魚肉內(nèi)源酶對(duì)發(fā)酵魚糜凝膠特性的影響*

楊方，夏文水

(江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫，210042)

利用生物發(fā)酵技術(shù)加工及保藏魚糜制品獲得了國(guó)內(nèi)外廣泛的關(guān)注［1-4］。通過(guò)生物發(fā)酵產(chǎn)酸，大多數(shù)病原微生物的生長(zhǎng)被抑制，產(chǎn)品保質(zhì)期延長(zhǎng)［3］;通過(guò)發(fā)酵過(guò)程中內(nèi)源酶或微生物產(chǎn)酶對(duì)脂肪和蛋白質(zhì)的水解，產(chǎn)品被賦予了獨(dú)特的發(fā)酵風(fēng)味并提高了營(yíng)養(yǎng)價(jià)值［5］;通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)酸，魚肉蛋白交聯(lián)形成具有一定強(qiáng)度的有序的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使產(chǎn)品具有彈性和良好的口感［6］。

魚糜制品的凝膠特性決定了其自身質(zhì)量以及加工特性［7］?，F(xiàn)有文獻(xiàn)對(duì)加熱及冷藏冷凍過(guò)程中，內(nèi)源酶活變化對(duì)魚肉及魚糜產(chǎn)品的凝膠特性的影響有大量報(bào)道［8-10］，然而在酸性條件下，酶活變化如何影響魚糜凝膠特性尚不清楚。隨著pH下降，一些內(nèi)源蛋白酶和交聯(lián)酶的活性也發(fā)生變化，對(duì)凝膠特性產(chǎn)生重要影響。對(duì)于蛋白酶，大部分文獻(xiàn)報(bào)道認(rèn)為其破壞了蛋白的骨架結(jié)構(gòu)，從而對(duì)凝膠起到劣化作用［7，11］;但也有文獻(xiàn)認(rèn)為在蛋白酶有限的水解下，部分基團(tuán)被酶切，從而暴露出更多的疏水基團(tuán)，疏水相互作用被加強(qiáng)，反而提高了凝膠特性［12］。魚糜內(nèi)源蛋白酶在發(fā)酵過(guò)程中的酶活變化對(duì)凝膠形成具有積極作用還是消極作用，在何階段發(fā)揮主要作用因而有待研究。對(duì)于交聯(lián)酶，大多數(shù)研究集中在谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(TG酶)上，普遍認(rèn)為在低溫(4～40℃)放置一段時(shí)間，TG酶會(huì)催化ε-(γ-Glu)-Lys鍵生成，從而提高魚糜凝膠強(qiáng)度［13］。然而現(xiàn)有資料對(duì)TG酶的研究主要是在中性范圍內(nèi)［10］，發(fā)酵過(guò)程pH落入酸性范圍，在此條件下其如何作用魚糜凝膠有待研究。

本文選取1株被廣泛應(yīng)用于魚糜發(fā)酵的菌種——植物乳桿菌，以及食品中廣泛應(yīng)用的酸化劑——葡萄糖酸內(nèi)酯(GDL)，通過(guò)對(duì)發(fā)酵體系及酸性模擬體系的研究來(lái)解決上述問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 主要材料

白鰱:2～3 kg/條，鮮活，購(gòu)于超市。

菌種:植物乳桿菌，由江南大學(xué)食品學(xué)院提供。

1.1.2 主要試劑

亮抑肽酶、胃酶抑素 A、N-乙基馬來(lái)酰亞胺(NEM)，Sigma公司;葡萄糖酸內(nèi)酯(GDL)，上海綠宙食品添加劑有限公司;青霉素，中諾藥業(yè)有限公司;鏈霉素，深圳華藥南方制藥有限公司;兩性霉素B，上海金穗生物科技有限公司;TG酶(120 U/g)，泰興市東圣食品科技有限公司;其余試劑均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備

SQ2119DX西貝樂(lè)食品料理機(jī)，上海帥佳電子科技有限公司;T18高速分散機(jī)，上海易絲生物科技有限公司;隔水式培養(yǎng)箱、DK-8AXX型電熱恒溫水槽，上海一恒科學(xué)儀器有限公司;4K-15高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司;Fluoro Max4熒光光譜儀，美國(guó)Horiba JY公司;UV-1000分光光度計(jì)，上海天美科學(xué)儀器有限公司;電泳儀，北京六一儀器廠;電泳槽、ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司;pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器上海有限公司;TA-XT2i質(zhì)構(gòu)儀，英國(guó)Stable Micro Systems公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 兩個(gè)體系的建立

發(fā)酵魚糜體系:(1)蛋白酶測(cè)定組:內(nèi)源酶組配方為100 g魚糜添加2 g NaCl，2.5 g GDL及抗生素(青霉素8000 I.U.，鏈霉素20 mg，兩性霉素 B 50 mg);空白組在上述配方基礎(chǔ)上添加100 μmol亮抑肽酶和1 μmol胃酶抑素A，兩組均放在30℃下保溫48 h;(2)TG酶測(cè)定組:內(nèi)源酶組配方為100 g魚糜添加2 g NaCl，3 g葡萄糖，1 mL活化2次的菌種液(含有107～108CFU的發(fā)酵菌)，放在30℃下保溫48 h。菌種活化方法為冷凍保藏菌種在液體MRS培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)24 h。活化菌種4℃冷藏并當(dāng)天使用。空白組為內(nèi)源酶組再添加1 mmol NEM。

酸性模擬體系:肌原纖維蛋白中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的NaCl，2.5%的GDL后，與內(nèi)源蛋白酶粗酶液在40 ℃下反應(yīng)，通過(guò)在不同時(shí)間(0、10、20、30、45 min，1、2、4 h)對(duì)8組樣品添加1 mmol/L(最終濃度)亮抑肽酶和10 μmol/L胃酶抑素A終止水解進(jìn)行，4 h后取出所有樣品，4℃冷藏，隔天進(jìn)行質(zhì)構(gòu)及電泳分析。肌原纖維蛋白提取方法參照文獻(xiàn)方法［6］。內(nèi)源蛋白酶粗酶液提取方法參照Sovik［14］法。

1.2.2 pH測(cè)定

參照文獻(xiàn)方法［15］。

1.2.3 蛋白酶酶活測(cè)定方法

參照Sovik［14］法。1個(gè)蛋白酶活力單位(U)定義為在30℃下每克粗酶液中的水溶蛋白每小時(shí)水解釋放1 mg多肽。多肽含量由Lowry［16］法測(cè)定。粗酶液中水溶蛋白含量由雙縮脲法［17］測(cè)定，以牛血清蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 TG酶酶活測(cè)定方法

發(fā)酵魚糜加入質(zhì)量濃度為4倍的提取緩沖液(5 mmol/L EDTA，10 mmol/L NaCl，3 mmol/L DTT，20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5)均質(zhì)后，用冷凍離心機(jī)16 000 g離心20 min后取上清液得粗酶液。測(cè)定時(shí)，2 mL粗酶液加入2 mL反應(yīng)液(2 mg/mL N，N-二甲基化酪蛋白，30 μmol/L單丹磺酰尸胺，5 mmol/L CaCl2，3 mmol/L DTT，50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5)在37℃下反應(yīng)10 min后，在激發(fā)波長(zhǎng)(350 nm)和發(fā)射波長(zhǎng)(480 nm)下測(cè)定熒光值。

1.2.5 凝膠強(qiáng)度測(cè)定方法

將樣品修整為相同尺寸(12 mm i.d.×20 mm)，使用球形探頭(P/0.25S)做凝膠破斷實(shí)驗(yàn)。測(cè)前、中、后的速度為10 mm/s，觸發(fā)力為5 g，形變量為80%，凝膠強(qiáng)度表示為破斷力(g)×凹陷深度(mm)。

1.2.6 電泳測(cè)定方法

結(jié)合 Balage［18］法和 Laemmli［19］法并稍有改進(jìn)。即，2 g樣品加入18 mL質(zhì)量濃度為50 g/L的十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液，在100℃下煮1 h后，收集12 000 g離心20 min后的上清液，調(diào)整蛋白質(zhì)量濃度為4 mg/mL后，與上樣緩沖液混合(0.125 mol/L Tris-HCl，pH 6.8，4%SDS，20% 甘油，10% β-巰基乙醇，0.005%溴酚藍(lán))。該混合液煮沸5 min后采用4%濃縮膠，10%分離膠進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)。電泳電壓維持在100 V。染色液為0.125%考馬斯亮藍(lán)R250、25%甲醇和10%乙酸，染色3 h;脫色液為40%甲醇和10%乙酸，脫色1～2 h。

1.2.7 蛋白聚集狀態(tài)對(duì)蛋白酶水解蛋白效率的影響的分析方法

建立3組:(1)pH 4.3蛋白聚集前組。含有0.6 mol/L NaCl的肌原纖維蛋白用HCl調(diào)至4.3后，立即與內(nèi)源蛋白酶粗酶液40℃下反應(yīng);(2)pH 4.3蛋白聚集后組。含有0.6 mol/L NaCl的肌原纖維蛋白加入質(zhì)量濃度2.5%的GDL在4℃平衡4 h后與酶液40℃下反應(yīng);(3)pH 7.0組。含有0.6 mol/L NaCl的肌原纖維蛋白pH調(diào)至7.0后，立即與酶液40℃下反應(yīng)。比例為10 g蛋白加1 mL酶液。TCA可溶解性肽測(cè)定方法參照文獻(xiàn)方法［15］。實(shí)驗(yàn)(2)組0 min取出的樣品測(cè)定值已扣除4 h平衡過(guò)程中酸水解增加的肽含量值。

1.2.8 非二硫共價(jià)鍵測(cè)定方法

由于內(nèi)源TG酶較少會(huì)導(dǎo)致測(cè)定系統(tǒng)誤差偏大，所以添加質(zhì)量濃度為0.25%外源TG酶進(jìn)行測(cè)試。用上述方法提取的肌原纖維蛋白溶液分別添加0、0.25%、1%、1.5%、2.5%、3%GDL在30℃下放置24 h后，使pH分別達(dá)到6.91、6.13、5.53、4.89、4.51、4.18，測(cè)定此時(shí)非二硫共價(jià)鍵的生成比例。添加蛋白酶抑制劑和抗生素(濃度見(jiàn)上)抑制蛋白酶和微生物作用。

測(cè)定方法參照文獻(xiàn)方法［6］稍作修改如下，稱量魚糜凝膠質(zhì)量，記為w1，離心管質(zhì)量記為w0。魚糜凝膠加入質(zhì)量濃度為5倍的溶液(0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素+0.5 mol/L β-巰基乙醇)均質(zhì)后，在4℃下攪拌30 min，混合液14 000 g離心20 min后倒去上清液，真空干燥至恒重(＜0.02 g)后，稱取沉淀和離心管總質(zhì)量w2。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

圖表由OriginPro 8.6繪制，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0，顯著性差異定義為P＜0.05。

2 數(shù)據(jù)與分析

2.1 發(fā)酵階段內(nèi)源酶酶活變化

2個(gè)發(fā)酵體系的pH都從最初的7.0附近下降到4.3附近(表1)，分別是由GDL緩慢釋酸和乳酸菌產(chǎn)酸造成的［20］。研究?jī)?nèi)源蛋白酶時(shí)，因?yàn)橹参锶闂U菌也具有一定的產(chǎn)蛋白酶能力，所以利用GDL產(chǎn)酸代替乳酸菌產(chǎn)酸;研究?jī)?nèi)源TG酶時(shí)因?yàn)槿樗峋划a(chǎn)TG酶，因此采用原態(tài)發(fā)酵體系，減少系統(tǒng)誤差。

由表1可得，發(fā)酵期間內(nèi)源蛋白酶總酶活逐漸增加，且前12 h變化劇烈，與此階段迅速下降的pH相對(duì)應(yīng)。說(shuō)明pH的變化對(duì)內(nèi)源總蛋白酶活的影響顯著;在發(fā)酵階段，酸性蛋白酶為關(guān)鍵酶類，且活性較高。表1中，空白組的蛋白酶抑制劑對(duì)酸性蛋白酶的酶活抑制率達(dá)85%以上，驗(yàn)證了水解實(shí)驗(yàn)中該抑制劑組可作為水解反應(yīng)終止劑的可行性。從表1還可以看出，發(fā)酵期間內(nèi)源TG酶酶活力降低，與其是中性蛋白酶有關(guān)［7］，因而其在酸性條件下容易失活。10 mmol/kg NEM對(duì)酶活的抑制率在53% ～70%，與其他文獻(xiàn)報(bào)道類似［21］。

表1 發(fā)酵階段pH及內(nèi)源酶酶活變化Table 1 The change of pH and endogenous enzymatic activities during fermentation

2.2 不同水解程度對(duì)酸誘導(dǎo)凝膠特性的影響

肌原纖維蛋白是魚肉肌肉蛋白中的重要組成部分，其凝膠特性與魚糜的凝膠特性密切相關(guān)。因而理解內(nèi)源蛋白酶對(duì)肌原纖維蛋白的水解與其凝膠特性的聯(lián)系具有重要意義。由表2可得，該酸性模擬體系的pH變化與發(fā)酵體系的pH變化相差不大，可以用此模型理解發(fā)酵體系。

表2 酸性模擬體系pH和凝膠強(qiáng)度的變化Table 2 The change of pH and gel strength in the GDL acidified system

在水解初期(30 min以內(nèi))，水解時(shí)間增加沒(méi)有使凝膠強(qiáng)度加強(qiáng)，說(shuō)明適度的內(nèi)源蛋白酶水解不能增強(qiáng)凝膠強(qiáng)度。雖然酶切作用可能使蛋白暴露更多的疏水基團(tuán)，但是隨著pH下降，逐漸靠近肌原纖維蛋白等電點(diǎn)，蛋白正負(fù)電荷中和，斥力起主導(dǎo)作用，加之內(nèi)源蛋白酶的酶切位置沒(méi)有形成合適的距離，導(dǎo)致暴露的疏水基團(tuán)之間沒(méi)有形成疏水相互作用，從而沒(méi)能增加凝膠強(qiáng)度。隨著酸的釋放，水解時(shí)間增長(zhǎng)，凝膠強(qiáng)度下降。然而，這一改變是由于pH下降對(duì)蛋白酶的激活作用，還是肌原纖維蛋白隨pH發(fā)生構(gòu)象改變形成對(duì)蛋白酶水解有利的構(gòu)象還不清楚，將在下面實(shí)驗(yàn)進(jìn)行補(bǔ)充說(shuō)明。

由圖1可知，肌球蛋白重鏈(MHC)的降解是造成凝膠強(qiáng)度下降的主要原因。肌動(dòng)蛋白(Actin)在酸性體系水解完畢后只有輕微降解。Montero［22］等也認(rèn)為，MHC的交聯(lián)與蛋白凝膠強(qiáng)度的增加存在正相關(guān)。

2.3 內(nèi)源蛋白酶影響凝膠強(qiáng)度的機(jī)理初步探究

圖1 酸性模擬體系水解時(shí)間對(duì)肌原纖維蛋白的影響Fig.1 Effect of hydrolysis time on myofibrillar protein in the GDL acidified system

上述實(shí)驗(yàn)說(shuō)明了內(nèi)源蛋白酶對(duì)凝膠的劣化作用，然而由于體系pH的下降會(huì)同時(shí)造成酸性蛋白酶的激活和蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變，因而無(wú)法說(shuō)明哪種因素為主要因素。圖2實(shí)驗(yàn)結(jié)果解決了這一問(wèn)題。由圖可知，內(nèi)源蛋白酶對(duì)沒(méi)有進(jìn)行酸性平衡的組(pH 4.3蛋白聚集前)和進(jìn)行過(guò)酸性平衡后的組(pH 4.3蛋白聚集后)的水解效率沒(méi)有顯著差異，而pH不同組(pH 4.3蛋白聚集前和pH 7.0組)的水解效率卻有顯著差異。說(shuō)明pH改變是造成內(nèi)源蛋白酶影響發(fā)酵魚糜凝膠特性的主要因素，蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變?cè)谶@個(gè)過(guò)程中起到的作用較小。

圖2 pH和蛋白聚集對(duì)內(nèi)源酶水解的影響Fig.2 Effect of pH and aggregation of protein on hydrolysis efficiency

2.4 酸性條件下TG酶對(duì)凝膠特性的影響

比較圖3的空白組和內(nèi)源酶組發(fā)現(xiàn)，兩者的差異隨著發(fā)酵時(shí)間的進(jìn)行而減小，說(shuō)明TG酶對(duì)蛋白的交聯(lián)作用主要集中在發(fā)酵前期，在發(fā)酵后期交聯(lián)能力變?nèi)酢?/p>

圖3 TG酶在酸性條件下對(duì)凝膠強(qiáng)度的影響Fig.3 Effect of TGase on gel strength in the GDL acidified system

NaCl、尿素及β-巰基乙醇的混合試劑可以破壞離子鍵、氫鍵、疏水相互作用以及二硫共價(jià)鍵，但無(wú)法破壞非二硫共價(jià)鍵［23］。由圖4可知，在中性范圍附近(6.1～7.0)，TG酶組和空白組差異顯著，但在酸性范圍內(nèi)(4.2～5.5)，差異變小。這說(shuō)明在中性范圍內(nèi)，主要是由TG酶生成了ε-(γ-Glu)-Lys鍵，而在酸性范圍內(nèi)，是由其他因素導(dǎo)致了其他非二硫共價(jià)鍵的生成。

圖4 不同酸性條件對(duì)非二硫共價(jià)鍵生成的影響Fig.4 Effect of pH on production of non-disulphide covalent bonds

3 結(jié)論

發(fā)酵魚糜內(nèi)源蛋白酶活力在發(fā)酵階段逐漸增加，主要在后期對(duì)魚糜凝膠起劣化作用;pH對(duì)內(nèi)源蛋白酶的激活作用是造成凝膠劣化的主要因素;TG酶活力在發(fā)酵階段逐漸降低，主要在前期增強(qiáng)了魚糜凝膠強(qiáng)度;pH降低會(huì)減弱TG酶作用，但會(huì)誘導(dǎo)其他非二硫共價(jià)鍵的生成。本文闡明了發(fā)酵魚糜內(nèi)源酶酶活變化、對(duì)凝膠的作用效果、作用時(shí)期及原因，對(duì)后續(xù)開展如何控制內(nèi)源酶活，提高發(fā)酵魚糜制品的凝膠特性的工作具有一定指導(dǎo)意義。

［1］ Adams M，Cooke R，Twiddy D.Fermentation parameters involved in the production of lactic acid preserved fish-glucose substrates［J］.International Journal of Food Science ＆Technology，1987，22(2):105-114.

［2］ Riebroy S，Benjakul S，Visessanguan W.Properties and acceptability of Som-fug，a Thai fermented fish mince，inoculated with lactic acid bacteria starters［J］.LWT-Food Science and Technology，2008，41(4):569-580.

［3］ YIN L J，PAN C L，JIANG S T.Effect of lactic acid bacterial fermentation on the characteristics of minced mackerel［J］.Journal of Food Science，2002，67(2):786-792.

［4］ HU Y，XIA W，GE C.Effect of mixed starter cultures fermentation on the characteristics of silver carp sausages［J］.World Journal of Microbiology and Biotechnology，2007，23(7):1 021-1 031.

［5］ ZENG X，XUA W，JIANG Q，et al.Chemical and microbial properties of Chinese traditional low-Salt fermented whole fish product Suan yu［J］.Food Control，2013，30(2):590-595.

［6］ 許艷順.發(fā)酵鰱魚魚糜凝膠形成及其機(jī)理研究［D］.無(wú)錫:江南大學(xué)，2010.

［7］ AN H，Peters M Y，Seymour T A.Roles of endogenous enzymes in surimi gelation［J］.Trends in Food Science ＆Technology，1996，7(10):321-327.

［8］ Visessanguan W，AN H.Effects of proteolysis and mechanism of gel weakening in heat-induced gelation of fish myosin［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2000，48(4):1 024-1 032.

［9］ Hultmann L，Rustad T.Iced storage of Atlantic salmon(Salmo salar)-effects on endogenous enzymes and their impact on muscle proteins and texture［J］.Food Chemistry，2004，87(1):31-41.

［10］ Benjakul S，Chantarasuwan C，Visessanguan W.Effect of medium temperature setting on gelling characteristics of surimi from some tropical fish［J］.Food Chemistry，2003，82(4):567-574.

［11］ 劉海梅，熊善柏，謝筆鈞，等.鰱魚糜凝膠形成過(guò)程中化學(xué)作用力及蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化［J］.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2008，15(3):469-475.

［12］ Creusot N，Gruppen H.Enzyme-induced aggregation and gelation of proteins［J］.Biotechnology Advances，2007，25(6):597-601.

［13］ 孔保華，南慶賢.魚糜內(nèi)源酶及凝膠機(jī)理的研究現(xiàn)狀［J］.中國(guó)畜產(chǎn)與食品，2005，7(5):233-235.

［14］ Sovik S L，Rustad T.Proteolytc activity in byproducts from cod species caught at three different fishing grounds［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，53(2):452-458.

［15］ 戴夢(mèng)婕，許艷順，姜啟興，等.戊糖片球菌產(chǎn)蛋白酶對(duì)發(fā)酵鰱魚魚糜凝膠性能的影響［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2014，40(6):17-21.

［16］ Lowry O H，Rosebrough N J，F(xiàn)arr A L，et al.Protein measurement with the Folin phenol reagent［J］.Journal of Biochemical Chemistry，1951，193(1):265-275.

［17］ Gornall A G，Bardawill C J，David M M.Determination of serum proteins by means of the biuret reaction［J］.Journal of Biological Chemistry，1949，177(2):751-766.

［18］ Balange A，Benjakul S.Enhancement of gel strength of bigeye snapper(Priacanthus tayenus)surimi using oxidised phenolic compounds ［J］.Food Chemistry，2009，113(1):61-70.

［19］ Laemmli U K.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4［J］.Nature，1970，227(5 259):680-685.

［20］ YANG F，Rustad T，XU Y，et al.Endogenous proteolytic enzymes–A study of their impact on cod(Gadus morhua)muscle proteins and textural properties in a fermented product［J］.Food Chemistry，2015，172:551-558.

［21］ Benjakul S，Visessanguan W.Transglutaminase-mediated setting in bigeye snapper surimi［J］.Food Research International，2003，36(3):253-266.

［22］ Montero P，Gómez-Guillén C.Thermal aggregation of sardine muscle proteins during processing［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1996，44(11):3 625-3 630.

［23］ Pérez-Mateos M，Lourenco H，Montero P，et al.Rheological and biochemical characteristics of high-pressure-and heat-induced gels from blue whiting(Micromesistius poutassou)muscle proteins［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1997，45(1):44-49.