基于SRAP的松茸特異性分子標記*

蘭 西，吳松權，金美玉，全雪麗

（延邊大學農(nóng)學院，吉林 延吉 133000）

基于SRAP的松茸特異性分子標記*

蘭 西，吳松權，金美玉，全雪麗**

（延邊大學農(nóng)學院，吉林 延吉 133000）

為了準確鑒定松茸，確保消費者品嘗到貨真價實的松茸，該研究基于SRAP（sequence-related amplified polymorphism分子標記，從300對引物組合中分別篩選出1對松茸特異性引物（ME10、EM6），并將這對引物擴增的特異條帶進行克隆、測序和設計引物后，成功地構建了松茸特異性分子標記（304 bp）。松茸在特異性分子標記（304 bp）均能擴增出條帶，該標記在分子水平上可準確、快速地鑒定出松茸，并可有效地保證松茸的品質。

松茸；假松茸；SRAP；特異性分子標記；特異引物

松茸（Tricholoma matsutake） 屬于口蘑屬 (Tricholoma)真菌[1-2]，菌株與針葉樹根部形成外生菌根[3]。被譽為“菌中之王”[4]。除了可食用外，松茸還具有很高的藥用價值。由于難以合成具有樹木根系活力的營養(yǎng)條件和生物環(huán)境，馴化、栽培十分困難，目前還不能實現(xiàn)人工栽培[5-6]。松茸營養(yǎng)豐富，現(xiàn)代醫(yī)學研究證明松茸可治療糖尿病，并具有抗癌作用[7]?，F(xiàn)已經(jīng)被列為國家重點二級保護物種[8]。

假松茸 (Tricholoma bakamatsutake)即假松口蘑，因其外觀、香味、口感與松茸相似[9]，常被拿來冒充松茸銷售。常規(guī)鑒別松茸與假松茸的方法主要通過目測和顯微鏡觀察子實體形態(tài)特點，但這些常規(guī)方法仍存在較大誤差，易出現(xiàn)判斷失誤的情況。

前人對該領域的研究大多數(shù)是針對多態(tài)性條帶加以分析，該方法具有不穩(wěn)定、差異性大等特點，隨著人們對松茸的不懈探索，近幾年更多分子水平上的不同方法陸續(xù)應用于鑒別松茸和假松茸，如：基于 ITS（internal transcribed spacers）[10]、基于RAPD（polymerase chain reaction） 的 SCAR（sequence characterized amplified regions） 標記[11]。但還沒有基于SRAP（sequence-related amplified polymorphism）的方法區(qū)分松茸和假松茸的報道。SRAP是一種新型的分子技術，具有更高的共顯性、高重復性、多態(tài)性、信息量。除此之外，其引物設計簡單，具有在基因組中分布均勻的特點。因此，SRAP廣泛應用于種質資源遺傳評價、遺傳圖譜構建、繪制基因轉錄圖譜[12-14]。本研究將基于SRAP分子標記構建松茸的特異性分子標記，以探索出一種準確、快速鑒定松茸的方法。

1　材料與方法

1.1材料

分別從黑龍江省牡丹江、吉林省安圖縣、吉林省龍井縣采集松茸子實體，經(jīng)過專家傅偉杰教授鑒定以后，在-75℃的超低溫冰箱中保存。

1.2基因組總DNA提取

采用改進的CTAB（chexadecyltrimethylammonium bromide）法提取松茸與假松茸的DNA[15]。

1.3SRAP分析

松茸、假松茸基因池的建立采用了BSA（bovine serum albumin）方法[16]，選取5個松茸子實體和5個假松茸子實體。每個松茸子實體各取500 ng混合組成松茸池；每個假松茸子實體各取500 ng混合組成假松茸基因池。松茸與假松茸來源見表1。

表1　松茸、假松茸的來源Tab.1　Source of T.matsutake and T.bakamatsutake in this study

1.3.1反應體系

總體積為20 μL，包括模版5 ng·μL-1DNA 2 μL，2 μmol·L-1上游、下游引物各2 μL，2 mmol·L-1dNTP 2 μL，2.5 U·μL-1B Taq DNA聚合酶0.4 μL（Toyobo公司），10×B Taq buffer 2 μL，剩余使用雙重蒸餾水補足。

1.3.2PCR擴增程序

94℃預變性5 min，94℃變性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸1 min，5個循環(huán)；94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，36個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。

1.3.3PCR產(chǎn)物檢測

PCR產(chǎn)物放在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，用0.5 μg·mL-1的溴化乙錠染色。電泳緩沖液為1×TAE（pH 8.0），在85 V恒壓下電泳約40 min左右，用Dolphin凝膠成像儀拍照保存。

1.3.4特異性片段的回收、克隆和測序

將目的DNA片段切下后，裝進1.5 mL的離心管中，按照康為世紀公司膠回收試劑盒說明書將目的片段回收。將回收的片段與pMD18-T載體連接后，轉化到大腸桿菌JM109上，轉化后的片段經(jīng)克隆過夜搖菌培養(yǎng)，提取質粒DNA后，采用M13引物進行鑒定，其鑒定體系總體積為20 μL，包括質粒5 ng·μL-1DNA 2 μL，2 μmol·L-1上游、下游引物各2 μL，2 mmol·L-1dNTP 2 μL，2.5 U·μL-1B Taq DNA聚合酶0.4 μL（Toyobo公司），10×B Taq buffer 2 μL，剩余用雙重蒸餾水補足。鑒定的陽性克隆委托上海英濰捷基貿(mào)易有限公司進行測序。

1.4松茸特異引物設計和PCR擴增

根據(jù)測序結果和引物設計原則用Primer primer 5設計松茸特異性上游引物Tm-1（ACGGAGGGAG GAGGATAACG） 和下游引物Tm-2（ATCTTGCC CTTTGTCCAGCC）；引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。PCR反應總體積為20 μL，除上游、下游引物（2 μmol·L-1）各2 μL，其余成分同1.3.2 PCR反應體系相同。

松茸特異性PCR程序為：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸20 s，循環(huán)30次；最后72℃延伸5 min。

2　結果與分析

2.1SRAP標記

以松茸、假松茸基因池DNA為模板，從300對引物組合中（ME1～ME10和EM1～EM30），篩選出1對松茸具有特異性的引物ME10（TGGGGACAACC CGGCTT）和EM6（GACTGCGTACGAATTGCA）。采用這對引物對構成松茸基因池每個單株的DNA進行擴增（圖1），在松茸單株中均能夠擴增出一條650 bp的條帶，而在假松茸單株中則沒有出現(xiàn)650 bp的條帶。

圖1　引物ME10、EM6對松茸、假松茸的單株PCR擴增圖譜Fig.1　PCR results of individuals of T.matsutake and T. bakamatsutake with primers of ME10 and EM6

圖2　松茸目的片段的堿基序列Fig.2　Sequence of target fragment of T.matsutake

2.2松茸特異引物性標記的建立

根據(jù)測序的結果，設計了1對松茸特異引物Tm-1和Tm-2（圖2雙下滑線部分），對松茸和假松茸基因池DNA的每個單株重新擴增。在Tm-1和 Tm-2的引物擴增中，松茸均能擴增出304 bp的特征帶，但是假松茸未能擴增出任何條帶，結果與預測的相似，見圖3。結果表現(xiàn)出特異標記的準確性和高效。

圖3 引物Tm-1和Tm-2對松茸、假松茸基因池DNA每個單株的PCR擴增圖譜Fig.3　PCR results of individuals of T.matsutake and T. bakamatsutake with primers of Tm-1 andTm-2

2.3對SRAP特異分子標記的驗證結果

為了進一步驗證松茸標記的準確性，用松茸特異性引物（Tm-1、Tm-2）對源自吉林省龍井市、云南省昆明市、日本、云南省寶山鎮(zhèn)等不同地區(qū)松茸和源自云南省麗江市、吉林省安圖縣、吉林省龍井市等不同地區(qū)的假松茸進行了PCR擴增結果見圖4。

圖4 引物Tm-1和Tm-2對松茸和假松茸PCR擴增圖譜Fig.4　PCR results of T.matsutake and T.bakamatsutake with primers of Tm-1 and Tm-2

圖4表明在來源不同的松茸中，松茸特異性引物均擴增出304 bp特異條帶，假松茸中則未擴增出任何條帶。

2.4結論

本研究基于SRAP建立松茸特異性分子標記即304 bp，通過該標記可以在分子水平上快速準確地鑒定出松茸與假松茸?；谒扇滋禺愋蛄袠嫿ǖ姆肿訕擞浛纱_保消費者購買和品嘗到貨真價實的松茸。

3　討論

假松茸目前也屬于中國珍稀的食用菌，因其肉嫩味美，營養(yǎng)物質豐富，而深受人們喜愛。從形態(tài)上很難鑒定出松茸和假松茸，即使是松茸方面專家有時也不能區(qū)分開來。松茸與假松茸相比，其營養(yǎng)價值更高。加之松茸由于種種原因不能人工栽培，目前出售的松茸均為野生松茸，其價格是假松茸價格的10倍以上。因此常有不法商販將假松茸混入松茸中出售，嚴重影響了松茸品質?；赟RAP建立松茸特異性分子標記可以快速、準確地鑒別出松茸與假松茸，不但維護消費者利益，同時也為以采摘松茸為生的菇農(nóng)創(chuàng)造更加公平的條件。

鑒定物種的真?zhèn)纬Ｓ梅肿訕擞浄椒?，該方法是在生物DNA層面進行鑒定，可準確反應出該個體或種群的本質特征[17]，其鑒定結果準確，而且成本低，實驗操作方便，可以在實驗室操作而不需要等待生物生長周期，也不受外界環(huán)境條件的影響[18-19]。目前分子標記方法很多，如RAPD、ITS、SRAP、SCAR等。吳松權等[11]在RAPD分子標記的基礎上建立松茸特異性SCAR標記。SRAP分子標記方法相對RAPD能擴增出更多的條帶，可更加準確地鑒定出松茸與假松茸。沙濤等[10]利用松茸與假松茸存在的核糖體基因間隔區(qū)（ITS）長度大小不一，而將松茸與假松茸區(qū)別開。而本實驗是基于特異基因序列的有無來鑒別松茸，實驗結果更可靠。本研究在SRAP的分子標記基礎上，根據(jù)基因序列的有無，分別發(fā)現(xiàn)了松茸與假松茸的特異序列；同時根據(jù)其特異序列分別設計了1對特異引物，經(jīng)PCR建立了松茸的特異性的分子標記，此分子標記具有高效、準確、可重復等特點，進一步表明了SRAP分子標記在物種真?zhèn)舞b別中的實用性。之前我們曾在SRAP分子標記基礎上克隆了松茸特異性序列（422 bp） 并建立了其特異性分子標記（243 bp）[20]。但該標記仍然不能滿足開發(fā)松茸特異性試劑盒所需的DNA序列及其分子標記的要求。本研究所克隆的松茸特異性DNA序列長度為650 bp，與之前422 bp DNA序列的相似性僅為50.6%，屬于不同的基因或DNA片段；同時所構建的松茸特異性分子標記長度（304 bp）與之前也不同，這些松茸特異性分子標記的建立，為松茸特異試劑盒的開發(fā)奠定了基礎。

將本實驗所得的序列在NCBI上比對分析未發(fā)現(xiàn)任何結果，原因可能是已報到松茸和假松茸基因序列太少，也可能是所得的序列只是基因標記序列，其驗證工作正在進行中。

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Specific Molecular Markers of Tricholoma matsutake Based on SRAP

LAN Xi,WU Song-quan,JIN Mei-yu,QUAN Xue-li
(College of Agriculture,Yanbian University,Yanji 133000,China)

In order to accurately identify between Tricholoma matsutake and T.bakamatsutake,and to ensure that consumers enjoy real T.matsutake,we screened a pair of primer that was specific for T.matsutake from 300 pairs of primers based on SRAP（sequence-related amplified polymorphism molecular markers.Then a SCAR（sequence characterized amplified regionsmarker(304 bp)for T.matsutake was successfully developed with cloning,sequencing and designing specific primers.This SCAR marker only presented in the individuals of T.matsutake,and the marker might be used quickly and accurately identify T.matsutake on the molecular level and effectively guaranteed the quality of the T.matsutake.

Tricholoma matsutake;Tricholoma bakamatsutake;SRAP;molecular markers of specific;specific primer

S646.9A1003-8310（2015）05-0041-05

10.13629/j.cnki.53-1054.2015.05.011

吉林省自然科學基金（20130101146JC）。

蘭西（1989-），女，在讀碩士研究生，主要從事生物技術方面研究。E-mail:1006322610@qq.com

**通信作者：全雪麗（1973-），女，博士，教授，主要從事植物學方面研究。E-mail:quanxueli2000@yahoo.com.cn

2015-06-28