綿陽(yáng)雞屎藤中總黃酮的提取及含量測(cè)定

綿陽(yáng)雞屎藤中總黃酮的提取及含量測(cè)定

劉曉燕，李 彬

(綿陽(yáng)師范學(xué)院化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，四川綿陽(yáng) 621000)

摘要[目的]提取和測(cè)定綿陽(yáng)雞屎藤中總黃酮的含量。[方法]采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，通過(guò)醇提取法從雞屎藤中提取出黃酮類物質(zhì)，對(duì)提取黃酮類物質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證，用紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定其含量。[結(jié)果]提取雞屎藤中總黃酮的最佳工藝條件：60%的乙醇條件下用1∶30的料液比浸泡12 h后在35 ℃的條件下用超聲波提取25 min，測(cè)得雞屎藤中總黃酮的含量為1.37%，平均回收率為91.25%～100.00%。[結(jié)論]雞屎藤葉中總黃酮含量大于雞屎藤莖中總黃酮含量。

關(guān)鍵詞雞屎藤；正交試驗(yàn)法；總黃酮；提?。缓?/p>

中圖分類號(hào)S567

作者簡(jiǎn)介劉曉燕(1965- )，女，四川德陽(yáng)人，副教授，從事無(wú)機(jī)化學(xué)和環(huán)境化學(xué)研究。

收稿日期2015-06-03

Extraction and Determination of Total Flavonoids in Mianyang Chicken Excrement

LIU Xiao-yan, LI Bin(School of Chemistry and Chemical Engineering, Mianyang Normal University, Mianyang, Sichuan 621000)

Abstract[Objective] The flavonoids in the chicken excrement cane were extracted and characterized. [Method] Using orthogonal test, total flavonoids were extracted from chicken excrement cane with alcohol extraction method and the contents were determined with UV spectrophotometry. [Result] The results of orthogonal experimental indicate the optimum conditions is as follows: the optimum solvent is ethanol, the ratio of material to liquid is 1∶30, the optimum soaking time is 12 h, the optimum temperature is 35 ℃, the optimum ultrasonic extraction is 25 min. The results indicate the content of total flavonoids in chicken excrement cane is 1.37%, the average recovery is 91.25%-100.00%. [Conclusion] The content of total flavonoids in the leaves of the chicken excrement cane is more than in its root.

Key wordsChicken excrement rattan; The orthogonal test; Total flavanone; Extraction; Content

雞屎藤屬于茜草科，這種植物有一種腥腥的味道如雞屎，是我國(guó)常見(jiàn)的藥用植物，廣泛地分布在全國(guó)各地，常生長(zhǎng)于氣候溫?zé)?、肥沃、深厚、濕?rùn)的砂質(zhì)壤土的溪邊、河邊、路邊、林旁及灌木叢中，也常攀援在其他植物或巖石上，有極強(qiáng)的生命力，環(huán)境耐受能力極強(qiáng)[1-3]。因雞屎藤化學(xué)成分比較復(fù)雜，且含有一定量的黃酮類化合物，所以它有多種藥理作用[4-6]。如有較強(qiáng)的抗腫瘤作用，顯著的消炎、抗菌、鎮(zhèn)痛作用。此外，雞屎藤水煎液對(duì)氧自由基有顯著的清除作用。很多病理生理如炎癥、腫瘤、衰老及腦缺血等均與氧自由基過(guò)多有密切聯(lián)系。

對(duì)于植物提取物中總黃酮含量測(cè)定[7-14]，常采用紫外分光光度法、高效液相色譜(HPLC)法、一階導(dǎo)數(shù)分光光度法和熒光法等。紫外分光光度法是測(cè)定總黃酮最常用的方法，該方法以亞硝酸鈉-硝酸鋁為顯色劑，充分利用它們與黃酮類物質(zhì)生成的紅色螯合物的這一特征，在510 nm處測(cè)定其吸光度，并以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)照，從而得到中草藥中總黃酮含量。有關(guān)雞屎藤的化學(xué)成分和營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道，但對(duì)綿陽(yáng)雞屎藤黃酮含量的測(cè)定尚未見(jiàn)報(bào)道。筆者在此采用簡(jiǎn)單易行的紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定其總黃酮含量，為開(kāi)發(fā)、利用綿陽(yáng)雞屎藤藥用提供有用的信息。

1材料與方法

1.1儀器101-2A型恒溫干燥箱(上海滬南電爐烘箱廠)；KQ-300E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；T6新世紀(jì)紫外分光光度儀(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；微型高速萬(wàn)能試樣粉粹機(jī)(湖北省黃驊新興電器廠)；SHD-2000型循環(huán)水式多用真空泵(河南鞏義市英予華儀器廠)。

1.2試劑雞屎藤草(6月采自綿陽(yáng)游仙區(qū))；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)；95%乙醇、無(wú)水乙醇、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、石油醚，均為AR，成都市科龍化工試劑廠。

1.3試驗(yàn)方法 摘新鮮雞屎藤莖、葉(綿陽(yáng)市游仙區(qū))→陽(yáng)光下晾曬備用→莖、葉分離→莖、葉烘干(60 ℃)→粉碎→稱量→溶劑浸泡12 h(乙醇濃度、料比)→超聲波處理(溫度、時(shí)間)→減壓抽濾→石油醚萃取→濃縮定容→稀釋→測(cè)定吸光度值→計(jì)算雞屎藤中總黃酮含量。

1.3.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。準(zhǔn)確稱取10 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品到25 ml小燒杯中，加入少量的30%乙醇溶液，使標(biāo)準(zhǔn)樣品部分的溶解，將溶解的樣液轉(zhuǎn)至100 ml容量瓶中，繼續(xù)加入少量的30%乙醇溶液使小燒杯中的固體樣品全部溶解，轉(zhuǎn)入100 ml的容量瓶中，進(jìn)行旋搖使其充分溶解，直至容量瓶中溶液完全澄清。加30%乙醇溶液定容至100 ml，即得到0.1 g/L的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別吸取“1.3.1”蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5于25 ml比色管中，加入0.7 ml 5%亞硝酸鈉溶液混合均勻，靜置7 min后再加入0.7 ml 10%硝酸鋁溶液混合均勻并靜置7 min后，繼續(xù)加入5 ml 1 mol/L的氫氧化鈉溶液，搖勻后用30%乙醇溶液定容至刻度線，再充分搖勻，靜置15 min，用紫外分光光度儀在波長(zhǎng)為510 nm處比色測(cè)定出各樣品溶液的吸光度，試劑空白為參比液，在平行處理的條件下測(cè)定3次，求其平均值。

1.3.3正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。 以提取溶劑系統(tǒng)即乙醇濃度、溶劑系統(tǒng)的料液比、超聲波處理溫度、超聲波處理時(shí)間作為影響提取物雞屎藤中總黃酮含量的4個(gè)主要因素，乙醇濃度取4個(gè)水平，溶劑系統(tǒng)的料液比、超聲波處理溫度、超聲波處理時(shí)間分別取3個(gè)水平，選用L943正交試驗(yàn)表安排試驗(yàn)，共108組，其中乙醇濃度為95%、80%、60%、0%，料液比為1∶10、1∶20、1∶30，超聲波處理時(shí)溫度為25、30、35 ℃，超聲波處理時(shí)間為15、25、35 min；超聲波處理功率100 W。稱取粉碎后的雞屎藤莖、葉各2 g，加入4種不同的溶劑系統(tǒng)、3種不同系統(tǒng)的料液比，平行操作條件下，在常溫下密封靜置浸泡12 h，分別在25、30、35 ℃不同溫度下進(jìn)行15、25、35 min不同時(shí)間的超聲波處理，使其更加充分地提取出雞屎藤中的總黃酮，減壓抽濾后，用少量的石油醚萃取3次，萃取液在恒溫水箱中濃縮至20～40 ml后，在室溫下冷卻，冷卻后轉(zhuǎn)移至50 ml的容量瓶，用30%乙醇溶液定容至50 ml，再移取1 ml待測(cè)液于25 ml比色管中，加入0.7 ml 5%亞硝酸鈉混合均勻，靜置7 min后加入0.7 ml 10%硝酸鋁混合均勻并靜置7 min后，再加入5 ml 1 mol/L的氫氧化鈉，搖勻并用30%乙醇溶液定容至刻度后，充分搖勻后，靜置15 min，用紫外可見(jiàn)分光光度儀在波長(zhǎng)為510 nm處比色測(cè)定出各待測(cè)溶液的吸光度，試劑空白為參比液，在平行處理的條件下測(cè)定3次，求其平均值，并計(jì)算總黃酮的含量。

2結(jié)果與分析

2.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立以蘆丁樣品溶液作為橫坐標(biāo)、吸光度作為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。用最小二乘法進(jìn)行線性回歸分析得出標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為Y=12.543X+0.000 3(R2=0.999 9)。

2.2正交試驗(yàn)

2.2.1溶劑系統(tǒng)的優(yōu)化。雞屎藤中有效成分的提取常用乙醇、水等溶劑，不同溶劑對(duì)雞屎藤有效成分的提取有較大影響，由圖2可知，60%的乙醇水溶液對(duì)提取雞屎藤中總黃酮效果最佳，用乙醇溶劑不僅可以提取出黃酮苷元還可以提取黃酮苷，提取的產(chǎn)率更高；而用水作提取液，過(guò)濾十分的緩慢，對(duì)試驗(yàn)有較大的影響。

2.2.2料液比的優(yōu)化。在正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)條件下，通過(guò)改變不同料液比來(lái)提取雞屎藤中總黃酮含量的分析，從圖3可看出，在1∶10、1∶20、1∶30的料液體條件下，提取雞屎藤中總黃酮含量最佳料液比為1∶30。

2.2.3超聲溫度的優(yōu)化。在正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)的條件下，通過(guò)對(duì)超聲溫度的控制，超聲波在25、30、35 ℃的條件下，經(jīng)過(guò)35 ℃處理后雞屎藤提取液總黃酮含量高(圖4)，由此可以得出提取雞屎藤中總黃酮含量超聲波溫度在35 ℃下效果最佳。

2.2.4超聲時(shí)間的優(yōu)化。在試驗(yàn)優(yōu)化的條件下，以最佳溶劑60%乙醇、最佳料液比1∶30、最佳超聲溫度35 ℃的條件下，平行測(cè)定出稀釋溶液的吸光度，根據(jù)試驗(yàn)稀釋倍數(shù)計(jì)算出體積濃度，從圖5可以得出，超聲波最佳時(shí)間為25min。

2.3提取物的分析

2.3.1提取物的定性分析。

2.3.1.1紫外可見(jiàn)分光光譜分析。黃酮類的化合物大部分均具有C6-C3-C6的基本結(jié)構(gòu)，在240～400nm紫外光譜下大多數(shù)黃酮類化合物具有2個(gè)吸收峰，在320～380nm光譜帶Ⅰ是由B環(huán)取代基性質(zhì)決定，240～270nm光譜帶Ⅱ是由環(huán)取代基性質(zhì)決定的。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液在經(jīng)過(guò)加入亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉顯色處理后帶Ⅰ和帶Ⅱ轉(zhuǎn)移至450～510和415～470nm處，而在510nm左右所提取的樣品圖譜(圖6b)的吸收峰與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液圖譜(圖6a)相似。

2.3.1.2顯色反應(yīng)。黃酮類化合物的基本碳架上常含有堿性氧原子，它的絕大多數(shù)均帶有酚羥基的衍生物，因此能夠與金屬離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)和與較強(qiáng)的還原性試劑發(fā)生顏色反應(yīng)。根據(jù)黃酮類化合物的這些特性可以對(duì)樣品進(jìn)行定性鑒定，結(jié)果表明雞屎藤里含有黃酮類物質(zhì)(表1)。

2.3.2雞屎藤莖、葉中總黃酮含量測(cè)定。在試驗(yàn)優(yōu)化的條件下，以最佳溶劑60%乙醇、最佳料液比1∶30、最佳超聲溫度35 ℃、最佳超聲波時(shí)間25min的條件下，平行測(cè)定出稀釋溶液的吸光度，根據(jù)試驗(yàn)稀釋倍數(shù)計(jì)算出體積濃度。從表2～3可看出，雞屎藤葉中的總黃酮含量大于雞屎藤莖中的總黃酮含量。

表1　樣品顏色反應(yīng)現(xiàn)象

表2　最佳條件下雞屎藤葉中總黃酮含量

表3　最佳條件下雞屎藤莖中總黃酮含量

2.3.3加標(biāo)回收試驗(yàn)。分別取處理過(guò)的樣品(雞屎藤莖和葉)各一份，并加入一定量蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.3.2”樣品測(cè)定步驟進(jìn)行回收試驗(yàn)。結(jié)果表明(表4～5)，雞屎藤莖的平均回收率為91.25%～100.00%，雞屎藤葉為95%～100%，RSD分別為3.7%、2.0%。說(shuō)明這種方法測(cè)定雞屎藤莖和葉中的黃酮含量準(zhǔn)確可靠，也符合定量分析要求。

表4　雞屎藤莖的加標(biāo)回收

3結(jié)論

通過(guò)正交試驗(yàn)采用超聲波輔助醇提取法從雞屎藤中提取黃酮類物質(zhì)，得出醇提取雞屎藤中黃酮類化合物最佳試驗(yàn)條件，根據(jù)最佳試驗(yàn)條件提取雞屎藤中黃酮類物質(zhì)，對(duì)所提取的黃酮類物質(zhì)進(jìn)行光譜掃描、顯色反應(yīng)等表征，用紫外分光光度法測(cè)定其含量。結(jié)果表明，提取雞屎藤總黃酮的最佳試驗(yàn)條件：60%乙醇在1∶30的料液比下溫度為35 ℃的超聲波下提取25min，測(cè)得雞屎藤中總黃酮的含量為1.37%，平均回收率為91.25%～100.00%?？傊暡ㄝo助醇提取

表5　雞屎藤葉的加標(biāo)回收

法是一種全物理的方法，成本低、高效、無(wú)任何污染，是一條理想的提取黃酮類物質(zhì)的途徑，為雞屎藤的利用和開(kāi)發(fā)提供一定的參考。

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