南海鳶烏賊肌原纖維蛋白的熱穩(wěn)定性研究*

馬靜蓉，楊賢慶，馬海霞，陳勝軍，黃卉

1(廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江，524088)

2(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，廣東廣州510300)

鳶烏賊(Symplectoteuthis oualaniensis)屬于鞘亞綱，槍形目，柔魚(yú)科，其生命周期短、生長(zhǎng)率高、繁殖力強(qiáng)，是一種極具開(kāi)發(fā)潛力的頭足類(lèi)資源。其資源豐富，在印度洋、太平洋的赤道和亞熱帶海域廣泛分布，其中分布在南海和印度洋西北部海域的數(shù)量較大，據(jù)報(bào)道其可食部分高達(dá)80%以上，較其他已開(kāi)發(fā)的頭足類(lèi)動(dòng)物都高［1］。

隨著傳統(tǒng)漁業(yè)資源的衰退以及我國(guó)遠(yuǎn)洋漁業(yè)的飛速發(fā)展，我國(guó)南海豐富的鳶烏賊資源被開(kāi)發(fā)，其高值化加工利用成為了當(dāng)前的熱點(diǎn)問(wèn)題。南海鳶烏賊高蛋白低脂肪，能滿足人們對(duì)海洋蛋白的需求;含有豐富的氨基酸，肉美味鮮;豐富的DHA、EPA及鋅鐵元素，具備一定的保健功效［2］。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究較多的頭足類(lèi)加工主要是墨魚(yú)、秘魯魷魚(yú)、阿根廷魷魚(yú)、太平洋褶柔魚(yú)等，對(duì)其肌肉的加工產(chǎn)品主要有魷魚(yú)絲、魷魚(yú)粒、燒烤類(lèi)以及更高值化的魚(yú)糜制品，而對(duì)鳶烏賊特別是南海鳶烏賊胴體肌肉的加工研究卻鮮見(jiàn)報(bào)道，用鳶烏賊胴體肌肉來(lái)制備冷凍魚(yú)糜及相關(guān)的魚(yú)糜制品，不失為其高值化利用的一條可行途徑。

魚(yú)糜，是一種新型的水產(chǎn)調(diào)理食品原料，其主要成分是肌原纖維蛋白。肌原纖維蛋白是水產(chǎn)品加工中主要的利用對(duì)象，是以肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白為主體組成的可支撐肌肉運(yùn)動(dòng)的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，具有重要生物學(xué)功能，其在魷魚(yú)等頭足類(lèi)動(dòng)物中所占比例高達(dá)75% ～85%［3］，除了參與肌肉的收縮外，還與肉制品的流變學(xué)特性如保水性、黏結(jié)性、質(zhì)地、彈性等有著密切的關(guān)系，其熱誘導(dǎo)凝膠對(duì)肉制品的結(jié)構(gòu)特性起主要作用［4］。了解鳶烏賊肌肉性質(zhì)及其肌原纖維蛋白的基本性質(zhì)是利用鳶烏賊胴體肌肉制作魚(yú)糜的首要前提，因此，本文以南海鳶烏賊為研究對(duì)象，研究了其胴體肌肉的基本特性，并重點(diǎn)探索了溫度對(duì)其肌原纖維蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鳶烏賊，來(lái)源于南海水產(chǎn)研究所“南鋒號(hào)”科考船，捕撈于南海海域，-20℃凍藏保存;NaCl，分析純，廣州化學(xué)試劑廠;三氯乙酸，分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠;NaH2PO4，分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠;Tris，分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠;R-250，分析純，廣州化學(xué)試劑廠;Triton X-100，分析純，廣州市博理生物科技有限公司;SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，康為世紀(jì)生物科技有限公司;考馬斯亮藍(lán)R-250，南京建成科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Ultra Turrax T50均質(zhì)機(jī)(德國(guó)IKA公司);Sigma-3K30高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)SIGMA公司);PB-10型精密pH計(jì)(Sartorius公司);3-550A高溫馬弗爐(美國(guó)NeyVULCAN公司);Kjeltec2300全自動(dòng)定氮分析儀(瑞士foss公司);DW-86L626超低溫冷柜(青島海爾特種電器有限公司);Powerpac@HV等電聚焦電泳儀(美國(guó)Bio-rad公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 一般成分的測(cè)定

水分測(cè)定:常壓105℃烘干至恒重(GB/T9695.15-2008);粗蛋白測(cè)定:凱氏定氮法(GB/T50095-2010);粗脂肪測(cè)定:索氏抽提法(GB/T14772-2008);灰分測(cè)定:高溫灼燒灰化法(GB/T9695.18-2008);總揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)的測(cè)定:蒸餾法(SC/T 3032-2007);pH的測(cè)定:pH測(cè)定儀。

1.3.2 胴體肌肉各種蛋白質(zhì)成分的分離及測(cè)定

鳶烏賊胴體肌肉各種蛋白的分離方法參照Hashimoto［5］的方法進(jìn)行。分離出的肌漿蛋白、肌基質(zhì)蛋白、肌原纖維蛋白、堿溶性蛋白及非蛋白氮均采用全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定其含量。

1.3.3 肌原纖維蛋白質(zhì)的提取［6］

取10 g碎肉加6倍的 A液(pH=7.5，0.1 M KCl，20 mmol/L Tris-HCI緩沖液)和2倍的B液(1%Triton，pH=7.5，0.1 mol/L KCl，20 mol/L Tris-HCI緩沖液)，用 IKA 勻漿機(jī)勻漿(9 600 r/min、30 s、5次)，紗布過(guò)濾，除去結(jié)締組織。再用冷凍離心機(jī)離心(4℃、8 000 r/min、15 min)，去上清液，沉淀用 8 倍的A液混合均勻離心，重復(fù)3次。最后用A液將沉淀稀釋至300 mL，即得到肌原纖維蛋白溶液，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定其濃度，為避免反復(fù)凍融，將其分裝于10 mL的離心管中，貯存于-70℃超低溫冰箱中備用。

1.3.4 肌原纖維蛋白溫浴處理方法

取8 mL肌原纖維蛋白溶液于10 mL離心管中，在不同溫度下進(jìn)行保溫反應(yīng)，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的要求，取出各溫浴時(shí)間下的樣液進(jìn)行測(cè)定分析。

1.3.5 不同溫度下鳶烏賊肌原纖維蛋白SDS-PAGE的變化

將溫浴處理后的樣品與5X的凝膠上樣緩沖液以4∶1的比例混合，煮沸10 min，放置于4℃冰箱中備用。電泳采用5%濃縮膠，10%分離膠，初始電壓80 V，當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后，將電壓增大至120 V，當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部上方約1 cm處，關(guān)閉電源，取出凝膠，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色。

2 結(jié)果與分析

2.1 鳶烏賊胴體肌肉一般成分分析

南海鳶烏賊胴體肌肉中，粗蛋白的含量為19.17%，粗脂肪含量?jī)H為0.58%(表1)，高蛋白低脂肪，能夠很好地滿足現(xiàn)代人的膳食需求，為消費(fèi)者提供優(yōu)質(zhì)的海洋蛋白。由于高濃度的非蛋白氮存在，比如揮發(fā)性鹽基氮(VBN)和三甲胺(TMA)，使得一些頭足類(lèi)動(dòng)物肌肉具有強(qiáng)烈的氨臭味，秘魯魷魚(yú)肌肉中VBN 含量最高可達(dá) 247 mg/100 g［6］，新鮮的印度洋鳶烏賊 VBN 含量為 193.7 mg/100 g［7］，然而，本實(shí)驗(yàn)中的南海鳶烏賊的氣味較溫和，測(cè)定其VBN含量為53.2 mg/100 g，但仍高于國(guó)標(biāo)規(guī)定的30 mg/100 g，加工時(shí)應(yīng)適當(dāng)清洗降低其含量。pH值在6.4～6.8之間，無(wú)怪酸味，適合用作食品加工。

表1 南海鳶烏賊胴體肌肉基本營(yíng)養(yǎng)成分%Table 1 Proximate composition of the mantle muscles from Ryukyu squid in South China Sea%

2.2 鳶烏賊胴體肌肉蛋白的組成

Chu等［8］研究了阿根廷魷魚(yú)、赤魷、烏賊、章魚(yú)等幾種頭足類(lèi)動(dòng)物的胴體肌肉蛋白組成，研究發(fā)現(xiàn)其含有的肌原纖維蛋白為50% ～55%。由表2可知，鳶烏賊胴體肌肉中肌原纖維蛋白含量所占比例較高，對(duì)鳶烏賊的加工性質(zhì)，如凝膠性起著關(guān)鍵的作用，因此，可將南海鳶烏賊加工成魚(yú)糜及魚(yú)糜制品。鳶烏賊的肌漿蛋白含量較少，這對(duì)其持水性有影響，使得持水能力相對(duì)較弱，在以后的加工中應(yīng)研究提高其持水性的方法。

表2 南海鳶烏賊胴體蛋白質(zhì)構(gòu)成%Table 2 Protein composition of the mantle muscles from Ryukyu squid in South China Sea%

2.3 鳶烏賊肌原纖維蛋白在不同溫度下SDSPAGE的變化

鳶烏賊屬于頭足類(lèi)動(dòng)物，其肌原纖維蛋白主要包括肌球蛋白重鏈(MHC)、肌動(dòng)蛋白(Actin)、軟體動(dòng)物所特有的副肌球蛋白(PM)以及相對(duì)分子質(zhì)量更小的原肌球蛋白等［9］。如圖1～圖6，SDS-PAGE結(jié)果顯示南海鳶烏賊肌原纖維蛋白的MHC分子質(zhì)量大于245 kDa、PM的分子質(zhì)量在100 kDa左右、Actin分子質(zhì)量接近48 kDa。此外，還能看見(jiàn)重酶解肌球蛋白(HMM)和輕酶解肌球蛋白(LMM)，HMM和LMM的存在，顯示MHC發(fā)生了水解作用，可能是由于存在蛋白水解酶，使得MHC發(fā)生了分解。對(duì)比參考文獻(xiàn)［6，10］，可以發(fā)現(xiàn)鳶烏賊肌原纖維蛋白的 MHC分子質(zhì)量較大，所含有的PM所占的比例較阿根廷魷魚(yú)、秘魯魷魚(yú)等大，研究表明PM對(duì)魷魚(yú)等頭足類(lèi)動(dòng)物的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、凝膠強(qiáng)度等性質(zhì)有很大影響［12-13］，南海鳶烏賊肌肉蛋白中PM所占比例較大，可能會(huì)使得其肌肉的性質(zhì)相比于其他頭足類(lèi)動(dòng)物略有差異。

肌原纖維蛋白隨著溫度的升高、溫浴時(shí)間的延長(zhǎng)，其SDS-PAGE會(huì)發(fā)生明顯變化，MHC、PM、Actin會(huì)有不同程度的降解，且不同溫度下降解的速度不同。

由圖1所示，在4℃條件下，雖然由于取樣的誤差導(dǎo)致2 h的條帶較淡，36 h的條帶顏色比較深，但從整體趨勢(shì)可以看出，48 h內(nèi)，鳶烏賊肌原纖維蛋白的MHC、PM、Actin等未有明顯的變化。說(shuō)明在較低溫度下，鳶烏賊肌原纖維蛋白變化緩慢，在4℃下，至少可以存放2 d。

圖1 4℃水浴下鳶烏賊肌原纖維蛋白SDS-PAGE的變化Fig.1 Changes in SDS of myofibrillar protein from Ryukyu squid during incubation at different time at 4℃

25℃時(shí)，溫浴1 h后，在分子質(zhì)量63 kDa處開(kāi)始出現(xiàn)新的蛋白質(zhì)條帶，MHC在溫浴12 h后開(kāi)始發(fā)生明顯的降解，24 h后基本上完全降解。PM、Actin以及較小分子質(zhì)量的原肌球蛋白等，在溫浴12 h后也開(kāi)始出現(xiàn)明顯的降解，并且隨著溫浴時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，降解程度越來(lái)越大(圖2)。對(duì)比4℃能看到，溫度的升高對(duì)該鳶烏賊肌原纖維蛋白產(chǎn)生了較大的影響。

圖2 25℃水浴下鳶烏賊肌原纖維蛋白SDS-PAGE的變化Fig.2 Changes in SDS of myofibrillar protein from Ryukyu squid during incubation at different time at 25℃

當(dāng)溫度在40℃時(shí)，鳶烏賊肌原纖維蛋白的降解較為快速，溫浴0.5 h后，MHC發(fā)生了明顯的降解，1.5 h后基本降解完全;0.5 h時(shí)在63 kDa處出現(xiàn)了和25℃放置1 h后一樣的蛋白質(zhì)條帶;1 h時(shí)在分子質(zhì)量25 kDa處，開(kāi)始出現(xiàn)新的蛋白條帶，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)越來(lái)越明顯;PM、Actin降解并不明顯，可能是由于放置時(shí)間較短的原因(圖3)。

魷魚(yú)等頭足類(lèi)動(dòng)物，肌肉中存在大量蛋白酶，其蛋白水解活性較其他大多數(shù)的魚(yú)種都高［14］，研究發(fā)現(xiàn)這些酶主要是金屬蛋白酶［15-16］，它會(huì)選擇性的將肌球蛋白微粒分解成重酶解肌球蛋白(HMM)和輕酶解肌球蛋白(LMM)，從而導(dǎo)致肌肉的加工特性如凝膠性較弱。由SDS-PAGE圖分析結(jié)果可知，南海鳶烏賊肌肉中存在這樣的蛋白水解酶，使得MHC發(fā)生降解，其活性在40℃時(shí)較強(qiáng)。同樣，王進(jìn)勉等［7］對(duì)印度洋鳶烏賊加工特性進(jìn)行研究，提到印度洋鳶烏賊的肌肉蛋白質(zhì)中含有一種蛋白酶，這種酶在也是在40℃ 附近有較高活性，會(huì)降解肌球蛋白重鏈。因此，為了保持肌原纖維蛋白較完整的功能性，應(yīng)盡量避免在40℃周?chē)鷮?duì)南海鳶烏賊進(jìn)行加工處理。

EDTA具有螯合金屬的作用，食品級(jí)EDTA可作為金屬蛋白酶抑制劑，并已經(jīng)顯示出了能夠明顯抑制魷魚(yú)肌肉自溶的能力［17］。Konno等［16］研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致秘魯魷魚(yú)肌肉蛋白自溶的蛋白水解酶主要是金屬蛋白酶，當(dāng)添加2 mmol EDTA，肌肉蛋白的自溶被顯著性抑制。由圖4可知，40℃時(shí)，在添加了1 mmol EDTA可以發(fā)現(xiàn)，南海鳶烏賊MHC的降解速度被明顯抑制，在放置了4 h后，仍能看到非常清晰的MHC條帶，進(jìn)一步證明了，南海鳶烏賊肌肉中的確存在蛋白水解酶，主要是金屬蛋白酶，在后期加工中可以通過(guò)添加一定量的EDTA來(lái)抑制肌肉蛋白的自溶作用。

圖4 40℃水浴添加1 mmol EDTA條件下鳶烏賊肌原纖維蛋白SDS-PAGE的變化Fig.4 Changes in SDS of myofibrillar protein from Ryukyu squid during incubation at different time at 40℃with 1 mmol EDTA

從圖5、圖6可以看出，50、60℃溫度下的肌原纖維蛋白，MHC的降解并不明顯，溫浴3～4 h后，仍能看見(jiàn)清晰的MHC蛋白條帶，這種現(xiàn)象和印度洋鳶烏賊尤為相似，王進(jìn)勉等［7］在研究印度洋鳶烏賊肌原纖維蛋白在不同溫度下的變化中也有提及，表明金屬蛋白酶在高溫下失活;然而，PM、Actin等卻降解得比較快速，可能是由于該溫度是鳶烏賊胴體肌肉中各種內(nèi)源酶的適宜溫度。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度為50～70℃時(shí)，肌肉中的一些內(nèi)源性熱穩(wěn)定性蛋白酶會(huì)分解肌球蛋白，在魚(yú)糜凝膠的過(guò)程中，會(huì)導(dǎo)致凝膠劣化現(xiàn)象的發(fā)生［18］。因此，如若用鳶烏賊制作魚(yú)糜制品，為獲得凝膠質(zhì)量好的產(chǎn)品，應(yīng)快速通關(guān)此溫度帶。

圖5 50℃水浴下鳶烏賊肌原纖維蛋白SDS-PAGE的變化Fig.5 Changes in SDS of myofibrillar protein from Ryukyu squid during incubation at different time at 50℃

圖6 60℃水浴下鳶烏賊肌原纖維蛋白SDS-PAGE的變化Fig.6 Changes in SDS of myofibrillar protein from Ryukyu squid during incubation at different time at 60℃

3 結(jié)論

南海鳶烏賊是一種優(yōu)質(zhì)的水產(chǎn)品，高蛋白，低脂肪，肌原纖維蛋白所占比例達(dá)59.63%，其氣味溫和，無(wú)怪酸味，為其制作魚(yú)糜的加工利用創(chuàng)造了可能。通過(guò)對(duì)不同溫度下肌原纖維蛋白的SDS-PAGE變化的研究表明，在4℃下，肌球蛋白重鏈(MHC)、副肌球蛋白(PM)、肌動(dòng)球蛋白(Actin)48 h內(nèi)無(wú)明顯變化;25℃下，MHC溫浴12 h后開(kāi)始發(fā)生明顯的降解，24 h后完全降解;40℃時(shí)，降解嚴(yán)重，溫浴0.5 h后，MHC就發(fā)生明顯的降解，1.5 h后基本上降解完全，在南海鳶烏賊胴體肌肉中存在金屬蛋白酶，它會(huì)使MHC發(fā)生降解，從而影響肌肉蛋白的加工性質(zhì)，其最適溫度為40℃，通過(guò)添加1 mmol的EDTA，可以顯著抑制該金屬蛋白酶的活性。在鳶烏賊魚(yú)糜制品的加工中，為了獲得更好的凝膠性能，應(yīng)繼續(xù)研究抑制此蛋白酶的方法。

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