房月芹, 崔文璟, 劉 義, 周 麗, 劉中美, 周哲敏*
(1. 江南大學(xué) 環(huán)境與土木工程學(xué)院,江蘇 無錫 214122;2. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室,江蘇 無錫 214122)
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融合雙親短肽提高腈水合酶的熱穩(wěn)定性研究
房月芹1, 崔文璟2, 劉 義2, 周 麗2, 劉中美2, 周哲敏2*
(1. 江南大學(xué) 環(huán)境與土木工程學(xué)院,江蘇 無錫 214122;2. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室,江蘇 無錫 214122)
腈水合酶(Nitirle hydratase, NHase)催化腈類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為酰胺類物質(zhì),目前用于工業(yè)生產(chǎn)丙烯酰胺。但在催化過程中釋放的熱量易導(dǎo)致酶分子失活。研究通過蛋白質(zhì)融合技術(shù)對腈水合酶進行分子改造,提高熱穩(wěn)定性。將2種雙親自組裝肽(self-assembling peptides, SAPs)EAK16和ELK16分別融合至惡臭假單胞菌PseudomonasputidaNRRL-18668來源NHase非催化亞基β的N末端,構(gòu)建出2種融合型NHase:EAK16-NHase和ELK16-NHase。經(jīng)過表達、純化后測定酶活力,發(fā)現(xiàn)EAK16-NHase和ELK16-NHase的酶活力分別為(426±14) U/mg和(372±12) U/mg,保留野生型酶活力的97%和85%。在50 ℃條件下孵育0~60 min,每5 min取樣后測定殘存酶活力,EAK16-NHase和ELK16-NHase酶活力半衰期(T50)分別為35 min和40 min,野生型NHase為20 min。說明融合EAK16和ELK16均能提高NHase的熱穩(wěn)定性。研究表明融合SAPs能在不顯著影響酶活力的條件下提高酶的熱穩(wěn)定性。
雙親短肽;融合蛋白;腈水合酶;酶催化;熱穩(wěn)定性
1.1 材料
1.1.1 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基 惡臭假單胞菌PseudomonasputidaNRRL-18668購自NBRC,E.coliJM109、E.coliBL21 (DE3)表達載體pET24a(+)為本實驗室保存;模板質(zhì)粒pET24a-BAP為本實驗室前期構(gòu)建;TB培養(yǎng)基:胰蛋白胨1.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),酵母提取物2.4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),甘油0.4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)), KH2PO417 mmol/L, K2HPO472 mmol/L,pH 7.0,121 ℃滅菌20 min。
1.1.2 主要試劑和儀器 DNA marker、Protein marker、質(zhì)粒小量提取試劑盒、蛋白定量試劑盒等購自上海生生物工程有限公司,KOD plus neo、Ligation high LGK-100、膠回收試劑盒購自上海碩盟生物科技有限公司,CloneEZ試劑盒購自GenScript(Piscataway, NJ, USA),底物3-氰基吡啶(3-cyanopyridine)購自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司,PCR引物合成及測序由上海生工生物工程公司完成。
1.1.3 引物、基因和蛋白質(zhì)序列 基因序列:EAK16和ELK16基因由上海生工生物工程有限公司合成。序列:EAK16:CTGGAACTGGAACTGAAACTGAAACTGGAACTGGAACTGAAACTGAA-ACCGACCCCGCCGACCACCCCGACCCCGCCGAC-CACCCCGACCCCGACCCCG;ELK16:GCGGAAGC-GGAAGCGAAAGCGAAAGCGGAAGCGGAAGCGA-AAGCGAAACCGACCCCGCCGACCACCCCGACCC-CGCCGACCACCCCGACCCCGACCCCG。 蛋白質(zhì)序列:EAK16:AEAEAKAKAEAEAKAKPTPPTTPTPPTTPTPTP;ELK16:LELELKLKLELELKLKPTPPTTPTPPTTPTPTP。引物序列:SAP1F:TAAGAAG-GAGATATACATATGGCGGAAGCGGAAGCG;SAP1-R:ATCGTGAATGCCATTCATATGCGGGGTCGGGG-TCGG;SAP2F:TAAGAAGGAGATATACATATGCTGGAACTGGAACTG;SAP2R:ATCGTGAATGCCATTCATATGCGGGGTCGGGGTCGG。
1.2 方法
1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建 利用CloneEZ快速構(gòu)建質(zhì)粒方法將2種自組裝肽EAK16和ELK16分別構(gòu)建到模板質(zhì)粒pET24a-BAP上。首先利用SAP1F和SAP1R擴增EAK16基因,純化PCR產(chǎn)物備用。提取pET24a-BAP質(zhì)粒載體,用NdeI進行單酶切后,將EAK16純化的PCR產(chǎn)物與酶切后的載體及CloneEZ酶混合按CloneEZ說明書方法操作,將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliJM109,過夜培養(yǎng)后挑取單菌落,37 ℃培養(yǎng),測序驗證,構(gòu)建的含有NHase和EAK16融合基因的重組質(zhì)粒命名為pET24a-SAP1-NHase。同樣,利用此方法將ELK16融合到NHase的β亞基N末端,構(gòu)建出的重組載體命名為pET24a-SAP2-NHase。
1.2.2 腈水合酶在大腸埃希菌中的表達和純化 具體參考余越春等[17]的方法。將以上構(gòu)建的2種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3),挑取單菌落分別接入含有Kan(50 g/mL)的TB液體培養(yǎng)基,過夜活化,次日轉(zhuǎn)接,培養(yǎng)至OD600為1.0,添加IPTG(0.6 mmol/L)、CoCl2·6H2O(0.1 g/L)誘導(dǎo)表達16 h,SDS-PAGE檢測重組蛋白質(zhì)的表達水平。野生型NHase和融合NHase的純化方法參考Liu等[18]報道。
1.2.3 酶活測定 酶活力采用高效液相色譜法測定 反應(yīng)液體積為0.5 mL,組成為450 μL 20 mmol/L KPB緩沖液、40 μL 200 mmol/L的底物3-cyanopyridine以及10 μL的酶液。25 ℃反應(yīng)10 min后,加入等量乙腈終止反應(yīng)。將終止的反應(yīng)液過0.22 μm濾膜,然后用C18柱進行高效液相層析(high performance liquid chromatography, HPLC)進行酶活檢測,流動相為體積比2∶1的磷酸緩沖液(pH 7.4)與乙腈的混合溶液,流速1 mL/min。腈水合酶的酶活力單位:該酶在25 ℃時每分鐘催化產(chǎn)生1 μmoL煙酰胺所需要的酶量為1 U。
1.2.4 熱穩(wěn)定性測定 純化后的野生型NHase和2種融合NHase (SAP1-NHase和SAP2-NHase)溶解于10 mmol/L pH 7.5的磷酸鉀緩沖液(KPB)中,使酶終濃度為0.3 mg/mL。酶蛋白分為12組,每組樣品200 μL,分別置于50 ℃金屬浴中孵育,每隔5 min取出1組,立刻置冰上冷卻5 min。待孵育60 min組結(jié)束后。利用1.2.3中的方法測定酶活力。野生酶和融合酶以未熱浴的活力定義為100%,半衰期T50定義為酶活力降低一半時所經(jīng)歷的熱浴時間。每組樣品分別進行3個平行樣測定,數(shù)據(jù)以Mean±SD表示。
2.1 N-末端融合EAK16和ELK16對NHase的影響
腈水合酶催化活性中心存在于α亞基上,而β亞基不直接參與催化。因此,本研究將2種SAPs融合與NHase的β亞基N末端,構(gòu)建出2種β亞基N末端分別融合EAK16和ELK16的融合NHase,為EAK16-NHase和ELK16-NHase,基因結(jié)構(gòu)如圖1所示。
經(jīng)過在E.coliBL21(DE3)中誘導(dǎo),細胞經(jīng)超聲波破碎,SDS-PAGE檢測,結(jié)果如圖2所示。重組蛋白成功實現(xiàn)了大量可溶表達。由于野生NHase中α亞基和β亞基理論分子量分別為25 kDa和26.1 kDa,因而在泳道2中2個亞基不容易分離出來,呈現(xiàn)單一條帶。而β亞基融合了EAK16和ELK16后,理論分子量分別增加了3.6 kDa和3.3 kDa,因而α亞基和β亞基通過SDS-PAGE得以分離。圖2中的電泳條帶位置和理論值相符,表明野生型和融合型NHase成功表達。
圖1 野生NHase和融合NHase的基因結(jié)構(gòu)Fig.1 Gene structure of the wild-type NHase and fused NHase
圖2 NHase野生酶和融合酶在E.coli中重組表達Fig.2 Heterogenous expression of wild-type and fused NHase in E.coli1:蛋白質(zhì)Marker;2:野生NHase的重組表達;3:融合EAK16的NHase重組表達;4:融合ELK16的NHase重組表達1: Protein Marker; 2:wild-type NHase;3:EAK16-NHase; 4:ELK16-NHase
2.2 野生型和融合型NHase的純化及酶活性鑒定
含有重組質(zhì)粒的E.coli細胞經(jīng)過離心收集菌體,超聲波破碎細胞后,將上清液通過硫酸銨分級沉淀(40%~75%)粗分離,透析后再利用Hitrap Q HP 1mL陰離子柱和Superdex 75 10/300GL凝膠層析柱進行進一步分離純化,經(jīng)過SDS-PAGE檢測,得到純度較高的酶,結(jié)果如圖3所示。
圖3 野生型NHase和融合型NHase的分離純化Fig.3 Separation and purification of wild-type and fused NHase1:蛋白質(zhì)marker;2:純化后的野生型NHase;3:純化后的EAK16-NHase;4:純化后的ELK16-NHase1:protein marker; 2:purified wild-type NHase; 3:purified EAK16-NHase; 4:purified ELK16-NHase
以3-cyanopyridine為底物,分別測定野生NHase、融合EAK16-NHase和ELK16-NHase的酶活力。結(jié)果顯示,野生酶比酶活為(439±11) U/mg,EAK16-NHase比酶活為(426±14) U/mg,ELK16-NHase比酶活為(372±12) U/mg。融合了EAK16的NHase比酶活與野生型酶相比,沒有明顯降低,而融合了ELK16的NHase少有降低,但也保留了原始酶活的84.7%。表明融合后的NHase酶活均沒有大幅度降低。
2.3 融合EAK16和ELK16對NHase酶熱穩(wěn)定性的影響
為了探討NHase分別融合EAK16和ELK16后熱穩(wěn)定的變化,實驗以3-cyanopyridine為底物,定義沒有經(jīng)過50 ℃熱處理的3種酶本身的比活力為100%,在50 ℃下分別孵育NHase、EAK16-NHase和ELK16-NHase至60 min,每隔5 min檢測殘存酶活力,與各自不經(jīng)熱處理的比活力相比,計算殘存酶的百分比,結(jié)果如圖4所示。野生型NHase在經(jīng)過熱處理20 min后,殘存酶活力即低于50%,融合了EAK16或ELK16的NHase酶活半衰期T50延長至30 min和35 min。熱處理40 min后,野生型NHase殘存活力為零,完全失活。而融合了ELK16和EAK16的NHase在同樣處理40min后,殘存酶活力分別為33%和28%。結(jié)果表明,融合EAK16或ELK16均可提高NHase在50 ℃下的熱穩(wěn)定性,且融合ELK16對抗熱變性的作用稍強。
圖4 融合EAK16和ELK16對NHase熱穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect on thermo-stability of NHase after fusing EAK16 and ELK16, respectively
隨著腈水合酶在轉(zhuǎn)化生產(chǎn)丙烯酰胺中的廣泛應(yīng)用,研究人員對其酶學(xué)性質(zhì)如酶活性、Km、Kcat、抑制劑以及底物特異性進行長期系統(tǒng)的探討,多種細菌來源的腈水合酶及其酶學(xué)性質(zhì)被準(zhǔn)確表征。研究發(fā)現(xiàn),絕大多數(shù)細菌來源的腈水合酶最適的催化溫度都在20~37 ℃,其中包括了工業(yè)中已經(jīng)廣泛應(yīng)用的丙烯酰胺第3代生產(chǎn)用菌——玫瑰紅球菌RhodococcusrhodochrousJ1,其最適催化溫度也為35 ℃[19]。然而,在轉(zhuǎn)化丙烯腈生產(chǎn)丙烯酰胺的過程中,反應(yīng)大量放熱,使體系溫度迅速上升,即使采取不斷導(dǎo)熱或散熱的工藝,也不可避免地使體系溫度有較大波動。這種情況對提高丙烯酰胺生產(chǎn)的穩(wěn)定性尤為不利。雖然之前的研究也鑒定出睪丸酮叢毛單胞菌Comamonastestosterone來源的NHase熱穩(wěn)定性較強,但其催化的活性遠低于R.rhodochrousJ1以及Pseudomonasputida來源的NHase。由于目前對嗜熱酶的耐熱機理已有比較系統(tǒng)的研究,已知酶蛋白的一級結(jié)構(gòu)中氨基酸的序列與耐熱之間有直接聯(lián)系,并且其他因素如氫鍵、離子鍵等也能影響熱穩(wěn)定性[20]。這些理論對利用蛋白質(zhì)工程手段提高腈水合酶的熱穩(wěn)定性起到重要作用。
本研究利用融合自組裝小肽的策略實現(xiàn)了提高P.putida來源NHase的熱穩(wěn)定性。這一類型的小肽最早由麻省理工學(xué)院的Zhang等[21]發(fā)現(xiàn),并證明這些離子化的自互補肽通過正負電荷交替排列的方式形成穩(wěn)定的β折疊結(jié)構(gòu),從而使其在水溶液中經(jīng)歷自組裝后形成有序的納米結(jié)構(gòu)[20]。目前這種人工肽已廣泛應(yīng)用于納米技術(shù)的許多領(lǐng)域,如生物醫(yī)學(xué)納米技術(shù)、細胞培養(yǎng)、分子電子學(xué)等[22]。迄今,具有這種性質(zhì)的多種自組裝肽已應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、藥學(xué)領(lǐng)域,如RAD16-I、RAD16-II、EAK16和ELK16[23-26]。其中EAK16和ELK16用于融合一些蛋白質(zhì)或酶分子后能引起蛋白質(zhì)之間的集聚,形成活性聚集體(active aggregates),能實現(xiàn)蛋白質(zhì)抵抗不利因素的影響,在一定程度上提升酶的穩(wěn)定性。本研究中選用2種自組裝肽與腈水合酶β亞基的N末端融合,結(jié)果發(fā)現(xiàn)融合后的2種新型NHase熱穩(wěn)定性均有提高,且融合ELK16的NHase 50 ℃處理后的半衰期從未融合的約20 min提高到了35 min,并且熱處理后期酶活喪失的速率相比于野生型酶也較低(圖3、圖4)。值得注意的是,之前報道融合了ELK16的蛋白質(zhì)在大腸埃希菌細胞內(nèi)表達時能形成相互聚集的活性包涵體 (active inclusion body)[26],提高細胞生產(chǎn)蛋白質(zhì)的效率。而本研究融合ELK16后發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)蛋白都存在于細胞破碎液的上清中,并不形成大量活性包涵體,這可能由于腈水合酶是個四聚體蛋白質(zhì),1個酶分子中有2個同源的β亞基,這2個β亞基之間的電荷發(fā)生了相互抵消,從而使酶分子之間正負電荷的相互作用減弱,從而沒有形成分子間集聚所得到的活性包涵體。但這對于最大程度保存酶活性有積極意義。本研究中所得到的2種融合型腈水合酶分別保留了野生酶活力的97%和85%。相對于通過定向進化、理性設(shè)計和定點突變等蛋白質(zhì)工程手段,此方法具有靶向性強、構(gòu)建過程簡單、通用性好等優(yōu)點。
本研究通過將自組裝肽融合到腈水合酶非催化亞基的N末端,使得融合酶的熱穩(wěn)定性有一定程度地提高。這種方法對于進一步改造多種酶分子的熱穩(wěn)定性或抗蛋白酶降解性有著借鑒意義。
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Enhancement of Nitrile Hydratase by Translational Fusion of Amphiphilic Short Peptide
FANG Yue-qin1, CUI Wen-jing2, LIU Yi2, ZHOU Li2, LIU Zhong-mei2, ZHOU Zhe-min2
(1.Schl.ofEnvir't&CivilEngin., 2.Schl.ofBiotech.,KeyLab.ofIndust.Biotech.,JiangnanUni.,Wuxi214122)
Nitrile hydratase (NHase) catalyzes nitriles to the amides, it is at present widely used in industrial production of acrylamide. However, the heat released during the catalysis process easily inactivated the enzyme molecule involved. In this study, protein engineering by translational fusion was employed to enhance the thermo-stability of the enzyme. Herein, two types of self-assembling peptides (SAPs) EAK16 and ELK16 was translationally fused to the non-catalytic subunit β of NHase fromPseudomonasputidaNRRL-18668, yielding two chimeric fusions NHase EAK16-NHase and ELK16-NHase. Next, the two types of recombinant proteins were expressed inE.coliand purified before the enzyme activity were determined. It was found that the specific activity for EAK16-NHase and ELK16-NHase was (426±14) U/mg and (372±12) U/mg respectively, reserved 97% and 85% of that in wild-type NHase. Furthermore, after incubation of the wild-type NHase and chimeric NHase at 50 ℃ for a period of 0 min to 60 min and sampled at the interval of 5 min, the residual activity was determined. The data showed that the half-life of the enzymatic activity (T50) for EAK16-NHase and ELK16-NHase was 35 min and 40 min, respectively, while the wild-type enzyme was 20 min, indicating that translational fusion of SAPs was able to augment the thermo-stability of NHase. These results manifested that the thermo-stability was actually able to enhance that was not bound to at the cost of losing activity.
amphiphilic short peptide; fused protein; Nitrile hydrase; enzyme catalysis; thermo-stability
國家863計劃項目(2014AA021304);國家自然科學(xué)基金項目(31400058);江蘇省自然科學(xué)基金(青年基金)項目(BK20130139)
房月芹 女,講師,碩士。研究方向為工業(yè)生物技術(shù)。Tel:0510-85197551,E-mail:fangyq_1@163.com
* 通訊作者。男,博士,教授,博士生導(dǎo)師。研究方向為微生物分子酶技術(shù)。Tel:0510-85325210,E-mail:zhmzhou@jiangnan.edu.cn
2015-01-28;
2015-03-07
Q936
A
1005-7021(2015)05-0013-06
10.3969/j.issn.1005-7021.2015.05.003