1株產(chǎn)L-天冬氨酸酶大腸埃希菌噬菌體分離和生理特性初步研究

劉 勇， 馬玉岳， 徐友強(qiáng)， 裴疆森， 姜國(guó)政， 姜增妍， 程 池*

(1.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 100015；2.山東省富馬酸生物轉(zhuǎn)化工程技術(shù)研究中心，山東 煙臺(tái) 265709；3.煙臺(tái)恒源生物股份有限公司，山東 煙臺(tái) 265709)

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1株產(chǎn)L-天冬氨酸酶大腸埃希菌噬菌體分離和生理特性初步研究

劉 勇1,2， 馬玉岳2,3， 徐友強(qiáng)1,2， 裴疆森1，2， 姜國(guó)政2,3， 姜增妍2,3， 程 池1,2*

(1.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 100015；2.山東省富馬酸生物轉(zhuǎn)化工程技術(shù)研究中心，山東 煙臺(tái) 265709；3.煙臺(tái)恒源生物股份有限公司，山東 煙臺(tái) 265709)

對(duì)產(chǎn)L-天冬氨酸酶大腸埃希菌噬菌體進(jìn)行分離和生理特性研究，有助于為生產(chǎn)過(guò)程中噬菌體污染的防治提供指導(dǎo)。采用雙層平板法對(duì)噬菌體進(jìn)行分離純化。利用透射電鏡觀察噬菌體形態(tài)。進(jìn)行噬菌體全基因組測(cè)序和比對(duì)。通過(guò)測(cè)定不同處理?xiàng)l件下噬菌體活性，研究溫度、pH、有機(jī)溶劑氯仿、去垢劑SDS對(duì)噬菌體的影響。從噬菌體污染的L-天冬氨酸酶生產(chǎn)菌種大腸埃希菌HY-05C發(fā)酵培養(yǎng)液中分離出1株噬菌體。電鏡結(jié)果表明，該噬菌體由呈多面體對(duì)稱(chēng)的頭部和極短的尾部構(gòu)成?；蚪M測(cè)序和比對(duì)結(jié)果表明，噬菌體與T7樣噬菌體的相似性最高。生理特性研究表明，噬菌體對(duì)高溫和去垢劑SDS敏感，對(duì)有機(jī)溶劑氯仿不敏感；最適pH為7.0，堿性條件下活力較為穩(wěn)定，酸性條件容易失活。噬菌體保藏編號(hào)為CICC 80001。

噬菌體；生理特性；大腸埃希菌；L-天冬氨酸酶

工業(yè)規(guī)模微生物發(fā)酵生產(chǎn)L-天冬氨酸酶中的噬菌體污染是一個(gè)常見(jiàn)現(xiàn)象，對(duì)工業(yè)生產(chǎn)具有巨大的危害性。目前，鮮見(jiàn)關(guān)于L-天冬氨酸酶生產(chǎn)過(guò)程中污染噬菌體分離和生理特性相關(guān)的研究報(bào)道。大腸埃希菌HY-05C (EscherichiacoliHY-05C)是1株性能優(yōu)良的L-天冬氨酸酶生產(chǎn)菌株，其L-天冬氨酸酶活力高達(dá)4 500 U/mL，能夠高效轉(zhuǎn)化富馬酸生產(chǎn)L-天冬氨酸[1]。本研究從噬菌體污染的HY-05C發(fā)酵液中分離純化出1株噬菌體，通過(guò)透射電鏡觀察噬菌體形態(tài)，并對(duì)其生理特性(溫度、pH、有機(jī)溶劑和去垢劑)對(duì)噬菌體活性的影響進(jìn)行研究，以期為L(zhǎng)-天冬氨酸生產(chǎn)過(guò)程中噬菌體污染的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 噬菌體污染的大腸埃希菌HY-05C發(fā)酵液，采集于工廠(chǎng)L-天冬氨酸生產(chǎn)車(chē)間發(fā)酵罐。

1.1.2 菌種 大腸埃希菌HY-05C，為噬菌體宿主菌。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母膏5，氯化鈉5，pH 7.0。固體培養(yǎng)基則添加瓊脂(20 g/L)。

1.1.4 試劑 氯仿、SDS等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.5 儀器與設(shè)備 恒溫培養(yǎng)箱GHP-9270(上海)，恒溫水浴鍋HH-3A(天津)，透射電鏡JEM-1400(日本)，高通量測(cè)序儀Illumina Hiseq 2000(美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體分離和純化 將噬菌體污染的HY-05C發(fā)酵液搖勻過(guò)0.22 μm濾膜，取100 μL發(fā)酵液于900 μL無(wú)菌水中搖勻，依次進(jìn)行梯度稀釋。取100 μL稀釋液與900 μL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的宿主菌HY-05C混勻，再取100 μL混合液采用雙層平板法[2]分離，37 ℃倒置培養(yǎng)16 h。用無(wú)菌牙簽挑取單個(gè)噬菌斑。噬菌斑連續(xù)5代單斑穿刺純化培養(yǎng)[3]。當(dāng)噬菌斑形態(tài)和大小基本穩(wěn)定時(shí)，可認(rèn)為噬菌體已被純化。

1.2.2 噬菌體培養(yǎng)[4]將宿主菌HY-05C接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600為0.6左右)，挑取單個(gè)噬菌斑接種處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的宿主菌，37 ℃靜置培養(yǎng)3 h，再37 ℃、180 r/min培養(yǎng)至培養(yǎng)液變透明，得到噬菌體懸液。

1.2.3 噬菌體滴度測(cè)定 取100 μL噬菌體懸液，加入900 μL無(wú)菌水中搖勻，依次進(jìn)行梯度稀釋。取10-3～10-5稀釋梯度的稀釋液100 μL與900 μL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的宿主菌HY-05C混勻，取100 μL采用雙層平板法37 ℃倒置培養(yǎng)16 h，對(duì)噬菌斑進(jìn)行計(jì)數(shù)[5]。

1.2.4 噬菌體顯微形態(tài)觀察 采用醋酸雙氧鈾染色法，取100 μL噬菌體CICC 80001懸液，滴在石蠟片上，將銅網(wǎng)放置于噬菌體懸液液滴上，5 min后將銅網(wǎng)取下，置于干凈的濾紙上晾干。用2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))醋酸雙氧鈾染色10 min，將銅網(wǎng)取下晾干，透射電鏡觀察[6-7]基本形態(tài)。

1.2.5 噬菌體基因組提取和測(cè)序 噬菌體DNA提取參考文獻(xiàn)[8]，噬菌體基因組通過(guò)Illumina Hiseq 2000系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)序，并利用軟件CLC Genomics Workbench 5.0.1進(jìn)行拼接[9]。

1.2.6 噬菌體溫度穩(wěn)定性[10]將噬菌體懸液(滴度為7.8×107pfu/mL)分別置于50、65、80、95 ℃的水浴鍋中，10、20、30、40 min分別取樣，立即將樣品置于4 ℃冰箱中冷卻，樣品稀釋后取合適的梯度測(cè)定各溫度下不同作用時(shí)間噬菌體的滴度。

1.2.7 噬菌體pH耐受性[10]取無(wú)菌EP管分別加入不同pH值(3、5、7、9、11)的LB培養(yǎng)基900 μL，然后將上述EP管置于37 ℃的恒溫水浴中，待溫度平衡后加入100 μL噬菌體懸液(滴度為7.8×107pfu/mL)，恒溫1 h。將樣品做適當(dāng)稀釋?zhuān)?.2.3測(cè)定噬菌體滴度。

1.2.8 噬菌體對(duì)有機(jī)溶劑氯仿和去垢劑SDS的敏感性[6]室溫下將噬菌體懸液(滴度為7.8×107pfu/mL)與氯仿混合，氯仿體積分?jǐn)?shù)為25%，震蕩5 min后6 000 r/min離心1 min，按1.2.3測(cè)定噬菌體滴度。噬菌體懸液加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的SDS，室溫下放置5 min，按1.2.3測(cè)定噬菌體滴度。

2 結(jié)果與分析

2.1 噬菌體分離和純化

從噬菌體污染的L-天冬氨酸酶生產(chǎn)菌種大腸埃希菌HY-05C發(fā)酵液中分離得到1株噬菌體，保藏于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)為CICC 80001，噬菌斑透明，邊緣清晰，無(wú)暈環(huán)，呈現(xiàn)典型裂解型噬菌體特征，培養(yǎng)16 h，噬菌斑直徑為3～4 mm。

2.2 噬菌體顯微形態(tài)觀察

利用透射電鏡觀察(圖1)，噬菌體CICC 80001由直徑50～60 nm呈正多面體對(duì)稱(chēng)的頭部和極短的尾部構(gòu)成。從形態(tài)上，CICC 80001屬于C1形態(tài)群；依據(jù)ICTV病毒分類(lèi)第8次報(bào)告，CICC 80001屬于有尾噬菌體目 (Caudoviradles)，短尾噬菌體科 (Podoviridae)。

2.3 噬菌體全基因組測(cè)序

測(cè)序結(jié)果表明，噬菌體CICC 80001基因組(GenBank登錄號(hào)為KM242061.1)全長(zhǎng)38 810 bp，G+C含量為48.8%。與NCBI已公布的近緣噬菌體全基因組進(jìn)行比對(duì)，CICC 80001與T7樣噬菌體的相似性最高，但僅有83.7%。由于相似性較低，且在系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)上單獨(dú)聚為一支，表明噬菌體CICC 80001可能為1株新的噬菌體(圖2)。

圖1 噬菌體CICC 80001電鏡照片F(xiàn)ig.1 Transmission electron micrograph of phage CICC 80001

圖2 噬菌體CICC80001系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Phylogenetic analysis of phage CICC80001

The tree was constructed with the MEGA 5.2 program using neighbour-joining cluster algorithm. The numbers at the branches are bootstrap values.

2.4 噬菌體溫度穩(wěn)定性

溫度穩(wěn)定性結(jié)果(圖3)表明，隨著溫度的升高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，噬菌體存活率降低。噬菌體CICC 80001于80 ℃處理40 min后，96%失活；95 ℃處理10 min，全部失活。

2.5 噬菌體pH耐受性

由圖4可知，噬菌體CICC 80001在pH 7.0時(shí)最為穩(wěn)定。pH的升高對(duì)噬菌體活性影響不明顯，pH降低對(duì)其活力影響顯著，pH為3.0時(shí)CICC 80001活力下降顯著。

圖3 溫度對(duì)噬菌體CICC 80001活性的影響Fig.3 Effect of temperature on the viability of phage CICC 80001

圖4 pH對(duì)噬菌體CICC 80001活性的影響Fig.4 Effect of pH on the viability of phage CICC 80001

2.6 氯仿和SDS對(duì)噬菌體活性的影響

選取氯仿和SDS對(duì)噬菌體進(jìn)行處理，研究其對(duì)化學(xué)試劑的敏感性。結(jié)果表明，噬菌體CICC 80001對(duì)有機(jī)溶劑氯仿不敏感，用體積分?jǐn)?shù)為25%的氯仿處理后活力仍能維持在82%左右；而對(duì)去垢劑SDS較敏感，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的SDS處理后，活力僅剩48%(圖5)。噬菌體對(duì)0.1% SDS較為敏感，可能是由于SDS與噬菌體外殼蛋白結(jié)合，從而影響其對(duì)宿主菌的侵染。

圖5 氯仿和SDS對(duì)噬菌體CICC 80001活性的影響Fig.5 Effect of chloroform and SDS on the viability of phage CICC 80001

3 討 論

L-天冬氨酸酶生產(chǎn)菌種大腸埃希菌HY-05C發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中，發(fā)生噬菌體污染時(shí)常表現(xiàn)為菌種生長(zhǎng)緩慢，嚴(yán)重時(shí)甚至不生長(zhǎng)；或發(fā)酵液培養(yǎng)到一定階段，菌體生長(zhǎng)停止，同時(shí)溫度下降，產(chǎn)生大量泡沫。被噬菌體污染的發(fā)酵液無(wú)L-天冬氨酸酶活力或活力較低，嚴(yán)重影響生產(chǎn)。本研究從產(chǎn)L-天冬氨酸酶大腸埃希菌HY-05C發(fā)酵液中分離得到的噬菌體CICC 80001，頭部呈正多面體對(duì)稱(chēng)，直徑50～60 nm，并有很短的尾部，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析，噬菌體CICC 80001屬短尾噬菌體科噬菌體。噬菌體的分離及系統(tǒng)發(fā)育分析為后續(xù)抗性菌種的選育奠定了基礎(chǔ)。

通過(guò)溫度對(duì)噬菌體CICC 80001活性影響研究表明，噬菌體對(duì)高溫比較敏感，95 ℃處理10 min，噬菌體全部失活。因此，生產(chǎn)中可利用蒸汽為熱源，通過(guò)加熱器對(duì)進(jìn)入發(fā)酵罐中的空氣進(jìn)行加熱，以滅活其中可能帶有的噬菌體。

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Bacteriophage Strain against L-Aspartase Producing Escherichia coli

LIU Yong1, 2, MA Yu-yue2, 3, XU You-qiang1,2, PEI Jiang-sen1,2, JIANG Guo-zheng2, 3, JIANG Zeng-yan2, 3, CHENG Chi1, 2

(1.ChinaNat'lRes.Inst.ofFood&Ferment'nIndust.,Beijing100015; 2.YantaiHengyuanBio-Engin.Co.,Ltd,Yantai265709; 3.ShandongEngin.TechnologyRes.CtrForFumaricAcidBiotransf.,Yantai265709)

Carry out isolation and physiological characteristics study on the bacteriophage against L-aspartase producingE.coliconduces to control the phage contamination during the production process. The phage was isolated and purified adopting double-layer plate method. And the phage morphology was determined using transmission electron microscopy (TEM). The phage omni-genome was sequenced and compared with gene bank. The effects of temperature, pH, organic solvent chloroform and detergent SDS on phage was determined by measuring the phage activity under different treatment conditions. A bacteriophage was isolated from L-aspartase producingE.colistrain HY-05C culture broth with phage contamination. The bacteriophage had a symmetrical head of regular polygon and short tails. Genome sequence and comparison results showed that it had a close relationship with T7 like bacteriophage. Research of the bacteriophage physiological characteristics showed that it was sensitive to high temperatures and SDS, but insensitive to chloroform, fairly stable in pH 7.0 and alkaline conditions, however, unstable under acidic condition.Bacteriophage preservation number is CICC 80001.

bacteriophage; physiological characteristics;E.coli；L-aspartase

煙臺(tái)市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014SF151)

劉勇 男，工程師。主要從事微生物學(xué)與發(fā)酵工程研究。Tel：010-53218288-6356，E-mail: hk2098@163.com

* 通訊作者。男，教授，博士生導(dǎo)師。主要從事微生物學(xué)研究。E-mail: cheng100027@163.com

2014-10-11；

2014-11-21

Q93-31

A

1005-7021(2015)05-0043-04

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.05.008