無菌水(作為陰性對照)、50 U/mL鏈霉素(作為陽性對照)和待測菌株培養(yǎng)液，28 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，觀察抑菌圈大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌體的形態(tài)和培養(yǎng)性狀

通過LB和高氏一號培養(yǎng)基，從表面消毒的美洲大蠊成蟲分離到11個不同的菌株，各菌株菌落特征如表1所示。

2.2 美洲大蠊內(nèi)生菌的16S rRNA基因序列分析

2.2.1 美洲大蠊內(nèi)生菌16S rRNA基因序列的擴增 將提取的各菌株基因組DNA經(jīng)電泳檢驗后作為模板，利用細菌16S rRNA基因序列通用引物進行PCR擴增，結(jié)果見圖1。各菌株的PCR擴增產(chǎn)物片斷大小為1.5 kb左右，與16S rRNA基因片斷大小接近，表明擴增產(chǎn)物是16S rRNA基因片斷。測序結(jié)果表明，擴增產(chǎn)物為1 422～1 440 bp的序列。將各序列提交至GenBank，并利用Blastn 軟件搜索與之具有最高相似度的模式標準菌株序列。結(jié)果表明，所分離的菌株共屬于8個屬，9個種(表2)。

圖1 部分菌株16S rRNA基因序列的PCR擴增結(jié)果Fig.1 The agarose gel electrophoresis results of PCR amplification products of the 16S rRNA gene sequence

表2 美洲大蠊內(nèi)生菌的16S rRNA基因序列比對結(jié)果

2.2.2 美洲大蠊內(nèi)生菌系統(tǒng)發(fā)育 對于從美洲大蠊分離到的內(nèi)生鏈霉菌菌株FJAT-30520、FJAT-30521、FJAT-30522、FJAT-30523，通過BLAST比對，選取同源性在98%以上的16S rRNA基因序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。結(jié)果表明，菌株FJAT-30520和FJAT-30522在同一個小分支上，兩者與Streptomyceschampavatii(NR_15669)的遺傳距離最近，相似度為99%；FJAT-30521則與Streptomycesintermedius(NR_041103)同在另一個小分支上，相似度為99%。對其他從美洲大蠊分離到的內(nèi)生細菌進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，結(jié)果表明，F(xiàn)JAT-17795與Providenciarettgeri(NR_042413)在同一小分支上(相似度99%)；而FJAT-17796則與P.hauseri(NR_104767)遺傳距離最近(相似度99%)；FJAT-17798與Serratiamarcescens(NR_036886), FJAT-17799與Bacilluskochii(NR_117050), FJAT-17801與Vagococcusfluvalis，及FJAT-17797與Enterococcusasini(NR_113929)均分別處于一小分支上，同一小分支上的2株菌相似度在99%以上。FJAT-17800與GenBank的序列最高相似度95%，所選擇的參考序列未能與FJAT-17800在同一小分支上。

2.3 美洲大蠊內(nèi)生菌淀粉酶、纖維素酶及抑菌活性的檢測

平板檢測結(jié)果初步表明，能分泌淀粉酶和纖維素酶，使檢測培養(yǎng)基產(chǎn)生透明圈的菌株有FJAT-30520、30521、30522、30523(表3、圖3)，均由高氏一號培養(yǎng)基從美洲大蠊分離到的內(nèi)生菌。FJAT-30520淀粉酶活性顯著高于FJAT-30521和FJAT-30522，其纖維素降解酶活性顯著高于其余菌株(表3)。

對青枯雷爾氏菌具有抑菌圈的菌株有FJAT-17796、17797和30523，前兩株是采用LB培養(yǎng)基分離得到的美洲大蠊內(nèi)生菌(圖4)。FJAT-30523和17796對青枯雷爾氏菌的抑菌活性高于FJAT-17797，前2個菌株的圈徑比顯著大于FJAT-17797所引起的圈徑比(表3)。

菌株編號屬名淀粉酶降解圈徑比纖維素酶降解圈徑比對青枯雷爾氏菌抑菌圈徑比FJAT-30520Streptomyces2.80±0.14a1.75±0.07a-FJAT-30521Streptomyces1.45±0.02c1.19±0.05c-FJAT-30522Streptomyces2.32±0.28bc1.23±0.01bc-

續(xù)表3

注：同一欄字母不同，表示差異顯著(P<0.05)；“-”表示無降解圈

圖3 淀粉酶及纖維素酶降解圈Fig.3 Transparent hydrolysis circle by amylase and cellulase

圖4 美洲大蠊內(nèi)生菌對青枯雷爾氏菌的抑制作用Fig.4 Antimicrobial effect of bacteria isolated from the inside of adult Periplaneta americana with Ralstonia solanacearum FJAT-91 as indicator

3 討 論

本研究采用LB和高氏一號平板培養(yǎng)基，從美洲大蠊成蟲分離到7株細菌菌株和4株放線菌。16S rRNA基因序列分析結(jié)果表明，高氏一號培養(yǎng)基分離到的4株放線菌菌株均屬于鏈霉菌屬(Streptomyces)，但4株菌株間的親緣關(guān)系不同，表明它們可能是不同的種；以LB培養(yǎng)基分離到的7株菌株，其中6株分別屬于腸桿菌屬(Enterbacter)、變形菌屬(Proteus)、腸球菌屬(Enterococcus)、沙雷氏菌屬(Serratia)、芽胞桿菌屬(Bacillus)和漫游球菌屬(Vagococcus)，另有1株為新種，在NCBI中與腸桿菌的相似度最高，為95%。Rivault等[7]從市區(qū)的6個不同衛(wèi)生環(huán)境的場所采集美洲大蠊，整蟲研磨，分離培養(yǎng)，得到15～30種細菌，含腸桿菌屬和變形菌屬，但不含芽胞桿菌、腸球菌和漫游球菌。這可能是采集地點和分離方法不同所致。本研究的蟲源采自人工飼養(yǎng)的人工種群，環(huán)境較干靜，且經(jīng)過體表消毒后進行細菌分離培養(yǎng)。腸桿菌是昆蟲體內(nèi)常見的一種內(nèi)生菌，低等白蟻和高等白蟻腸道中均可分離到[16]。家蠶腸道也存在著芽胞桿菌和沙雷氏菌，這一點與本文所用的美洲大蠊相似[17]。

初步測定所分離菌株的部分功能，結(jié)果表明美洲大蠊體內(nèi)存在著可分解淀粉和纖維素的鏈霉菌，同時還存在一些細菌，可以抑制其他細菌生長。孫佑赫等[18]從思茅松毛蟲腸道中分離到產(chǎn)蛋白酶和脂肪酶的菌株。小蠹蟲腸道中則存在纖維素降解菌[19],而家蠅幼蟲腸道中存在糞產(chǎn)堿菌[20]。由此可見，昆蟲體內(nèi)這一特殊環(huán)境中可獲得特殊的細菌資源。

[1] 張李香，范錦勝，吳珍泉. 美洲大蠊雌成蟲混配飼料的優(yōu)化配方[J]. 福建農(nóng)林大學學報(自然科學版)，2010，39(4)：351-355.

[2] 尹衛(wèi)平，姜亞玲，李鵬飛，等. 昆蟲美洲大蠊天然產(chǎn)物的研究及其化學分類學意義[J]. 河南科技大學學報(自然科學版)，2012，33(5)：101-104.

[3] 蘇金仁，陳瑾，黃秀深，等. 美洲大蠊對小鼠移植性肝癌的藥效研究[J]. 山西中醫(yī)學院學報，2012，13(5)：14-16.

[4] 藍江林，吳珍泉，周先治，等. 美洲大蠊血淋巴抗菌活性誘導差異比較[J]. 中國農(nóng)學通報，2008，24(2)：59-62.

[5] 周瓊，吳珍泉，李忠榮，等. 美洲大蠊的營養(yǎng)價值與飼用安全性的分析[J]. 福建農(nóng)業(yè)學報，2007，22(3)：276-278.

[6] 黃云，詹先進，藍家樣，等. 昆蟲腸道微生物的研究進展[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學，2009，48(11)：2889-2890.

[7] Rivault C, Cloarec A, Leguyader A. Bacterial load of cockroaches in relation to urban environment[J]. Epidemiol. Infect., 1993, 110(2): 317-325.

[8] Lamiaa B, Mariam L, Ahmed A. Bacteriological analysis ofPeriplanetaamericanaL. (Dictyoptera: Blattidae) andMuscadomesticaL. (Diptera: Muscidae) in ten districts of Tangier, Morocco[J]. African Journal of Biotechnoloty, 2007, 6(17): 2038-2042.

[9] 陳天壽. 微生物培養(yǎng)基的制造與應用[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1995.

[10]李堆淑. 不同植被土壤產(chǎn)淀粉酶放線菌的分離與篩選[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學，2013，42(2)：152-156.

[11]趙春喜，馬利華，楊同文. TRIS飽和酚一步法提取食用菌DNA[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2008，36(28)：12122，12200.

[12]Tamura K, Dudley J, Nei M, et al. MEGA 4 molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0[J]. Mol Biol Evol, 2007, 24(8): 1596-1599.

[13]Kasai H, Tamura T, Harayama S. Intrageneric relationships among Micromonospora species deduced from gyrB-based phylogeny and DNA relatedness[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2000, 50(1): 127-130.

[14]Stach J E, Maldonado L A, Masson D G, et al. Statistical approaches for estimating actinobacterial diversity in marine sediments[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69(10): 6189-6200.

[15]江意義，宗斯，李洋，等. 纖維素酶高產(chǎn)菌株的篩選及產(chǎn)酶條件的研究[J]. 安徽農(nóng)學通報，2010，16(21)：48-52.

[16]陳虹，梅建鳳，閔航. 白蟻腸道微生物[J]. 微生物學雜志，2005，25(2)：75-79.

[17]袁志輝，藍希鉗，楊遷，等. 家蠶腸道細菌群體調(diào)查與分析[J]. 微生物學報，2006，46(2)：285-291.

[18]孫佑赫，周開艷，熊智. 思茅松毛蟲腸道產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選鑒定及酶學性質(zhì)初步研究[J]. 微生物學雜志，2012，32(2): 64-67.

[19]康柳，熊智，杜健偉，等. 小蠹蟲腸道中纖維素降解菌的分離及其產(chǎn)酶性質(zhì)[J]. 西南林業(yè)大學學報，2012，32(2)：7-10.

[20]丁友真，張書芳，高錦亞，等. 家蠅幼蟲體內(nèi)的糞產(chǎn)堿菌有抑菌能力[J]. 中國媒介生物學及控制雜志，1997，8(3)：181-183.

Isolation & Enzymatic Activity, Antimicrobial Effect of Bacteria Harbored Inside Adult American Big Cockroach Periplaneta americana (Linnaeus)

RUAN Chuan-qing1, LIU Bo1, WU Zhen-quan2, SU Ming-xing1, CAI Huai-jin1, LI Tao2

(1.Agric.Bio-Res.Res.Inst.,FujianAcad.ofAgric.Sci.,Fuzhou350003; 2.Schl.ofPlantProtect.,FujianAgric. &Forest.Uni.,Fuzhou350002)

Bacteria inside adult American big cockroach (Periplanetaamericana) (Linnaeus) were isolated and tested for starch and cellulose degradase activities, as well as bacteriostasis properties. The insects were sterilized on their surfaces. The bacteria inside the insects were isolated with LB and Gause’s No. 1 media and subjected to sequences analysis of their 16S rRNA gene. The degradase and bacteriostatic activities of the isolated bacteria strains were determined by testing color-changing circle and bacteriostatic circle respectively. The results isolated 11 strains in total, 4 of them belong to genusStreptomyces, 6 belong toEnterbacter,Proteus,Enterococcus,Serratia,BacillusandVagococcusrespectively. There was another strain in NCBI having a similarity of 95% with that ofEnterbacterspp., possibly belongs to a potential new species. The 4Streptomycesstrains all had the capability of degrading starch and cellulose. Three strains exhibited bacteriostatic effect on green rot pathogen (Ralstoniasolanacearum). The results showed that the bacteria inside the bodies of American big cockroach possessed some functions, even undiscovered new species; it is an important strain resource.

American big cockroach (Periplanetaamericana) (Linnaeus); endosymbiotic bacteria;Streptomyces; enzymatic activity; bacteriostatic activity

國家自然科學基金項目(31370059)；福建省自然科學基金項目(2012J01106)

阮傳清 男，博士，副研究員。主要從事昆蟲內(nèi)共生菌研究。Tel: 0591-87882571, E-mail: ruanchuanqing@163.com

* 通訊作者。男，研究員，博士生導師。主要從事微生物生物技術(shù)與農(nóng)業(yè)生物藥物研究。Tel: 0591-87882571, E-mail: fzliubo@163.com

2014-10-13；

2015-01-22

Q93-331

A

1005-7021(2015)05-0036-07

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.05.007