美拉德反應(yīng)對(duì)金帶細(xì)鲹魚(yú)肉蛋白酶解物功能特性及潛在危害物形成的影響*

王軍，王忠合，傅力，盧彬

1(韓山師范學(xué)院生命科學(xué)與食品科技學(xué)院，廣東潮州，521041)

2(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊，830052)

金帶細(xì)鲹(Selaroides leptolepis)為鲹科細(xì)鲹屬的魚(yú)類(lèi)，俗名木葉鲹，為近海暖水性魚(yú)類(lèi)，產(chǎn)于南海、臺(tái)灣海峽。其富含蛋白質(zhì)、氨基酸和維生素，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高［1］。

糖基化是近年來(lái)食品蛋白質(zhì)改性中的一種很有前途的方法，可以充分利用蛋白質(zhì)的表面性能(空氣/水或油/水界面的吸附能力)與還原糖較好的持水、增稠性能，改善蛋白質(zhì)或多肽的抗氧化性、溶解性、乳化性和質(zhì)構(gòu)等方面的改性［1-2］。但是美拉德類(lèi)糖基化反應(yīng)也有很多的不足，如產(chǎn)生有毒和致畸化合物、褐變、營(yíng)養(yǎng)丟失及反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)等［3-5］。本文以金帶細(xì)鲹魚(yú)肉蛋白酶解物為原料，研究了不同溫度(100、120℃)下美拉德修飾反應(yīng)對(duì)酶解物功能特性及5-羥甲基糠醛和丙烯酰胺等潛在危害物形成的影響，以期為魚(yú)肉蛋白酶解物的修飾與安全控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金帶細(xì)鲹:購(gòu)于當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)，去除魚(yú)頭和內(nèi)臟，洗凈瀝干后用攪碎機(jī)攪成肉糜，用保鮮袋分裝(每袋100 g)后，貯存于-20℃冰箱備用;大豆色拉油，購(gòu)于當(dāng)?shù)爻?胰蛋白酶(4 000 U/g)，廣東恒凱生物試劑有限公司;胃蛋白酶(3000～3 500 NFU/mg)、胰酶(5×USP)、亞硝基鐵氰化鈉、十二烷基硫酸鈉(SDS)，生工生物工程(上海)有限公司;2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)、丙烯酰胺、5-羥甲基糠醛、甲酸、甲醇、L-亮氨酸，美國(guó)Sigma公司;葡萄糖、三氯乙酸、鐵氰化鉀、FeCl3、FeCl2、乙醇、水楊酸鈉、NaClO、H3PO4等。

UV-2800型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼科(上海)儀器有限公司;FD-1D-50型冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;2-16 P型離心機(jī)，美國(guó)Sigma公司;PHSJ-4A型pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;DF-101S型恒溫加熱磁力攪拌器，天津予華儀器有限公司;DE-100LB型高剪切分散乳化機(jī)，南通克萊爾混合設(shè)備有限公司;Waters Sep-pak C18固相萃取柱，沃特世科技(上海)有限公司;Agilent 1200型高效液相色譜儀、Agilent 1200型UV/Visible檢測(cè)器、Eclipse XDB-C18型色譜柱，均為安捷倫科技(中國(guó))有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 魚(yú)肉蛋白酶解物的制備

取魚(yú)糜按質(zhì)量比1∶3與水混合后，調(diào)節(jié)溶液pH和溫度至胰蛋白酶的最適條件(pH為7.0，溫度為50℃)，加入1%的胰蛋白酶(E/S=1∶100)酶解30 min后取樣，100℃滅酶10 min，將酶解液于10 000 r/min下離心10 min，取上清液冷凍干燥，備用。采用TNBS法［6］測(cè)得魚(yú)肉蛋白酶解物的水解度為10.8%。

1.2.2 酶解物美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的制備

將酶解物用蒸餾水配制成濃度為25 mg/mL的溶液，按酶解物與葡萄糖質(zhì)量比1∶2加入葡萄糖，再用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至9.0，取20 mL置于具塞密閉試管中，分別在100 ℃，120 ℃下反應(yīng)0、1、2、3、4、5、6 h(MRPs-100、MRPs-120 分別表示 100、120 ℃下的反應(yīng)產(chǎn)物)。反應(yīng)后，立即取出置于冰水浴中冷卻至室溫，測(cè)定pH值，然后置于-18℃冷凍備用。同時(shí)按上述試驗(yàn)條件，以不加葡萄糖的作為對(duì)照(對(duì)照-100、對(duì)照-120分別表示在100、120℃下的反應(yīng)產(chǎn)物)。

1.2.3 美拉德反應(yīng)進(jìn)程分析

A294和A420:反應(yīng)樣液用蒸餾水稀釋100倍和50倍，以蒸餾水做參比，分別在294 nm和420 nm下測(cè)定吸光度［7］。

游離氨基含量的測(cè)定:采用TNBS法［6］。

1.2.4 美拉德反應(yīng)潛在危害物的測(cè)定

5-羥甲基糠醛(HMF):根據(jù) Rufián-Henares［8］的方法，略作修改。將樣品過(guò)0.45 μm濾膜后，用高效液相色譜法測(cè)量，色譜條件:Agilent Eclipse XDB-C18型色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，柱溫 30 ℃，流動(dòng)相為90%水+10%甲醇，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，進(jìn)樣體積20 μL。使用外標(biāo)法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，質(zhì)量濃度梯度為:9.94、29.83、49.72、69.61、89.50 μg/mL。以峰面積(y)和5-羥甲基糠醛質(zhì)量濃度(x)作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為:y=0.079 5x+0.021 5，R2=0.999 7。色譜圖如圖1所示。

圖1 5-羥甲基糠醛(HMF)的標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)色譜圖Fig.1 LC-MS chromatograms for determination of 5-hydroxymethylfurfural(HMF)

丙烯酰胺(AA):根據(jù)文獻(xiàn)［9］的方法，略作修改。取1 mL樣液以1滴/s加入固相萃取柱(使用前依次用1 mL甲醇和1 mL水活化)中，收集除第1滴外的流出液，用氮?dú)獯蹈珊笤儆? mL水溶解，過(guò)0.45 μm濾膜后用高效液相色譜系統(tǒng)測(cè)定含量。色譜條件:Agilent 1200型高效液相系統(tǒng)，Agilent Eclipse XDB-C18型色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，柱溫20 ℃，流動(dòng)相為水-甲醇(體積比90∶10)，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣體積15 μL。質(zhì)譜條件:陽(yáng)離子電噴霧電離源(ESI+)，質(zhì)譜掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(Multiple Reaction Monitor，MRM)方式，毛細(xì)管電壓1.0 kV，錐孔電壓20 V;離子源溫度110℃;射頻透鏡1(RF Lens 1)的電壓為30.8 V;脫溶劑氣溫度400℃，脫溶劑氣流量600 L/h;錐孔氣流量50 L/h;碰撞室入口電壓2.0 V，出口電壓3 V;碰撞能量20 eV;碰撞腔真空度2.2×10-3Torr。監(jiān)測(cè)離子為AA母離子m/z 71.7，子離子 m/z 54.8;定量離子為 AA m/z 54.8。以峰面積(y)與丙烯酰胺的質(zhì)量濃度(x)作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為:y=0.122 5x+0.283 3，R2=0.995 2。以保留時(shí)間和各對(duì)離子的響應(yīng)強(qiáng)度的比例作為定性標(biāo)準(zhǔn)。其液質(zhì)色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 丙烯酰胺液質(zhì)色譜圖Fig.2 LC-MS chromatograms for determination of acrylamide

1.2.5 功能特性分析

溶解性:取0.2 g樣品與20 mL蒸餾水混合，用1.0 mol/L的NaOH溶液或1.0 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，在30 ℃水浴下攪拌30 min(攪拌過(guò)程中測(cè)定并保持pH)，于6 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min，采用微量凱氏定氮法消化-水楊酸比色法［10］測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)的含量，根據(jù)總蛋白的含量計(jì)算蛋白質(zhì)的溶解性，結(jié)果表示為上清液中蛋白濃度占相應(yīng)的總蛋白濃度的百分比。

乳化性及乳化穩(wěn)定性的測(cè)定:采用經(jīng)典的比濁法［11］測(cè)定乳化特性。取0.018 g樣品與1.8 mL去離子水混合，用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH溶液將pH 調(diào)為 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。加入 0.6 mL大豆色拉油，經(jīng)高速攪拌器于10 000 r/min下處理1 min，分別在攪拌后0 min和10 min時(shí)從測(cè)試管底部取樣50 μL，與5.0 mL 0.1%SDS溶液混勻，在波長(zhǎng)500 nm處測(cè)定吸光度，以0.1%SDS溶液作空白。乳化性指數(shù)(EAI，m2/g)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)(ESI，min)的計(jì)算公式［11］如下:

式中:DF，稀釋倍數(shù)，DF=100;C，樣品質(zhì)量濃度，g/mL;φ，光程，φ =1 cm;θ，乳液中油相所占比例，θ=0.25;A0，0 min 時(shí)測(cè)定的吸光度;A10，10 min 時(shí)測(cè)定的吸光度。

體外消化性:取反應(yīng)3 h的樣液20 mL，用0.02 mol/L HCl調(diào)至pH 2.0，加入1 mL胃蛋白酶液(E/S=1/250)，37℃水浴中體外模擬胃液消化處理2 h，取樣采用微量凱氏定氮法消化-水楊酸比色法［10］測(cè)定蛋白質(zhì)的含量;其余部分用1 mol/L NaOH溶液將pH調(diào)至7.0，裝入透析袋(截留分子質(zhì)量10 ku)中，再加入1 mL胰酶(E/S=1/50)，將其置于裝有100 mL 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)中進(jìn)行體外模擬腸液消化2 h，每隔0.5 h收集消化產(chǎn)物，采用微量凱氏定氮法消化-水楊酸比色法［10］測(cè)定蛋白質(zhì)的含量，按公式(3)［12］計(jì)算樣品的體外消化率DR。

式中:S為上清液中的蛋白質(zhì)含量，μg;T為樣品中的蛋白質(zhì)總量，μg。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差SD。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行一維方差分析(one-way ANOVA)，差異顯著性采用Duncan(鄧肯)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水平P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 美拉德反應(yīng)進(jìn)程分析

2.1.1 pH值的變化

由圖3可知，反應(yīng)體系MRPs-100和MRPs-120的pH值隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，且MRPs-120的pH值在前4 h急劇降低，4 h后pH值下降趨于平緩。pH值的降低主要是因?yàn)槊览路磻?yīng)過(guò)程中糖和酶解物受熱發(fā)生降解生成甲酸和乙酸等酸性物質(zhì)，以及反應(yīng)消耗了氨基酸等物質(zhì)［13］。而對(duì)照組的pH值無(wú)顯著變化(P＞0.05)。

圖3 反應(yīng)體系pH的變化Fig.3 Change of pH value in reaction system

2.1.2 A294nm和A420nm的變化

294 nm和420 nm處的吸光度值分別是美拉德反應(yīng)中間階段和高級(jí)階段的評(píng)定指標(biāo)之一，酶解物與葡萄糖的反應(yīng)體系中A294nm和A420nm隨溫度和時(shí)間的變化如圖4所示。

圖4 反應(yīng)體系A(chǔ)294(a)和A420(b)的變化Fig.4 Change of A294(a)and A420(b)in reaction system

由圖4可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加MRPs-120和MRPs-100兩體系的 A294nm和 A420nm顯著增加，且MRPs-120的吸光度增加趨勢(shì)遠(yuǎn)高于MRPs-100的吸光度增加趨勢(shì)(P＜0.05)，此結(jié)果與 Yilmaz等［14］的研究結(jié)果一致，這表明反應(yīng)溫度對(duì)體系色澤的影響較大。兩個(gè)對(duì)照組的A294nm無(wú)明顯變化，而A420nm略有升高，這可能是由于魚(yú)肉酶解物中含有少量的還原糖，加熱導(dǎo)致還原糖的焦糖化反應(yīng)或者糖與肽之間的美拉德反應(yīng)而形成有色物質(zhì)。

2.1.3 游離氨基的變化

由圖5可知，反應(yīng)最初2 h游離氨基的含量迅速下降，2 h后游離氨基的含量變化不顯著(P＞0.05)，反應(yīng)2 h時(shí)MRPs-120的游離氨基的損失速率是MRPs-100的2.88倍。在美拉德反應(yīng)的初期階段，肽類(lèi)或者蛋白質(zhì)的α-氨基和賴(lài)氨酸殘基的ε-氨基與葡萄糖的羰基發(fā)生反應(yīng)，造成這些高活性游離氨基大量減少，而其他氨基難以被利用，因而加熱處理后期游離氨基含量變化不明顯［15］。同時(shí)，美拉德反應(yīng)會(huì)降低反應(yīng)體系的pH值，pH下降反而會(huì)降低反應(yīng)底物的反應(yīng)活性［13］，因而反應(yīng)進(jìn)行到一定階段時(shí)，參與美拉德反應(yīng)的游離氨基數(shù)減少。而對(duì)照組中游離氨基的含量無(wú)顯著變化(P＞0.05)。

圖5 反應(yīng)體系中游離氨基含量的變化Fig.5 Change of content of free amino group in reaction system

2.2 功能特性分析

2.2.1 溶解性的變化

由圖6可知，魚(yú)肉酶解物經(jīng)美拉德反應(yīng)修飾后其溶解度顯著增加(P＜0.05)，而對(duì)照組樣品的溶解度變化不大，這可能是因?yàn)槊附馕锱c親水性的葡萄糖結(jié)合引入了具有親水性的羥基，改善了樣品與水分子之間的親和力，從而提高了反應(yīng)產(chǎn)物的溶解度［16］。同時(shí)，MRPs-120的溶解度顯著高于相同條件下MRPs-100的溶解度，MRPs-120的溶解度最高達(dá)到97.95%，這說(shuō)明一定程度的加熱處理有助于提高酶解物的溶解度。

圖6 美拉德反應(yīng)對(duì)酶解物溶解度的影響Fig.6 Effect of Maillard reaction on solubility of hydrolysates

2.2.2 乳化性及乳化穩(wěn)定性的變化

如圖7所示，在實(shí)驗(yàn)的pH范圍內(nèi)所有樣品具有較好的乳化活性，且MRPs的乳化活性比各對(duì)照組的乳化活性顯著提高(P＜0.05)，MRPs-120的乳化活性最高，達(dá)到361 m2/g。由于葡萄糖具有親水性，與酶解物糖基化后，使其產(chǎn)物的表面活性增大，從而提高了MRPs的乳化活性。糖基化反應(yīng)在一定程度上可提高酶解物的乳化穩(wěn)定性，而加熱處理影響樣品乳化穩(wěn)定性的變化規(guī)律不明顯，短時(shí)間的熱處理可提高酶解物的乳化穩(wěn)定性，但是長(zhǎng)時(shí)間的熱處理又不利于其乳化穩(wěn)定性，這說(shuō)明酶解物樣品形成乳化分散體系的能力方面和穩(wěn)定乳化分散體系方面不存在相關(guān)性。

圖7 美拉德反應(yīng)對(duì)酶解物的乳化性(a)及乳化穩(wěn)定性(b)的影響Fig.7 Effect of temperature and pH on emulsifying activity index(a)and emulsion stability index(b)MRPs and hydrolysates

2.2.3 體外消化性的變化

從圖8可知，在0～120 min模擬胃液消化階段，所有樣品的體外消化速度較快，對(duì)照-120的體外消化率均高于其他樣品，這可能是由于經(jīng)120℃熱處理導(dǎo)致蛋白質(zhì)或肽分子解鏈胃蛋白酶作用位點(diǎn)暴露，體外消化率隨之提高。而糖基化產(chǎn)物在模擬胃液中的消化水解程度較小，這主要是由于胃蛋白酶屬于肽鏈內(nèi)切酶，其專(zhuān)一性程度較大，主要作用于芳香族氨基酸的羧基基團(tuán)形成的肽鍵［12］，而無(wú)法降解糖基化接枝反應(yīng)形成的修飾產(chǎn)物。在120～240 min模擬腸液消化階段，酶解物及其美拉德反應(yīng)修飾產(chǎn)物在胰酶作用下的消化率逐漸增加，其中對(duì)照-120酶解物的體外消化率仍高于其他樣品，在240 min時(shí)體外消化率達(dá)到了89.29%。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在模擬腸液中的消化速率降低，也可能是由于美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抑制了消化酶的活力而降低了消化性［17］。

圖8 美拉德反應(yīng)對(duì)酶解物體外消化性的影響Fig.8 Effect of Maillard reaction on in vitro digestibility of hydrolysates

2.3 美拉德反應(yīng)潛在危害物的變化

2.3.1 5-羥甲基糠醛(HMF)的變化

5-羥甲基糠醛(HMF)是美拉德反應(yīng)的中間產(chǎn)物之一，常用于評(píng)價(jià)美拉德反應(yīng)進(jìn)行的程度，主要是在食品加熱的過(guò)程中由糖類(lèi)物質(zhì)直接脫水形成，除了溫度條件外HMF的形成還取決于食品中糖的種類(lèi)、pH值、水分活度和媒介物二價(jià)陽(yáng)離子的濃度等因素的作用［17］。由表1可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，MRPs-120中HMF含量呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，反應(yīng)6 h時(shí)HMF含量達(dá)到了32.94 μg/mL，是 MRPs-100的 82倍，而MRPs-100僅在反應(yīng)6 h時(shí)檢測(cè)到微量的HMF存在。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照-120中HMF的含量也呈現(xiàn)略微增加的趨勢(shì)，在反應(yīng)6 h時(shí)含量為0.94 μg/mL，這可能是因?yàn)槊附馕镏泻猩倭刻敲撍纬?。?duì)照-100在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中未檢測(cè)出HMF存在，這表明反應(yīng)溫度是反應(yīng)過(guò)程中形成HMF的關(guān)鍵因素，這與Ajandouz等人研究發(fā)現(xiàn)的焦糖化反應(yīng)在較高的反應(yīng)溫度或堿性pH條件下容易發(fā)生的結(jié)論一致［13］。

表1 美拉德反應(yīng)對(duì)HMF含量的影響 單位:μg/mLTable 1 Effect of Maillard reaction on HMF content

2.3.2 丙烯酰胺的變化

如表2所示，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，MRPs-100中丙烯酰胺含量隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，反應(yīng)6 h后達(dá)到10.64 μg/mL;MRPs-120中丙烯酰胺的含量呈先增加后趨緩的趨勢(shì)，這可能是由于形成的丙烯酰胺進(jìn)一步參與了反應(yīng)而降解;對(duì)照-120和對(duì)照-100中測(cè)出含有微量的丙烯酰胺，且隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)其含量逐漸積累。丙烯酰胺是一種具有神經(jīng)毒性的小分子化合物，在食品加工過(guò)程中主要由天冬酰胺通過(guò)美拉德反應(yīng)形成，對(duì)人類(lèi)健康具有潛在的危害性，因而在采用美拉德反應(yīng)修飾蛋白酶解物的過(guò)程中要盡量避免不必要的長(zhǎng)時(shí)間高溫加熱，以減少丙烯酰胺的形成。

表2 美拉德反應(yīng)對(duì)丙烯酰胺含量的影響 單位:μg/mLTable 2 Effect of Maillard reaction on acrylamide content

3 結(jié)論

(1)美拉德反應(yīng)的過(guò)程中，A294nm、A420nm急劇增加，MRPs-120的pH值和游離氨基的含量與MRPs-100相比顯著降低(P＜0.05)，而對(duì)照組無(wú)顯著變化(P ＞0.05)。

(2)功能特性研究表明，與未糖基化的酶解物相比，美拉德修飾反應(yīng)提高了其溶解度、乳化活性及乳化穩(wěn)定性，而體外消化率顯著降低。

(3)隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，MRPs中HMF和丙烯酰胺的含量逐漸增大，而對(duì)照-100中未檢出HMF的存在。

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