• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    融合雙親短肽提高腈水合酶的熱穩(wěn)定性研究

    2015-12-26 10:26:17房月芹崔文璟劉中美周哲敏
    微生物學(xué)雜志 2015年5期
    關(guān)鍵詞:水合亞基熱穩(wěn)定性

    房月芹, 崔文璟, 劉 義, 周 麗, 劉中美, 周哲敏*

    (1. 江南大學(xué) 環(huán)境與土木工程學(xué)院,江蘇 無錫 214122;2. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室,江蘇 無錫 214122)

    ?

    融合雙親短肽提高腈水合酶的熱穩(wěn)定性研究

    房月芹1, 崔文璟2, 劉 義2, 周 麗2, 劉中美2, 周哲敏2*

    (1. 江南大學(xué) 環(huán)境與土木工程學(xué)院,江蘇 無錫 214122;2. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室,江蘇 無錫 214122)

    腈水合酶(Nitirle hydratase, NHase)催化腈類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為酰胺類物質(zhì),目前用于工業(yè)生產(chǎn)丙烯酰胺。但在催化過程中釋放的熱量易導(dǎo)致酶分子失活。研究通過蛋白質(zhì)融合技術(shù)對腈水合酶進行分子改造,提高熱穩(wěn)定性。將2種雙親自組裝肽(self-assembling peptides, SAPs)EAK16和ELK16分別融合至惡臭假單胞菌PseudomonasputidaNRRL-18668來源NHase非催化亞基β的N末端,構(gòu)建出2種融合型NHase:EAK16-NHase和ELK16-NHase。經(jīng)過表達、純化后測定酶活力,發(fā)現(xiàn)EAK16-NHase和ELK16-NHase的酶活力分別為(426±14) U/mg和(372±12) U/mg,保留野生型酶活力的97%和85%。在50 ℃條件下孵育0~60 min,每5 min取樣后測定殘存酶活力,EAK16-NHase和ELK16-NHase酶活力半衰期(T50)分別為35 min和40 min,野生型NHase為20 min。說明融合EAK16和ELK16均能提高NHase的熱穩(wěn)定性。研究表明融合SAPs能在不顯著影響酶活力的條件下提高酶的熱穩(wěn)定性。

    雙親短肽;融合蛋白;腈水合酶;酶催化;熱穩(wěn)定性

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基 惡臭假單胞菌PseudomonasputidaNRRL-18668購自NBRC,E.coliJM109、E.coliBL21 (DE3)表達載體pET24a(+)為本實驗室保存;模板質(zhì)粒pET24a-BAP為本實驗室前期構(gòu)建;TB培養(yǎng)基:胰蛋白胨1.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),酵母提取物2.4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),甘油0.4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)), KH2PO417 mmol/L, K2HPO472 mmol/L,pH 7.0,121 ℃滅菌20 min。

    1.1.2 主要試劑和儀器 DNA marker、Protein marker、質(zhì)粒小量提取試劑盒、蛋白定量試劑盒等購自上海生生物工程有限公司,KOD plus neo、Ligation high LGK-100、膠回收試劑盒購自上海碩盟生物科技有限公司,CloneEZ試劑盒購自GenScript(Piscataway, NJ, USA),底物3-氰基吡啶(3-cyanopyridine)購自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司,PCR引物合成及測序由上海生工生物工程公司完成。

    1.1.3 引物、基因和蛋白質(zhì)序列 基因序列:EAK16和ELK16基因由上海生工生物工程有限公司合成。序列:EAK16:CTGGAACTGGAACTGAAACTGAAACTGGAACTGGAACTGAAACTGAA-ACCGACCCCGCCGACCACCCCGACCCCGCCGAC-CACCCCGACCCCGACCCCG;ELK16:GCGGAAGC-GGAAGCGAAAGCGAAAGCGGAAGCGGAAGCGA-AAGCGAAACCGACCCCGCCGACCACCCCGACCC-CGCCGACCACCCCGACCCCGACCCCG。 蛋白質(zhì)序列:EAK16:AEAEAKAKAEAEAKAKPTPPTTPTPPTTPTPTP;ELK16:LELELKLKLELELKLKPTPPTTPTPPTTPTPTP。引物序列:SAP1F:TAAGAAG-GAGATATACATATGGCGGAAGCGGAAGCG;SAP1-R:ATCGTGAATGCCATTCATATGCGGGGTCGGGG-TCGG;SAP2F:TAAGAAGGAGATATACATATGCTGGAACTGGAACTG;SAP2R:ATCGTGAATGCCATTCATATGCGGGGTCGGGGTCGG。

    1.2 方法

    1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建 利用CloneEZ快速構(gòu)建質(zhì)粒方法將2種自組裝肽EAK16和ELK16分別構(gòu)建到模板質(zhì)粒pET24a-BAP上。首先利用SAP1F和SAP1R擴增EAK16基因,純化PCR產(chǎn)物備用。提取pET24a-BAP質(zhì)粒載體,用NdeI進行單酶切后,將EAK16純化的PCR產(chǎn)物與酶切后的載體及CloneEZ酶混合按CloneEZ說明書方法操作,將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliJM109,過夜培養(yǎng)后挑取單菌落,37 ℃培養(yǎng),測序驗證,構(gòu)建的含有NHase和EAK16融合基因的重組質(zhì)粒命名為pET24a-SAP1-NHase。同樣,利用此方法將ELK16融合到NHase的β亞基N末端,構(gòu)建出的重組載體命名為pET24a-SAP2-NHase。

    1.2.2 腈水合酶在大腸埃希菌中的表達和純化 具體參考余越春等[17]的方法。將以上構(gòu)建的2種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3),挑取單菌落分別接入含有Kan(50 g/mL)的TB液體培養(yǎng)基,過夜活化,次日轉(zhuǎn)接,培養(yǎng)至OD600為1.0,添加IPTG(0.6 mmol/L)、CoCl2·6H2O(0.1 g/L)誘導(dǎo)表達16 h,SDS-PAGE檢測重組蛋白質(zhì)的表達水平。野生型NHase和融合NHase的純化方法參考Liu等[18]報道。

    1.2.3 酶活測定 酶活力采用高效液相色譜法測定 反應(yīng)液體積為0.5 mL,組成為450 μL 20 mmol/L KPB緩沖液、40 μL 200 mmol/L的底物3-cyanopyridine以及10 μL的酶液。25 ℃反應(yīng)10 min后,加入等量乙腈終止反應(yīng)。將終止的反應(yīng)液過0.22 μm濾膜,然后用C18柱進行高效液相層析(high performance liquid chromatography, HPLC)進行酶活檢測,流動相為體積比2∶1的磷酸緩沖液(pH 7.4)與乙腈的混合溶液,流速1 mL/min。腈水合酶的酶活力單位:該酶在25 ℃時每分鐘催化產(chǎn)生1 μmoL煙酰胺所需要的酶量為1 U。

    1.2.4 熱穩(wěn)定性測定 純化后的野生型NHase和2種融合NHase (SAP1-NHase和SAP2-NHase)溶解于10 mmol/L pH 7.5的磷酸鉀緩沖液(KPB)中,使酶終濃度為0.3 mg/mL。酶蛋白分為12組,每組樣品200 μL,分別置于50 ℃金屬浴中孵育,每隔5 min取出1組,立刻置冰上冷卻5 min。待孵育60 min組結(jié)束后。利用1.2.3中的方法測定酶活力。野生酶和融合酶以未熱浴的活力定義為100%,半衰期T50定義為酶活力降低一半時所經(jīng)歷的熱浴時間。每組樣品分別進行3個平行樣測定,數(shù)據(jù)以Mean±SD表示。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 N-末端融合EAK16和ELK16對NHase的影響

    腈水合酶催化活性中心存在于α亞基上,而β亞基不直接參與催化。因此,本研究將2種SAPs融合與NHase的β亞基N末端,構(gòu)建出2種β亞基N末端分別融合EAK16和ELK16的融合NHase,為EAK16-NHase和ELK16-NHase,基因結(jié)構(gòu)如圖1所示。

    經(jīng)過在E.coliBL21(DE3)中誘導(dǎo),細胞經(jīng)超聲波破碎,SDS-PAGE檢測,結(jié)果如圖2所示。重組蛋白成功實現(xiàn)了大量可溶表達。由于野生NHase中α亞基和β亞基理論分子量分別為25 kDa和26.1 kDa,因而在泳道2中2個亞基不容易分離出來,呈現(xiàn)單一條帶。而β亞基融合了EAK16和ELK16后,理論分子量分別增加了3.6 kDa和3.3 kDa,因而α亞基和β亞基通過SDS-PAGE得以分離。圖2中的電泳條帶位置和理論值相符,表明野生型和融合型NHase成功表達。

    圖1 野生NHase和融合NHase的基因結(jié)構(gòu)Fig.1 Gene structure of the wild-type NHase and fused NHase

    圖2 NHase野生酶和融合酶在E.coli中重組表達Fig.2 Heterogenous expression of wild-type and fused NHase in E.coli1:蛋白質(zhì)Marker;2:野生NHase的重組表達;3:融合EAK16的NHase重組表達;4:融合ELK16的NHase重組表達1: Protein Marker; 2:wild-type NHase;3:EAK16-NHase; 4:ELK16-NHase

    2.2 野生型和融合型NHase的純化及酶活性鑒定

    含有重組質(zhì)粒的E.coli細胞經(jīng)過離心收集菌體,超聲波破碎細胞后,將上清液通過硫酸銨分級沉淀(40%~75%)粗分離,透析后再利用Hitrap Q HP 1mL陰離子柱和Superdex 75 10/300GL凝膠層析柱進行進一步分離純化,經(jīng)過SDS-PAGE檢測,得到純度較高的酶,結(jié)果如圖3所示。

    圖3 野生型NHase和融合型NHase的分離純化Fig.3 Separation and purification of wild-type and fused NHase1:蛋白質(zhì)marker;2:純化后的野生型NHase;3:純化后的EAK16-NHase;4:純化后的ELK16-NHase1:protein marker; 2:purified wild-type NHase; 3:purified EAK16-NHase; 4:purified ELK16-NHase

    以3-cyanopyridine為底物,分別測定野生NHase、融合EAK16-NHase和ELK16-NHase的酶活力。結(jié)果顯示,野生酶比酶活為(439±11) U/mg,EAK16-NHase比酶活為(426±14) U/mg,ELK16-NHase比酶活為(372±12) U/mg。融合了EAK16的NHase比酶活與野生型酶相比,沒有明顯降低,而融合了ELK16的NHase少有降低,但也保留了原始酶活的84.7%。表明融合后的NHase酶活均沒有大幅度降低。

    2.3 融合EAK16和ELK16對NHase酶熱穩(wěn)定性的影響

    為了探討NHase分別融合EAK16和ELK16后熱穩(wěn)定的變化,實驗以3-cyanopyridine為底物,定義沒有經(jīng)過50 ℃熱處理的3種酶本身的比活力為100%,在50 ℃下分別孵育NHase、EAK16-NHase和ELK16-NHase至60 min,每隔5 min檢測殘存酶活力,與各自不經(jīng)熱處理的比活力相比,計算殘存酶的百分比,結(jié)果如圖4所示。野生型NHase在經(jīng)過熱處理20 min后,殘存酶活力即低于50%,融合了EAK16或ELK16的NHase酶活半衰期T50延長至30 min和35 min。熱處理40 min后,野生型NHase殘存活力為零,完全失活。而融合了ELK16和EAK16的NHase在同樣處理40min后,殘存酶活力分別為33%和28%。結(jié)果表明,融合EAK16或ELK16均可提高NHase在50 ℃下的熱穩(wěn)定性,且融合ELK16對抗熱變性的作用稍強。

    圖4 融合EAK16和ELK16對NHase熱穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect on thermo-stability of NHase after fusing EAK16 and ELK16, respectively

    3 討 論

    隨著腈水合酶在轉(zhuǎn)化生產(chǎn)丙烯酰胺中的廣泛應(yīng)用,研究人員對其酶學(xué)性質(zhì)如酶活性、Km、Kcat、抑制劑以及底物特異性進行長期系統(tǒng)的探討,多種細菌來源的腈水合酶及其酶學(xué)性質(zhì)被準(zhǔn)確表征。研究發(fā)現(xiàn),絕大多數(shù)細菌來源的腈水合酶最適的催化溫度都在20~37 ℃,其中包括了工業(yè)中已經(jīng)廣泛應(yīng)用的丙烯酰胺第3代生產(chǎn)用菌——玫瑰紅球菌RhodococcusrhodochrousJ1,其最適催化溫度也為35 ℃[19]。然而,在轉(zhuǎn)化丙烯腈生產(chǎn)丙烯酰胺的過程中,反應(yīng)大量放熱,使體系溫度迅速上升,即使采取不斷導(dǎo)熱或散熱的工藝,也不可避免地使體系溫度有較大波動。這種情況對提高丙烯酰胺生產(chǎn)的穩(wěn)定性尤為不利。雖然之前的研究也鑒定出睪丸酮叢毛單胞菌Comamonastestosterone來源的NHase熱穩(wěn)定性較強,但其催化的活性遠低于R.rhodochrousJ1以及Pseudomonasputida來源的NHase。由于目前對嗜熱酶的耐熱機理已有比較系統(tǒng)的研究,已知酶蛋白的一級結(jié)構(gòu)中氨基酸的序列與耐熱之間有直接聯(lián)系,并且其他因素如氫鍵、離子鍵等也能影響熱穩(wěn)定性[20]。這些理論對利用蛋白質(zhì)工程手段提高腈水合酶的熱穩(wěn)定性起到重要作用。

    本研究利用融合自組裝小肽的策略實現(xiàn)了提高P.putida來源NHase的熱穩(wěn)定性。這一類型的小肽最早由麻省理工學(xué)院的Zhang等[21]發(fā)現(xiàn),并證明這些離子化的自互補肽通過正負電荷交替排列的方式形成穩(wěn)定的β折疊結(jié)構(gòu),從而使其在水溶液中經(jīng)歷自組裝后形成有序的納米結(jié)構(gòu)[20]。目前這種人工肽已廣泛應(yīng)用于納米技術(shù)的許多領(lǐng)域,如生物醫(yī)學(xué)納米技術(shù)、細胞培養(yǎng)、分子電子學(xué)等[22]。迄今,具有這種性質(zhì)的多種自組裝肽已應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、藥學(xué)領(lǐng)域,如RAD16-I、RAD16-II、EAK16和ELK16[23-26]。其中EAK16和ELK16用于融合一些蛋白質(zhì)或酶分子后能引起蛋白質(zhì)之間的集聚,形成活性聚集體(active aggregates),能實現(xiàn)蛋白質(zhì)抵抗不利因素的影響,在一定程度上提升酶的穩(wěn)定性。本研究中選用2種自組裝肽與腈水合酶β亞基的N末端融合,結(jié)果發(fā)現(xiàn)融合后的2種新型NHase熱穩(wěn)定性均有提高,且融合ELK16的NHase 50 ℃處理后的半衰期從未融合的約20 min提高到了35 min,并且熱處理后期酶活喪失的速率相比于野生型酶也較低(圖3、圖4)。值得注意的是,之前報道融合了ELK16的蛋白質(zhì)在大腸埃希菌細胞內(nèi)表達時能形成相互聚集的活性包涵體 (active inclusion body)[26],提高細胞生產(chǎn)蛋白質(zhì)的效率。而本研究融合ELK16后發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)蛋白都存在于細胞破碎液的上清中,并不形成大量活性包涵體,這可能由于腈水合酶是個四聚體蛋白質(zhì),1個酶分子中有2個同源的β亞基,這2個β亞基之間的電荷發(fā)生了相互抵消,從而使酶分子之間正負電荷的相互作用減弱,從而沒有形成分子間集聚所得到的活性包涵體。但這對于最大程度保存酶活性有積極意義。本研究中所得到的2種融合型腈水合酶分別保留了野生酶活力的97%和85%。相對于通過定向進化、理性設(shè)計和定點突變等蛋白質(zhì)工程手段,此方法具有靶向性強、構(gòu)建過程簡單、通用性好等優(yōu)點。

    本研究通過將自組裝肽融合到腈水合酶非催化亞基的N末端,使得融合酶的熱穩(wěn)定性有一定程度地提高。這種方法對于進一步改造多種酶分子的熱穩(wěn)定性或抗蛋白酶降解性有著借鑒意義。

    [1] Prasad S, Bhalla TC. Nitrile hydratases (NHases): at the interface of academia and industry[J]. Biotechnol Adv, 2010, 28(6): 725-741.

    [2] Wang YJ, Zheng YG, Xue JP, et al. Characterization of nitrile hydratation catalysed byNocardiasp. 108[J]. World J Microb Biot, 2007, 23(3): 355-362.

    [3] Okamoto S,Eltis LD. Purification and characterization of a novel nitrile hydratase fromRhodococcussp. RHA1[J]. Mol Microbiol, 2007, 65(3): 828-838.

    [4] Alfani F, Cantarella M, Spera A, et al. Operational stability ofBrevibacteriumimperialisCBS 489-74 nitrile hydratase[J].J Mol Catal B-Enzym, 2001, 11(4-6): 687-697.

    [5] Miyanaga A, Fushinobu S, Ito K, et al. Crystal structure of cobalt-containing nitrile hydratase[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2001, 288(5): 1169-1174.

    [6] Petrillo KL, Wu S, Hann EC, et al. Over-expression inEscherichiacoliof a thermally stable and regio-selective nitrile hydratase fromComamonastestosteroni5-MGAM-4D[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2005, 67(5): 664-670.

    [7] Foerstner KU, Doerks T, Muller J, et al. A nitrile hydratase in the eukaryoteMonosigabrevicollis[J]. PLoS One, 2008, 3 (12): e3976.

    [8] Nagashima S, Nakasako M, Dohmae N, et al. Novel non-heme iron center of nitrile hydratase with a claw setting of oxygen atoms[J]. Nat Struct Biol, 1998, 5(5): 347-351.

    [9] Kobayashi M, Shimizu S. Cobalt proteins[J]. Eur J Biochem, 1999, 261(1): 1-9.

    [10]Cui Y, Cui W, Liu Z, et al. Improvement of stability of nitrile hydratase via protein fragment swapping[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2014, 450(1): 401-408.

    [11]Zhou Z, Hashimoto Y, Kobayashi M. Self-subunit swapping chaperone needed for the maturation of multimeric metalloenzyme nitrile hydratase by a subunit exchange mechanism also carries out the oxidation of the metal ligand cysteine residues and insertion of cobalt[J]. J Biol Chem, 2009, 284 (22): 14930-14938.

    [12]Fung SY, Yang H, Bhola PT, et al. Self-Assembling Peptide as a Potential Carrier for Hydrophobic Anticancer Drug Ellipticine: Complexation, Release and In Vitro Delivery[J]. Adv Funct Mater, 2009, 19(1): 74-83.

    [13]Ge J, Lu DN, Yang C, et al. A Lipase-Responsive Vehicle Using Amphipathic Polymer Synthesized with the Lipase as Catalyst[J]. Macromol Rapid Comm, 2011, 32(6): 546-550.

    [14]Schoch GA, Attias R, Belghazi M, et al. Engineering of a water-soluble plant cytochrome P450, CYP73A1, and NMR-based orientation of natural and alternate substrates in the active site[J]. Plant Physiol, 2003, 133(3): 1198-1208.

    [15]Lu X, Liu S, Zhang D, et al. Enhanced thermal stability and specific activity ofPseudomonasaeruginosalipoxygenase by fusing with self-assembling amphipathic peptides[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2013, 97(21): 9419-9427.

    [16]Wang Q, Yang Z, Gao Y, et al. Enzymatic hydrogelation to immobilize an enzyme for high activity and stability[J]. Soft Matter, 2008, 4(3): 550-553.

    [17]余越春, 崔文璟, 劉義, 等.RhodococcusrhodochrousJ1腈水合酶在大腸桿菌中的表達策略[J]. 工業(yè)微生物, 2014, 44 (2): 14-19.

    [18]Liu Y, Cui W, Xia Y, et al. Self-subunit swapping occurs in another gene type of cobalt nitrile hydratase[J]. PLoS One, 2012, 7(11): e50829.

    [19]Nagasawa T, Takeuchi K,Yamada H. Characterization of a New Cobalt-Containing Nitrile Hydratase Purified from Urea-Induced Cells ofRhodococcus-RhodochrousJ1[J]. Eur J Biochem, 1991, 196(3): 581-589.

    [20]沈嘉澍, 沈標(biāo). 嗜熱酶的耐熱機理[J]. 微生物學(xué)雜志, 2010, 30(2): 80-85.

    [21]Zhang S. Fabrication of novel biomaterials through molecular self-assembly[J]. Nat Biotechnol, 2003, 21(10): 1171-1178.

    [22]Zhao XB, Pan F,Lu JR. Recent development of peptide self-assembly[J]. Prog Nat Sci-Mater, 2008, 18(6): 653-660.

    [23]Davis ME, Hsieh PC, Takahashi T, et al. Local myocardial insulin-like growth factor 1 (IGF-1) delivery with biotinylated peptide nanofibers improves cell therapy for myocardial infarction[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006, 103(21): 8155-8160.

    [24]Bokhari MA, Akay G, Zhang S, et al. The enhancement of osteoblast growth and differentiation in vitro on a peptide hydrogel-polyHIPE polymer hybrid material[J]. Biomaterials, 2005, 26(25): 5198-5208.

    [25]Fung SY, Yang H,Chen P. Formation of colloidal suspension of hydrophobic compounds with an amphiphilic self-assembling peptide[J]. Colloid Surface B, 2007, 55(2): 200-211.

    [26]Wu W, Xing L, Zhou BH, et al. Active protein aggregates induced by terminally attached self-assembling peptide ELK16 inEscherichiacoli[J]. Microb Cell Fact, 2011, 10(1):9.

    Enhancement of Nitrile Hydratase by Translational Fusion of Amphiphilic Short Peptide

    FANG Yue-qin1, CUI Wen-jing2, LIU Yi2, ZHOU Li2, LIU Zhong-mei2, ZHOU Zhe-min2

    (1.Schl.ofEnvir't&CivilEngin., 2.Schl.ofBiotech.,KeyLab.ofIndust.Biotech.,JiangnanUni.,Wuxi214122)

    Nitrile hydratase (NHase) catalyzes nitriles to the amides, it is at present widely used in industrial production of acrylamide. However, the heat released during the catalysis process easily inactivated the enzyme molecule involved. In this study, protein engineering by translational fusion was employed to enhance the thermo-stability of the enzyme. Herein, two types of self-assembling peptides (SAPs) EAK16 and ELK16 was translationally fused to the non-catalytic subunit β of NHase fromPseudomonasputidaNRRL-18668, yielding two chimeric fusions NHase EAK16-NHase and ELK16-NHase. Next, the two types of recombinant proteins were expressed inE.coliand purified before the enzyme activity were determined. It was found that the specific activity for EAK16-NHase and ELK16-NHase was (426±14) U/mg and (372±12) U/mg respectively, reserved 97% and 85% of that in wild-type NHase. Furthermore, after incubation of the wild-type NHase and chimeric NHase at 50 ℃ for a period of 0 min to 60 min and sampled at the interval of 5 min, the residual activity was determined. The data showed that the half-life of the enzymatic activity (T50) for EAK16-NHase and ELK16-NHase was 35 min and 40 min, respectively, while the wild-type enzyme was 20 min, indicating that translational fusion of SAPs was able to augment the thermo-stability of NHase. These results manifested that the thermo-stability was actually able to enhance that was not bound to at the cost of losing activity.

    amphiphilic short peptide; fused protein; Nitrile hydrase; enzyme catalysis; thermo-stability

    國家863計劃項目(2014AA021304);國家自然科學(xué)基金項目(31400058);江蘇省自然科學(xué)基金(青年基金)項目(BK20130139)

    房月芹 女,講師,碩士。研究方向為工業(yè)生物技術(shù)。Tel:0510-85197551,E-mail:fangyq_1@163.com

    * 通訊作者。男,博士,教授,博士生導(dǎo)師。研究方向為微生物分子酶技術(shù)。Tel:0510-85325210,E-mail:zhmzhou@jiangnan.edu.cn

    2015-01-28;

    2015-03-07

    Q936

    A

    1005-7021(2015)05-0013-06

    10.3969/j.issn.1005-7021.2015.05.003

    猜你喜歡
    水合亞基熱穩(wěn)定性
    心臟鈉通道β2亞基轉(zhuǎn)運和功能分析
    紅球菌菌株腈水合酶提取方法優(yōu)化
    PVC用酪氨酸鑭的合成、復(fù)配及熱穩(wěn)定性能研究
    中國塑料(2016年7期)2016-04-16 05:25:52
    胰島素通過mTORC2/SGK1途徑上調(diào)肺泡上皮鈉通道α亞基的作用機制
    提高有機過氧化物熱穩(wěn)定性的方法
    可聚合松香衍生物的合成、表征和熱穩(wěn)定性?
    對羥基安息香醛苯甲酰腙的合成、表征及熱穩(wěn)定性
    花生蛋白水合性質(zhì)的研究進展
    二水合丙氨酸復(fù)合體內(nèi)的質(zhì)子遷移和氫鍵遷移
    CTAB-Ti-Co-β沸石的制備、表征及其對環(huán)己烯水合催化性能
    99热国产这里只有精品6| 亚洲av综合色区一区| 国产男女内射视频| 成年人免费黄色播放视频| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲av综合色区一区| 亚洲综合精品二区| 中国国产av一级| 观看av在线不卡| 男的添女的下面高潮视频| 在现免费观看毛片| 国产一区二区在线观看av| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 成人二区视频| 99久久综合免费| 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产在线一区二区三区精| 午夜久久久在线观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 韩国精品一区二区三区| 亚洲精品日本国产第一区| 国产综合精华液| 多毛熟女@视频| 久久国产精品大桥未久av| 丝袜喷水一区| 美女国产高潮福利片在线看| 国产亚洲最大av| 午夜av观看不卡| 最近中文字幕2019免费版| 日韩电影二区| 国产成人欧美| 春色校园在线视频观看| 青青草视频在线视频观看| 91国产中文字幕| 久久久久国产网址| 老熟女久久久| 久久韩国三级中文字幕| 亚洲成国产人片在线观看| 国产精品 国内视频| 亚洲国产精品999| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 女人精品久久久久毛片| 国产成人精品久久二区二区91 | 久久久久人妻精品一区果冻| 最新的欧美精品一区二区| 久久久久久久久久久免费av| 久久久久久久大尺度免费视频| 国产1区2区3区精品| 夫妻午夜视频| av网站免费在线观看视频| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲内射少妇av| 亚洲av欧美aⅴ国产| 伦理电影大哥的女人| 18+在线观看网站| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产精品99久久99久久久不卡 | 色婷婷av一区二区三区视频| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 三上悠亚av全集在线观看| 卡戴珊不雅视频在线播放| 多毛熟女@视频| 欧美精品国产亚洲| 日韩大片免费观看网站| 亚洲精品第二区| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 精品福利永久在线观看| 中文字幕人妻丝袜制服| 高清视频免费观看一区二区| 一区二区日韩欧美中文字幕| videos熟女内射| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 一区在线观看完整版| 电影成人av| 欧美激情高清一区二区三区 | 综合色丁香网| 国产成人91sexporn| 日韩av不卡免费在线播放| 久久精品人人爽人人爽视色| 成年av动漫网址| 黑人猛操日本美女一级片| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 91精品伊人久久大香线蕉| 亚洲精品视频女| 少妇精品久久久久久久| 亚洲成国产人片在线观看| 久久狼人影院| 国产综合精华液| 免费高清在线观看日韩| 一级a爱视频在线免费观看| 国产精品一国产av| 美女高潮到喷水免费观看| 美女中出高潮动态图| 美女视频免费永久观看网站| 春色校园在线视频观看| 制服人妻中文乱码| 日韩制服骚丝袜av| 国产精品成人在线| 中文天堂在线官网| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 最近中文字幕2019免费版| 波野结衣二区三区在线| 久久狼人影院| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 在现免费观看毛片| 最近手机中文字幕大全| 又黄又粗又硬又大视频| 久久精品国产综合久久久| 久久影院123| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 国产亚洲欧美精品永久| 日韩av免费高清视频| 午夜激情久久久久久久| 中文字幕色久视频| 亚洲精品自拍成人| 亚洲,欧美,日韩| 一级黄片播放器| 秋霞在线观看毛片| 丝袜在线中文字幕| 美女视频免费永久观看网站| 在线 av 中文字幕| 欧美国产精品va在线观看不卡| 2021少妇久久久久久久久久久| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 黄色怎么调成土黄色| 久久 成人 亚洲| 观看美女的网站| 黄片播放在线免费| 国产精品无大码| 捣出白浆h1v1| 亚洲第一青青草原| 欧美+日韩+精品| 国产日韩欧美在线精品| 男人舔女人的私密视频| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产xxxxx性猛交| 日韩 亚洲 欧美在线| 高清欧美精品videossex| 免费观看性生交大片5| 我的亚洲天堂| 2018国产大陆天天弄谢| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 最新中文字幕久久久久| 天堂中文最新版在线下载| 免费在线观看完整版高清| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 涩涩av久久男人的天堂| 欧美成人精品欧美一级黄| 麻豆乱淫一区二区| www日本在线高清视频| 亚洲人成电影观看| 大香蕉久久网| 高清视频免费观看一区二区| 看免费成人av毛片| 黄色配什么色好看| 欧美激情极品国产一区二区三区| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 久久人妻熟女aⅴ| 久久99一区二区三区| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲国产精品999| 午夜免费男女啪啪视频观看| 欧美人与善性xxx| 九草在线视频观看| 亚洲经典国产精华液单| 免费观看av网站的网址| 永久免费av网站大全| av在线观看视频网站免费| 欧美日韩一级在线毛片| 久久精品人人爽人人爽视色| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 欧美精品av麻豆av| 在线观看免费日韩欧美大片| 色网站视频免费| 久久av网站| 久久人人97超碰香蕉20202| 久久热在线av| 婷婷色综合大香蕉| 精品国产乱码久久久久久男人| 亚洲成人一二三区av| 免费观看性生交大片5| 精品久久蜜臀av无| 99热国产这里只有精品6| 国产免费现黄频在线看| 乱人伦中国视频| 一个人免费看片子| 一区福利在线观看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 成人午夜精彩视频在线观看| 亚洲中文av在线| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲精品自拍成人| 亚洲av国产av综合av卡| 中文天堂在线官网| 精品人妻偷拍中文字幕| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产97色在线日韩免费| 日日撸夜夜添| 最近最新中文字幕免费大全7| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 精品久久蜜臀av无| 国产激情久久老熟女| 午夜久久久在线观看| 激情五月婷婷亚洲| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 精品第一国产精品| 看免费av毛片| 91精品国产国语对白视频| 午夜福利视频精品| 99久久精品国产国产毛片| 一本大道久久a久久精品| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 久久久久久免费高清国产稀缺| 久久久久久人妻| 欧美变态另类bdsm刘玥| 精品国产露脸久久av麻豆| 这个男人来自地球电影免费观看 | 久久国产精品大桥未久av| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 精品国产乱码久久久久久小说| 一级毛片 在线播放| 男女国产视频网站| 丰满乱子伦码专区| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 一本久久精品| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 欧美av亚洲av综合av国产av | 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产乱人偷精品视频| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 成人亚洲欧美一区二区av| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 美国免费a级毛片| 国产日韩欧美视频二区| 国产在线一区二区三区精| 久久久久久久亚洲中文字幕| 丝袜喷水一区| 欧美97在线视频| 另类亚洲欧美激情| 国产免费现黄频在线看| 免费观看av网站的网址| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 欧美av亚洲av综合av国产av | 日韩精品免费视频一区二区三区| 欧美人与善性xxx| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 久久久亚洲精品成人影院| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 国产在视频线精品| 国产精品免费视频内射| 国产爽快片一区二区三区| 日韩电影二区| 美女高潮到喷水免费观看| 成人毛片60女人毛片免费| 91国产中文字幕| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 两个人看的免费小视频| 嫩草影院入口| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产一级毛片在线| 少妇精品久久久久久久| 伦精品一区二区三区| 亚洲第一区二区三区不卡| 久久精品国产自在天天线| 国产亚洲最大av| 丝袜美足系列| 亚洲精品第二区| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 亚洲天堂av无毛| 久久久久视频综合| 久久综合国产亚洲精品| 精品少妇内射三级| 欧美成人精品欧美一级黄| 免费黄网站久久成人精品| 欧美精品高潮呻吟av久久| 久久久久久久久久久免费av| 日韩伦理黄色片| 丰满迷人的少妇在线观看| 欧美精品av麻豆av| 国产在视频线精品| 韩国精品一区二区三区| 免费在线观看完整版高清| 丝袜人妻中文字幕| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产一区二区 视频在线| 高清不卡的av网站| 丰满少妇做爰视频| 免费日韩欧美在线观看| 国产日韩欧美亚洲二区| 亚洲av电影在线进入| 日韩精品有码人妻一区| 少妇的丰满在线观看| 国产精品免费大片| 亚洲四区av| 国产精品国产三级国产专区5o| 久久久国产欧美日韩av| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产免费福利视频在线观看| 亚洲av成人精品一二三区| 欧美另类一区| 天美传媒精品一区二区| 一本大道久久a久久精品| 国产精品久久久久久久久免| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 天天操日日干夜夜撸| 亚洲人成电影观看| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产片内射在线| 一本大道久久a久久精品| 国产精品蜜桃在线观看| 亚洲精品一二三| 黑丝袜美女国产一区| 国产一区二区在线观看av| 亚洲国产精品一区三区| 精品卡一卡二卡四卡免费| 日韩一区二区三区影片| 精品亚洲成国产av| 久久精品国产亚洲av涩爱| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 一边亲一边摸免费视频| 春色校园在线视频观看| 亚洲av在线观看美女高潮| 大香蕉久久网| 美女主播在线视频| 国产成人av激情在线播放| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲国产看品久久| 亚洲欧美精品自产自拍| 日韩大片免费观看网站| 久久午夜福利片| 自线自在国产av| 伦理电影大哥的女人| 国产精品一国产av| 制服人妻中文乱码| 亚洲精品在线美女| 欧美日本中文国产一区发布| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲情色 制服丝袜| 欧美精品亚洲一区二区| 精品人妻一区二区三区麻豆| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲国产欧美在线一区| 水蜜桃什么品种好| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产免费视频播放在线视频| 中文字幕亚洲精品专区| 欧美激情高清一区二区三区 | 男女啪啪激烈高潮av片| 国产片内射在线| 91精品三级在线观看| 秋霞在线观看毛片| 天堂俺去俺来也www色官网| 亚洲国产最新在线播放| 久久久久久久亚洲中文字幕| 日韩免费高清中文字幕av| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 热re99久久国产66热| 搡老乐熟女国产| 国产1区2区3区精品| 高清不卡的av网站| 一级毛片我不卡| av女优亚洲男人天堂| 久热久热在线精品观看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 天堂中文最新版在线下载| 天天操日日干夜夜撸| 两性夫妻黄色片| 日韩一本色道免费dvd| 男人操女人黄网站| 午夜久久久在线观看| 男女边吃奶边做爰视频| 乱人伦中国视频| 最近中文字幕2019免费版| 亚洲第一区二区三区不卡| 欧美中文综合在线视频| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 精品福利永久在线观看| 丝袜美足系列| 久久精品国产亚洲av涩爱| 久久久久久久久免费视频了| 久久久精品免费免费高清| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产在线一区二区三区精| 永久免费av网站大全| a级毛片黄视频| 亚洲成色77777| 嫩草影院入口| 国产探花极品一区二区| 中文字幕av电影在线播放| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产亚洲欧美精品永久| 国产在线一区二区三区精| 午夜av观看不卡| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 久久99一区二区三区| 在线观看免费高清a一片| 成人免费观看视频高清| 在线观看美女被高潮喷水网站| 亚洲国产看品久久| 一级毛片电影观看| 久久久久久久亚洲中文字幕| 亚洲第一青青草原| 亚洲图色成人| 一二三四中文在线观看免费高清| 色播在线永久视频| 午夜激情av网站| 亚洲欧美色中文字幕在线| 亚洲在久久综合| 久久99精品国语久久久| 国产精品人妻久久久影院| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 丰满饥渴人妻一区二区三| 亚洲五月色婷婷综合| 国产精品不卡视频一区二区| 精品福利永久在线观看| 精品国产一区二区久久| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 满18在线观看网站| 最黄视频免费看| 观看美女的网站| 韩国高清视频一区二区三区| 人妻 亚洲 视频| 性高湖久久久久久久久免费观看| 欧美精品一区二区免费开放| 国产成人精品婷婷| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 丝袜脚勾引网站| 亚洲第一av免费看| 亚洲天堂av无毛| 九九爱精品视频在线观看| 亚洲精品,欧美精品| 在线 av 中文字幕| av网站免费在线观看视频| 丰满少妇做爰视频| 精品酒店卫生间| 午夜91福利影院| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 好男人视频免费观看在线| 两个人看的免费小视频| 大香蕉久久成人网| 性少妇av在线| av国产久精品久网站免费入址| 国产成人欧美| 18禁国产床啪视频网站| 只有这里有精品99| 啦啦啦在线观看免费高清www| 韩国高清视频一区二区三区| 熟女av电影| 国产黄色免费在线视频| 国产人伦9x9x在线观看 | 不卡av一区二区三区| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 午夜精品国产一区二区电影| 国产精品.久久久| 国产黄频视频在线观看| 9热在线视频观看99| 成年美女黄网站色视频大全免费| 日韩欧美精品免费久久| 久久精品国产a三级三级三级| 亚洲人成电影观看| 黄色视频在线播放观看不卡| 2022亚洲国产成人精品| 欧美日韩av久久| av.在线天堂| 亚洲欧美一区二区三区国产| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲欧美清纯卡通| 天天操日日干夜夜撸| 啦啦啦在线免费观看视频4| 亚洲四区av| 欧美日韩一级在线毛片| 色哟哟·www| 国产 精品1| 国产乱人偷精品视频| 亚洲久久久国产精品| 久久人妻熟女aⅴ| 日韩av不卡免费在线播放| 一级片'在线观看视频| 在现免费观看毛片| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 人人妻人人澡人人看| 国产精品 欧美亚洲| 丝袜脚勾引网站| 亚洲男人天堂网一区| 日本午夜av视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产日韩欧美在线精品| 人成视频在线观看免费观看| 青春草亚洲视频在线观看| 97精品久久久久久久久久精品| 亚洲视频免费观看视频| 久久99一区二区三区| 日日撸夜夜添| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 国产成人免费无遮挡视频| 免费黄色在线免费观看| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲国产av影院在线观看| 亚洲国产欧美网| 午夜影院在线不卡| 这个男人来自地球电影免费观看 | 国产免费福利视频在线观看| 亚洲精品国产一区二区精华液| 最近的中文字幕免费完整| 尾随美女入室| 日韩精品有码人妻一区| 老司机影院成人| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 人成视频在线观看免费观看| 在线观看美女被高潮喷水网站| 午夜精品国产一区二区电影| 国产在线视频一区二区| 国产精品久久久久久久久免| 极品少妇高潮喷水抽搐| 一区福利在线观看| 最近中文字幕2019免费版| 免费在线观看黄色视频的| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 91久久精品国产一区二区三区| 卡戴珊不雅视频在线播放| 亚洲少妇的诱惑av| 交换朋友夫妻互换小说| 国产片内射在线| 熟妇人妻不卡中文字幕| 日本免费在线观看一区| 777米奇影视久久| 亚洲图色成人| 精品福利永久在线观看| 日本爱情动作片www.在线观看| 十八禁高潮呻吟视频| 伊人亚洲综合成人网| 丰满少妇做爰视频| 18禁国产床啪视频网站| 色婷婷av一区二区三区视频| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 人妻人人澡人人爽人人| 伦理电影大哥的女人| 天美传媒精品一区二区| 两个人免费观看高清视频| 波多野结衣一区麻豆| 久久人人爽人人片av| 最近中文字幕2019免费版| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲人成网站在线观看播放| 成人黄色视频免费在线看| 欧美人与性动交α欧美软件| 宅男免费午夜| 成人国语在线视频| 亚洲精品成人av观看孕妇| 黄色一级大片看看| 国产 精品1| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 久久精品久久久久久久性| 又大又黄又爽视频免费| 国产av一区二区精品久久| 国产视频首页在线观看| 丝袜美腿诱惑在线| 国产精品熟女久久久久浪| 99热国产这里只有精品6| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 亚洲成国产人片在线观看| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 国产精品熟女久久久久浪| 老汉色av国产亚洲站长工具| 超色免费av| 国产精品三级大全| 天堂俺去俺来也www色官网| 在线精品无人区一区二区三| 男女啪啪激烈高潮av片| 人人澡人人妻人| 日日啪夜夜爽| 麻豆av在线久日| 丰满乱子伦码专区| 在线 av 中文字幕| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 不卡av一区二区三区| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 9色porny在线观看| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 欧美另类一区| 国产淫语在线视频| 爱豆传媒免费全集在线观看| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 日韩人妻精品一区2区三区| 亚洲五月色婷婷综合| 一级片免费观看大全| 一本大道久久a久久精品| 欧美最新免费一区二区三区| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产av精品麻豆| 午夜日韩欧美国产| 18+在线观看网站|