雙歧桿菌黏附素對嗜酸乳桿菌抑制白色念珠菌黏附腸上皮細(xì)胞的促進(jìn)作用

徐艷常勇杰鮑連生張振（通訊作者）437400湖北省咸寧市通城縣人民醫(yī)院43006武漢市婦女兒童醫(yī)療保健中心

雙歧桿菌黏附素對嗜酸乳桿菌抑制白色念珠菌黏附腸上皮細(xì)胞的促進(jìn)作用

徐艷1常勇杰1鮑連生2張振（通訊作者）2
437400湖北省咸寧市通城縣人民醫(yī)院1
430016武漢市婦女兒童醫(yī)療保健中心2

目的：探討雙歧桿菌黏附素對嗜酸乳桿菌（L.acidophillus）抑制白色念珠菌（C.albicans）黏附腸上皮Lovo細(xì)胞的促進(jìn)作用。方法：分離2株L.acidophillusⅠ、Ⅱ，分別將C.albicans、C.albicans+L.acidophillus、C.albicans+不同濃度黏附素、C.albicans+L.acidophillus+不同濃度黏附素與腸上皮Lovo細(xì)胞混合孵育后，計(jì)數(shù)腸上皮Lovo細(xì)胞上黏附C.albicans的個(gè)數(shù)。結(jié)果：雙歧桿菌黏附素對L.acidophillus抑制C.albicans黏附腸上皮細(xì)胞的作用與L.acidophillus的種類和黏附素濃度都有關(guān)。C.albicans+L.acidophillusⅡ+黏附素比C.albicans+L.acidophillusⅠ+同濃度黏附素效果好。結(jié)論：雙歧桿菌黏附素能促進(jìn)L.acidophillus抑制C.albicans黏附腸上皮細(xì)胞的作用。

雙歧桿菌；黏附素；嗜酸乳桿菌；白色念珠菌；腸上皮細(xì)胞

雙歧桿菌（Bifidobacterium）和乳酸桿菌（Lactobacillus）是人體最重要的兩種益生菌，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗菌消炎、抗衰老、降血脂等一系列保健功能[1]。目前文獻(xiàn)報(bào)道Lactobacillus對白色念珠菌（Candida albicans，C.albicans）黏附腸上皮細(xì)胞有抑制作用[2，3]，而另有文獻(xiàn)則認(rèn)為Lactobacillus對C.albicans黏附腸上皮細(xì)胞的抑制作用不明顯[4，5]。本研究將選用兩種不同的嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophillus，L.acidophillus）進(jìn)行C.albicans黏附腸上皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)，以探討L.acidophillus是否對C.albicans黏附腸上皮細(xì)胞有抑制作用，以及雙歧桿菌黏附素能否促進(jìn)L.acidophillus對 C.albicans黏附腸上皮細(xì)胞的抑制作用。

資料與方法

L.acidophillus的分離與生化鑒定：婦科陰道分泌物培養(yǎng)后，革蘭染色陽性、無芽孢、無動(dòng)力，初步鑒定為乳酸桿菌屬，再用微量生化反應(yīng)管鑒定為L.acidophillus，之后將細(xì)菌接種到API乳桿菌鑒定系統(tǒng)進(jìn)一步確認(rèn)。最后采用試劑盒提取細(xì)菌DNA，PCR擴(kuò)增后測序，測序工作由北京諾賽基因公司完成，測序結(jié)果通過GenBank數(shù)據(jù)庫中的BLASTN程序進(jìn)行序列比對，確認(rèn)為L.acidophillus。

Candida albicans：本研究所用的C.albicansATCC 10231購自中國微生物菌種保存中心，在SDA agar培養(yǎng)基中復(fù)蘇后進(jìn)行試驗(yàn)。

腸上皮Lovo細(xì)胞：腸上皮Lovo細(xì)胞由同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)病理教研室贈(zèng)送，Lovo細(xì)胞按常規(guī)傳代培養(yǎng)于含熱滅活10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液（37℃、5％ CO2）中，細(xì)胞接種于含蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待在蓋玻片上形成單層細(xì)胞后，進(jìn)行黏附試驗(yàn)。

雙歧桿菌分泌型黏附素的提取及純化：按鄭躍杰等報(bào)道的方法[6]，將細(xì)菌接種于硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基，置厭氧培養(yǎng)箱37℃48 h，離心收集培養(yǎng)上清，經(jīng)飽和硫酸銨沉淀，Superdex75柱凝膠過濾，Q-Sepharose FF離子交換層析后，收集第一峰，其分子量16 kD，凍干保存。

表1 雙歧桿菌黏附素對L.acidophillusⅠ抑制C.albicans黏附腸上皮細(xì)胞的作用（±s）

表1 雙歧桿菌黏附素對L.acidophillusⅠ抑制C.albicans黏附腸上皮細(xì)胞的作用（±s）

注：與C.albicans組比較，bP＜0.05。

分組C.albicans（個(gè)/細(xì)胞） t P C.albicans 85.62±9.68 C.albicans+L.acidophillusⅠ 83.87±7.33 0.03 ＞0.05 C.albicans+L.acidophillusⅠ+黏附素（1μg/m L） 78.65±8.33 0.11 ＞0.05 C.albicans+L.acidophillusⅠ+黏附素（5μg/m L） 74.29±5.54 0.13 ＞0.05 C.albicans+L.acidophillusⅠ+黏附素（10μg/m L） 67.92±4.38 1.89 ＜0.05bC.albicans+L.acidophillusⅠ+黏附素（20μg/m L） 61.28±4.31 2.27 ＜0.05bC.albicans+L.acidophillusⅠ+黏附素（30μg/m L） 50.75±3.47 3.02 ＜0.05b

表2 雙歧桿菌黏附素對L.acidophillusⅡ抑制C.a lbicans黏附腸上皮細(xì)胞的作用（±s）

表2 雙歧桿菌黏附素對L.acidophillusⅡ抑制C.a lbicans黏附腸上皮細(xì)胞的作用（±s）

注：與C.albicans組比較，aP＜0.01、bP＜0.05。

分組C.albicans（個(gè)/細(xì)胞） t P C.albicans 85.62±9.68 C.albicans+L.acidophillusⅡ 74.38±9.52 0.04 ＞0.05 C.albicans+L.acidophillusⅡ+黏附素（1μg/m L） 48.07±6.45 3.12 ＜0.05bC.albicans+L.acidophillusⅡ+黏附素（5μg/m L） 34.22±5.06 4.57 ＜0.01aC.albicans+L.acidophillusⅡ+黏附素（10μg/m L） 16.61±3.08 6.82 ＜0.01aC.albicans+L.acidophillusⅡ+黏附素（20μg/m L） 14.59±2.64 8.77 ＜0.01aC.albicans+L.acidophillusⅡ+黏附素（30μg/m L） 8.37±1.23 10.16 ＜0.01a

C.albicans黏附試驗(yàn)：取出細(xì)胞玻片，分別加入不同濃度（1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL）純化的雙歧桿菌分泌型黏附素，37℃濕盒溫育30min后，pH 7.4 PBS漂洗1次，再加入用PBS懸浮的C.albicans懸液，37℃濕盒溫育3 h，PBS漂洗2次，自然干燥，甲醇固定10min，革蘭染色鏡檢，油鏡（×1000）下計(jì)數(shù)每個(gè)細(xì)胞黏附的細(xì)菌數(shù)并計(jì)算30個(gè)細(xì)胞的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。依據(jù)上述方法再依次計(jì)數(shù)添加L.acidophillus和不同濃度黏附素后Lovo細(xì)胞上黏附C.albicans的個(gè)數(shù)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，正態(tài)分布計(jì)量資料均以（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

雙歧桿菌黏附素對L.acidophillusⅠ抑制C.albicans黏附腸上皮細(xì)胞的作用：C.albicans在Lovo細(xì)胞上的黏附數(shù)（85.62±9.68）個(gè)/細(xì)胞，C.albicans+L.acidophillusⅠ在Lovo細(xì)胞上的黏附數(shù)（83.87±7.33）個(gè)/細(xì)胞，C.albicans+不同濃度的黏附素（1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL）在Lovo細(xì)胞上的黏附數(shù)逐步減少，但與C.albicans單獨(dú)實(shí)驗(yàn)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），C.albicans+L.acidophillus Ⅰ+不同濃度的黏附素在Lovo細(xì)胞上的黏附數(shù)也逐步減少，10μg/mL、20μg/mL、 30μg/mL的黏附素與C.albicans單獨(dú)實(shí)驗(yàn)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

雙歧桿菌黏附素對L.acidophillusⅡ抑制C.albicans黏附腸上皮細(xì)胞的作用：C.albicans在Lovo細(xì)胞上的黏附數(shù)（85.62±9.68）個(gè)/細(xì)胞，C.albicans+L.acidophillusⅡ在Lovo細(xì)胞上的黏附數(shù)（83.87±7.33）個(gè)/細(xì)胞，C.albicans+不同濃度的黏附素（1μg/mL、5μg/mL、10 μg/mL、20μg/mL、30μg/mL）在Lovo細(xì)胞上的黏附數(shù)逐步減少，但與C.albicans單獨(dú)實(shí)驗(yàn)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），C.albicans+L.acidophillusⅡ+不同濃度的黏附素在Lovo細(xì)胞上的黏附數(shù)也逐步減少，1μg/mL、5μg/mL、10 μg/mL、20μg/mL、30μg/mL的黏附素與 C.albicans單獨(dú)實(shí)驗(yàn)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

討論

黏附是微生物與微生物、微生物與宿主相互關(guān)系的先決條件之一，是微生物在人體定植的第一步。不能黏附于上皮細(xì)胞表面的微生物，只能是過路菌，不能在腸道中存在。C.albicans的黏附對其侵襲及毒力因子的產(chǎn)生和分泌以及進(jìn)一步致病都有重要的意義，選擇較好的方法抑制C.albicans對腸上皮的黏附能有效地減少C.albicans對腸黏膜屏障功能的破壞及其他感染并發(fā)癥。

雙歧桿菌和乳酸桿菌是人體腸道中一種最重要的生理菌，雙歧桿菌和乳酸桿菌黏附于腸黏膜上皮細(xì)胞后，可對宿主發(fā)揮生物屏障、營養(yǎng)、免疫、抗感染、抗腫瘤、抗衰老等生理作用。目前有較多研究都發(fā)現(xiàn)L.acidophillus能抑制C.albicans對腸上皮細(xì)胞的黏附，其機(jī)制有多重研究結(jié)論，有的研究認(rèn)為L.acidophillus的分泌物能抑制C.albicans的生長，也有研究認(rèn)為L.acidophillus能發(fā)揮占位效應(yīng)抑制C.albicans對上皮細(xì)胞的黏附作用，另有研究對Lactobacillus抑制C.albicans黏附上皮細(xì)胞的作用持保留態(tài)度[6]。我們的研究發(fā)現(xiàn)L.acidophillus抑制C.albicans黏附上皮細(xì)胞作用的效果與L.acidophillus菌種有關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)L.acidophillusⅡ比L.acidophillusⅠ效果好，因此選擇L.acidophillus菌種很重要。

目前雙歧桿菌黏附素已較多地應(yīng)用于致病菌感染控制，Rizzo A等發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌黏附素能刺激人體Toll樣受體2和4、白介素8、β干擾素抵抗C.albicans對人體的感染[7]，舒曉亮、Shu XL等的研究表明[8，9]，雙歧桿菌黏附素通過調(diào)節(jié)腸黏膜炎性遞質(zhì)和細(xì)胞因子釋放，對應(yīng)激后腸黏膜損傷修復(fù)有一定作用，能減輕腸缺血再灌注損傷。對致病菌黏附宿主細(xì)胞的機(jī)制已有深入研究，典型的黏附被認(rèn)為需要兩個(gè)基本因素：①受體：通常是位于宿主細(xì)胞表面的糖蛋白結(jié)構(gòu)；②黏附素：即細(xì)菌的表面結(jié)構(gòu)成分，包括菌毛及非菌毛黏附素。本研究在體外觀察了雙歧桿菌純化黏附素對C.albicans黏附腸上皮細(xì)胞的抑制作用。本研究表明：雙歧桿菌純化黏附素能抑制C.albicans對腸上皮Lovo細(xì)胞的黏附，而且，隨著純化黏附素濃度的逐漸增加，這種抑制作用也逐漸增強(qiáng)。當(dāng)濃度達(dá)到30μg/mL時(shí)，這種抑制作用與雙歧桿菌抑制C.albicans對腸上皮Lovo細(xì)胞的黏附作用無明顯差別，說明雙歧桿菌純化黏附素可能對C.albicans在腸上皮細(xì)胞上的受體具有封閉作用，從而阻斷了C.albicans對腸上皮細(xì)胞的黏附和定植。

通過C.albicans在腸上皮細(xì)胞的黏附實(shí)驗(yàn)，我們初步證實(shí)了雙歧桿菌黏附素對L.acidophillus抑制C.albicans黏附腸上皮細(xì)胞的有促進(jìn)作用，這種作用與L.acidophillus的種類和雙歧桿菌黏附素濃度都有關(guān)，其詳細(xì)機(jī)理有待我們進(jìn)一步深入研究。

[1] 張振,王寶香,鮑連生.益生菌在兒科臨床中的應(yīng)用[M].武漢：湖北科學(xué)技術(shù)出版社, 2011.

[2] 鮑連生,艾洪武,張振,等.體外乳桿菌屬對白色假絲酵母菌生長的抑制作用[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2011,21（17）：3739-3740.

[3] Wang S,Wang QY,Xiao BB,et al.Characterization of vaginal lactobacillus strains and their potential antagonistic effects on candida albicans[J].Br Microbiol Res J,2015,6（4）：185-195.

[4] Francieli C,Daiane PC,Eliana Valéria P,et al.Can Lactobacillus acidophilus influence the adhesion capacity of Candida albicans on the combined contraceptive vaginal ring [J].Contraception,2010,81（4）：331-335.

[5] Simone AE,Francieli C,Cinthia GB,et al.Influência da co-agrega??oentre Candida.albicanse Lactobacillusacidophilusna capacidade de adeso destes microrganismosàs células epiteliais vaginais humanas（CEVH）[J].Acta Scientiarum：Health Sciences,2011, 33（1）：1-8.

[6] 鄭躍杰,潘令嘉,王立生,等.雙歧桿菌黏附素的提純[J].中華微生物和免疫學(xué)雜志, 1999,19（3）：196.

[7] Rizzo A,Losacco A,CarratelliCR.Lactobacillus crispatus modulates epithelial cell defense against Candida albicans through Toll-like receptors 2 and 4,interleukin 8 and humanβ-defensins 2 and 3[J].Immunol Lett,2013,15（1-2）：102-109.

[8] 舒曉亮,鐘靜霞,康凱,等.雙歧桿菌黏附素對應(yīng)激大鼠腸黏膜核因子-κB和細(xì)胞因子的影響[J].中華臨床營養(yǎng)雜志,2014,22 （1）：43-48.

[9] Shu XL,Yu TT,Kang K,et al.Protective effects of bifidobacterial adhesin on intestinal mucosa of stressed male rats via modulation of inflammation[J].Int JClin Exp Pathol,2014,7（6）：3324-3331.

Promotion of bifidobacterium adhesins on the inhibition of lactobacillus acidophillus on the adhesion of candida albicans to intestinalepithelial cells

Xu Yan1,Chang Yongjie1,Bao Liansheng2,Zhang Zhen（Correspondingauthor）2
The People'sHospitalofTongcheng County in Xianning City,HuBeiProvince 4374001
TheMaternaland Child Care Service Centre ofWuhan City4300162

Objective：To study the promotion of bifidobacterium adhesins on the inhibition of lactobacillus acidophillus on the adhesion of candida albicans to intestinal epithelial cells.Methods：L.acidophillusⅠ,Ⅱwere selected,C.albicans,C.albicans+L.acidophillus,C.albicans+different concentrations bifidobacterium adhesins,C.albicans+L.acidophillus+different concentrations bifidobacterium adhesinsweremixed with intestinal epithelial lovo cells and were incubated,the number of C.albicanswhich had adhered to intestinal epithelial Lovo cells were counted.Results：The effect of bifidobacterium adhesins on the inhibition of lactobacillus acidophillus on the adhesion of candida albicans to intestinal epithelial cells were related with the type of L.acidophillus and the concentration of adhesins.The effect of C.albicans+L.acidophillusⅡ+adhesins was better than that of C.albicans+L.acidophillusⅠ+same concentration adhesins.Conclusion：Bifidobacterium adhesins could promote the inhibition of lactobacillusacidophilluson theadhesion ofcandidaalbicans to intestinalepithelialcells.

Bifidobacterium；Adhesins；Lactobacillusacidophillus；Candidaalbicans；Intestinalepithelialcells

10.3969/j.issn.1007-614x.2015.28.2

武漢市衛(wèi)計(jì)委臨床醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目[WX13A12號]

Foundation item Clinical medicine research projects funded by health development planning commission of Wuhan city [WX13A12]