纖維素酶法制備馬鈴薯渣可溶性膳食纖維的理化及功能性質(zhì)*

程力，張獻(xiàn)梅，顧正彪，3，洪雁，3，李兆豐，3，李才明

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫，214122)

2(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫，214122)

3(食品安全與營(yíng)養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇無(wú)錫，214122)

膳食纖維被稱為是繼水、蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、礦物質(zhì)、維生素之外的“第七大營(yíng)養(yǎng)素”，是指在人體小腸內(nèi)不能被消化吸收，而在人體大腸能部分或全部發(fā)酵的植物性成分、非淀粉類碳水化合物，包括多糖、寡糖、木質(zhì)素以及相關(guān)的植物物質(zhì)［1］。根據(jù)膳食纖維溶解性的不同，可將其分為可溶性膳食纖維(soluble dietary fiber，SDF)和不溶性膳食纖維(insoluble dietary fiber，IDF)兩大類［2］。研究證實(shí)，IDF 主要作用在于使腸道產(chǎn)生機(jī)械蠕動(dòng)，加速腸道排空，生理活性較弱，沒有明顯的保健作用;而SDF則更多的是發(fā)揮新陳代謝的功能，比如參與和影響碳水化合物和脂類代謝［3］。

馬鈴薯渣含有淀粉、纖維素、果膠及少量蛋白質(zhì)等可利用組分，是一種富含膳食纖維的馬鈴薯淀粉加工副產(chǎn)物，且其中的SDF含量較高，具有很高的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。傳統(tǒng)的酶法制備的馬鈴薯渣膳食纖維(potato pulp dietary fiber，PDF)中淀粉殘存量高，影響了PDF的品質(zhì)，限制了其應(yīng)用范圍，而利用馬鈴薯渣直接制備SDF并對(duì)其理化功能性質(zhì)的研究極為有限。

研究團(tuán)隊(duì)的前期工作表明，馬鈴薯渣中的纖維素易被纖維素酶降解，且淀粉由于纖維素組分的包裹和阻隔較難被酶水解利用。因此，本研究通過(guò)采用纖維素酶改性馬鈴薯渣，提高SDF含量，解除其對(duì)淀粉的包裹作用，再利用酶法去除淀粉制備了可溶性膳食纖維(C-SDF)。在此基礎(chǔ)上，對(duì)C-SDF的理化及功能性質(zhì)進(jìn)行表征，并與市售的可溶性膳食纖維(S-SDF)和傳統(tǒng)酶法制備PDF進(jìn)行對(duì)比分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

濕馬鈴薯渣，內(nèi)蒙古奈倫集團(tuán)股份有限公司提供;α-高溫淀粉酶(酶活力2 000 U/mL)、葡萄糖苷淀粉酶(酶活力100 000 U/mL)、纖維素酶(酶活力70 U/mL)，購(gòu)于 Sigma-Aldrich集團(tuán);胰脂肪酶(酶活3 000 U/g)，購(gòu)于上海沃凱藥業(yè)有限公司;葡萄糖試劑盒，購(gòu)于北京利德曼生化股份有限公司;其他試劑均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

SHZ-B水浴恒溫振蕩器，上海博泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;Nicolet iS10傅立葉變換紅外光譜儀，美國(guó)Thermo Scientific公司;AR-G2型流變儀，美國(guó)TA公司;ICS-5000型高效陰離子交換色譜，美國(guó)Dionex公司;Waters 1525型高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 纖維素酶制取馬鈴薯渣可溶性膳食纖維的工藝

［4］的方法，并綜合考慮SDF的得率和質(zhì)量，調(diào)整傳統(tǒng)制備工藝，以濕馬鈴薯渣為原料，首先采用纖維素酶對(duì)馬鈴薯渣進(jìn)行改性，一定程度的破壞纖維素的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，降低其對(duì)淀粉溶出糊化的阻礙，然后再去除淀粉。傳統(tǒng)制備工藝首先去除淀粉，再用纖維素酶、木聚糖酶改性，根據(jù)馬鈴薯渣組分酶解特性的研究結(jié)果，未經(jīng)處理的馬鈴薯渣淀粉酶法降解率低，殘存量大，在經(jīng)纖維素酶、木聚糖酶處理后被束縛的未降解的淀粉會(huì)進(jìn)一步溶出糊化，經(jīng)后續(xù)醇沉工序?qū)⒒斓絊DF中，影響SDF的品質(zhì)。因此，調(diào)整傳統(tǒng)制備工藝，旨在既有利于淀粉的去除又避免了傳統(tǒng)工藝后續(xù)流程中淀粉的進(jìn)一步溶出，影響SDF的品質(zhì)。具體工藝及條件如下:

稱量一定量的濕馬鈴薯渣，按薯渣∶水=1∶5混勻，1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至4.5，纖維素酶酶添加量為20 U/g、溫度50℃，酶解時(shí)間4 h，反應(yīng)結(jié)束后沸水浴中滅酶10 min;1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至5.0，加入α-高溫淀粉酶，95℃反應(yīng)1 h;1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.0，加入葡萄糖苷淀粉酶，60℃反應(yīng)30 min，沸水浴中滅酶10 min;真空抽濾后得到的濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮;濃縮后的濾液，加4倍體積沉淀SDF，室溫下放置過(guò)夜;4 500 r/min離心5 min分離，95%乙醇洗滌3次;置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中50℃干燥12 h，即得 SDF。采用此條件制得的 C-SDF得率達(dá)31.94%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，占總膳食纖維(total dietary fiber，TDF)含量的62.93%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。

1.2.2 單糖及半乳糖醛酸的測(cè)定

分別稱取樣品C-SDF和S-SDF各(100±10)mg于2支試管中，每支試管加入(1.00±0.10)mL 72%的H2SO4，攪拌1 min，在30℃水浴中水浴(60±5)min，每隔5～10 min攪拌1次，使其充分水解;然后加入(28.00±0.04)mL去離子水，使H2SO4稀釋到4%，混合均勻，密封好后置于壓力鍋中，于121℃反應(yīng)60 min，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫;然后取100 μl的水解液于小試管中，加去離子水稀釋，最后定容到10 mL采用ICS-5000離子色譜儀測(cè)定［5］。色譜柱:CarboPac PA20;檢測(cè)器:脈沖安培檢測(cè)器，流速 0.5 mL/min。

1.2.3 紅外光譜測(cè)定

取適量的KBr和樣品，研磨充分，壓片法制備薄片，使用傅立葉紅外光譜儀測(cè)試。條件如下:以空氣為參比，掃描波數(shù)范圍為4 000～500 cm-1，掃描次數(shù)為32次，通過(guò)Omnic8.0軟件分析結(jié)果［5］。

1.2.4 分子質(zhì)量分布測(cè)定

分別準(zhǔn)確稱取0.100 0 g C-SDF和S-SDF，溶于去離子水中并定容至25 mL，過(guò)0.45 μm尼龍微孔膜，濾液采用Waters 1525高效液相色譜儀測(cè)定。色譜柱:UltrahydrogelTMLinear 300 mm×7.8 mmin×2;流動(dòng)相:0.1 mol/L NaNO3;流速:0.9 mL/min;柱溫45℃。

1.2.5 黏度測(cè)定

樣品制備方法:使用去離子水溶解C-SDF和SSDF樣品，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%(以干基計(jì))，攪拌均勻使其充分溶解。

取上述方法制成的樣品溶液置于流變儀上，測(cè)試條件如下:2.0 cm平板，間隙1 mm，溫度設(shè)為25℃，測(cè)定樣品在剪切速率(γ)為0～100 s-1內(nèi)黏度及剪切應(yīng)力的變化［6］。

1.2.6 葡萄糖透析延遲指數(shù)的測(cè)定

測(cè)定方法參考 Cheickna Daou［7］和黃清霞等［8］的方法，分別在30、60、90 min時(shí)測(cè)定透析液中葡萄糖含量。葡萄糖透析延遲指數(shù)(GDRI)的計(jì)算［公式(1)］:

1.2.7 α-淀粉酶活力抑制力的測(cè)定

測(cè)定方法參照文獻(xiàn)［9］，淀粉酶活力抑制力以還原糖減少量的百分比計(jì)，計(jì)算公式(2):

式中:A—空白樣中未添加樣品時(shí)反應(yīng)所測(cè)得的還原糖的含量，g/100g;A1—添加樣品反應(yīng)后所測(cè)得的還原糖的含量，g/100g。

1.2.8 膽酸鈉的體外吸附測(cè)定

測(cè)定方法參照文獻(xiàn)［10］。

1.2.9 胰脂肪酶活力抑制力的測(cè)定

測(cè)定方法參照文獻(xiàn)［9］，脂肪酶活力的抑制力定義為自由脂肪酸產(chǎn)生量與對(duì)照相比降低的百分率;計(jì)算公式(3):

式中:V0—不加樣品時(shí)，所消耗的NaOH體積，做為對(duì)照，mL;V—滴定所消耗的NaOH溶液的體積，mL。

1.2.10 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 8.5進(jìn)行圖形處理;采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，顯著性分析采用Ducan’多重檢驗(yàn)(P＜0.05);數(shù)值均以(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，實(shí)驗(yàn)中所涉及數(shù)據(jù)平行測(cè)定至少3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 C-SDF的理化性質(zhì)研究

2.1.1 單糖組成分析

由表1可知，C-SDF中半乳糖醛酸含量最高，葡萄糖和半乳糖次之，其次是阿拉伯糖和鼠李糖，木糖含量極低，初步分析C-SDF中主要成分為果膠和聚葡萄糖;S-SDF中僅含有葡萄糖和半乳糖，且葡萄糖含量高達(dá)83.43%，初步分析S-SDF屬于聚葡萄糖類可溶性膳食纖維［10］。

表1 C-SDF和S-SDF的單糖組成及半乳糖醛酸含量Table 1 The neutral monosaccharide content ratio and Gal A of SDF

2.1.2 紅外光譜掃描分析

由圖1可知，C-SDF、S-SDF和PDF都具有糖的特征吸收峰。1 600～1 800 cm-1處的吸收峰是C=O的吸收峰，說(shuō)明樣品中都存在糖醛酸;1 739 cm-1處為半纖維素羰基(C=O)的伸縮振動(dòng)，說(shuō)明在C-SDF中存在可溶性的半纖維素成分，但吸收峰很弱說(shuō)明可溶性的半纖維素含量極少，PDF中此處吸收峰很強(qiáng)，說(shuō)明半纖維素含量相對(duì)較高;895～899 cm-1處的吸收峰是由β-吡喃糖C-H變角振動(dòng)引起的，說(shuō)明SDF中存在 β-吡喃糖［11］。

圖1 馬鈴薯渣中各組分傅里葉紅外光譜圖Fig.1 FTIR spectra of potato pulp’s composition

2.1.3 分子質(zhì)量分布分析

由表2可知，C-SDF的重均分子質(zhì)量(Mw)分布集中在266～137 687 Da，其中最大Mw為137 687 Da，與果膠的Mw 125 111 ～146 841 Da基本相符［12-13］，進(jìn)一步證明C-SDF中含有果膠，可能還含有可溶性的纖維素或半纖維素片段;而S-SDF的Mw分布集中在445 Da和1 695 Da，其中 Mw為445 Da的部分所占比例為52.87%，Mw為1 695的部分占47.13%。

表2 C-SDF和S-SDF相對(duì)分子質(zhì)量分布Table 2 Relative molecular weight distribution of C-SDF and S-SDF

2.1.4 黏度分析

SDF的黏度對(duì)其生理功能有重要影響，相對(duì)較大的黏度有利于延緩和降低消化道中其他食物成分的消化吸收，有利于SDF發(fā)揮其降血糖和降血脂作用，有研究表明只有高黏度的SDF才對(duì)預(yù)防或治療高膽固醇病有預(yù)防作用［14］。C-SDF和S-SDF的靜態(tài)流變曲線如圖2所示。

圖2 C-SDF和S-SDF的黏度Fig.2 The viscosity of C-SDF and S-SDF

采用Herschel–Bulkley方程對(duì)曲線進(jìn)行擬合，結(jié)果如表3所示。由表中擬合參數(shù)可知，C-SDF的屈服應(yīng)力σ0和稠度系數(shù)K值均大于S-SDF的σ0和K。這主要是由SDF分子質(zhì)量大小導(dǎo)致的，C-SDF相對(duì)較高的黏度性質(zhì)，將賦予其較好的降血糖、降血脂的功能性質(zhì)。

表3 C-SDF和S-SDF的Herschel–Bulkley擬合參數(shù)Table 3 Rheological parameters of C-SDF and S-SDF

2.2 C-SDF的功能性質(zhì)研究

2.2.1 葡萄糖透析延遲指數(shù)分析

葡萄糖透析延遲指數(shù)(GDRI)可以有效反映葡萄糖在胃腸道被延遲吸收的情況，通過(guò)測(cè)定糖透析延遲指數(shù)可以評(píng)價(jià)膳食纖維降低餐后血糖的能力［15］。

從圖3可以看出C-SDF的葡萄糖延遲擴(kuò)散能力均顯著高于S-SDF和PDF(P＜0.05)，這可能是經(jīng)纖維素酶作用得到的SDF中由于酶對(duì)細(xì)胞壁的部分降解作用，使得部分纖維素可溶的同時(shí)纖維結(jié)構(gòu)變得較疏松，比表面積增大，暴露出來(lái)的功能基團(tuán)增多，CSDF與葡萄糖分子間的相互作用增強(qiáng)，并且C-SDF較好的溶解性使它與葡萄糖之間的接觸吸附更加充分;PDF結(jié)構(gòu)致密，錯(cuò)綜復(fù)雜的纖維結(jié)構(gòu)阻礙了功能基團(tuán)與酶的接觸，無(wú)法發(fā)揮作用;Adiotomre等［16］報(bào)道多糖黏度對(duì)葡萄糖在腸道吸收的延遲程度具有很大影響，S-SDF則由于黏度較小及功能成分的不同，葡萄糖延遲擴(kuò)散能力低于C-SDF。

圖3 C-SDF、S-SDF和PDF的葡萄糖透析延遲指數(shù)Fig.3 GDRI of C-SDF，S-SDF and PDF

2.2.2 α-淀粉酶活力抑制力

膳食纖維對(duì)α-淀粉酶活力的抑制作用是其降血糖功能的另一作用機(jī)理。淀粉酶活力受到抑制后淀粉的酶解受到限制，被水解成小分子糖的量變小，使得血糖水平降低。綜合分析C-SDF對(duì)α-淀粉酶活力的抑制作用和它的葡萄糖延遲擴(kuò)散能力有助于進(jìn)一步從機(jī)理上解釋其降血糖原因。

由圖4可知，C-SDF對(duì)α-淀粉酶活力的抑制力高于PDF和S-SDF，但三者之間無(wú)顯著差異(P≥0.05)。研究報(bào)道顯示膳食纖維對(duì)淀粉酶活力抑制作用的機(jī)理包括:膳食纖維對(duì)淀粉酶或淀粉的束縛作用阻礙了底物對(duì)酶的可及性，以及膳食纖維的表面基團(tuán)對(duì)淀粉酶活力的抑制作用［17］。PDF表現(xiàn)出了較大的α-淀粉酶活力抑制力，可能是其中復(fù)雜的纖維素和半纖維素結(jié)構(gòu)，對(duì)淀粉或淀粉酶的束縛作用大于C-SDF增加的活性基團(tuán)對(duì)淀粉酶活力的抑制作用;S-SDF的組成結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單黏度較小，具有最小的淀粉酶活力抑制力［18］。

圖4 C-SDF、S-SDF和PDF的淀粉酶活力抑制力Fig.4 α-Amylase inhibitory activity of C-SDF，S-SDF and PDF

2.2.3 膽酸鈉的體外吸附分析

膳食纖維對(duì)膽酸鈉的吸附能力可以用來(lái)衡量其降血脂的功能特性，膳食纖維通過(guò)在小腸中束縛膽酸鹽及促進(jìn)膽酸鹽的排出來(lái)降低膽固醇，間接發(fā)揮降血脂功效［19］。膳食纖維可以通過(guò)疏水相互作用、范德華力和氫鍵等與膽酸鹽發(fā)生相互作用，或以其中一種作用力為主，實(shí)現(xiàn)對(duì)膽酸鹽的吸附、促進(jìn)膽酸鹽的排出，發(fā)揮降血脂的作用［20］。

由圖5可知，溶液中膽酸鈉濃度隨時(shí)間的推移而不斷減小，說(shuō)明溶液中的膳食纖維持續(xù)的發(fā)揮著吸附膽酸鈉的作用。C-SDF在最開始的30 min內(nèi)，膽酸鈉濃度變化較為顯著，30～45 min時(shí)略微減慢，而后則趨于平緩;S-SDF在最開始的15 min內(nèi)，膽酸鈉濃度變化較為顯著，15～60 min變化緩慢，之后區(qū)域平緩;PDF在最開始的15 min內(nèi)，膽酸鈉濃度變化較為顯著，15～30 min內(nèi)略微減慢，而后則趨于平緩。CSDF趨于平緩的極限值低且趨于平緩所用時(shí)間長(zhǎng)，說(shuō)明C-SDF可以較長(zhǎng)時(shí)間發(fā)揮吸附膽酸鈉的作用且吸附能力較強(qiáng)。

圖5 C-SDF、S-SDF和PDF的膽酸鈉吸附力Fig.5 The bile sodium adsorbility of C-SDF，S-SDF and PDF

2.2.4 胰脂肪酶活力抑制力分析

膳食纖維對(duì)胰脂酶活力的抑制作用可作為它降血脂的另一表征。由膳食纖維引起的脂肪水解率的降低是非常有利的，脂肪水解率降低會(huì)延長(zhǎng)餐后飽腹感的時(shí)間并且減輕脂肪消化系統(tǒng)的負(fù)擔(dān)［21］。

由圖6可知，C-SDF的胰脂肪酶活力抑制力顯著高于S-SDF和PDF。推測(cè)其原因C-SDF中因酶的作用纖維片段變小，比表面積增大，功能集團(tuán)更多地暴露出來(lái)，使其對(duì)油或酶的包囊作用增大，限制了油對(duì)酶的可及性，從而降低了胰脂酶的活力。而PDF因結(jié)構(gòu)致密，大部分功能集團(tuán)被束縛在纖維結(jié)構(gòu)內(nèi)部，阻礙了其與油或酶的接觸，限制了其對(duì)胰脂肪酶活力的抑制作用［22］。

圖6 C-SDF、S-SDF和PDF的胰脂酶活力抑制力Fig.6 Pancreatic lipase inhibitory activity of C-SDF，S-SDF and PDF

3 結(jié)論

C-SDF的單糖組成中半乳糖醛酸含量最高，其次是葡萄糖和半乳糖，紅外光譜顯示它屬于多糖類物質(zhì)且有明顯的糖醛酸類物質(zhì)吸收峰，分子質(zhì)量分布顯示其最高M(jìn)w與果膠的分子質(zhì)量分布基本一致，C-SDF的主要成分為果膠和β-葡聚糖;C-SDF因含有果膠，分子質(zhì)量和黏度值均高于S-SDF;C-SDF的葡萄糖延遲擴(kuò)散能力、α-淀粉酶活力抑制力、膽酸鈉的吸附能力和胰脂肪酶活力抑制力均高于PDF和S-SDF，在降血糖、降血脂方面將具有廣泛的用途。

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