張智維, 劉 婷, 韓 飛
(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院, 陜西 西安 710021)
?
正丙醇/碳酸鈉雙水相體系提取發(fā)酵液中γ-聚谷氨酸的研究
張智維, 劉婷, 韓飛
(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院, 陜西 西安710021)
摘要:為彌補(bǔ)傳統(tǒng)提取方式成本高、連續(xù)性差等缺點(diǎn),采用正丙醇/碳酸鈉雙水相體系,從發(fā)酵液中分離提取了γ-PGA,且γ-PGA富集在鹽相.采用正交試驗(yàn)研究了正丙醇濃度、碳酸鈉濃度、溫度、pH等對(duì)γ-PGA提取率的影響.結(jié)果表明,選用正丙醇/碳酸鈉雙水相體系的最佳提取條件為:正丙醇濃度18%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、碳酸鈉濃度14%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、溫度40 ℃、pH 10.在此條件下,γ-PGA的提取率為98.07%,說(shuō)明該方法可行.
關(guān)鍵詞:雙水相體系; 提??; γ-聚谷氨酸; 正交試驗(yàn)
0引言
γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是由D型和L型谷氨酸單體通過(guò)α-氨基和γ-羧基組成的同源聚酰胺[1].γ-PGA具有水溶性、生物相容性、生物可降解性、可食用性、無(wú)毒等特點(diǎn),故在工業(yè)應(yīng)用中顯示出了很大潛力[2].例如,在食品工業(yè)中可作為增稠劑和穩(wěn)定劑,在廢水處理中可作為生物絮凝劑,在醫(yī)藥中可作為藥物載體和控釋材料,在農(nóng)業(yè)中可作為肥料,在化妝品中可作為保濕劑[3]等.
微生物發(fā)酵法是生產(chǎn)γ-PGA優(yōu)先選擇的方法[4,5].目前,提取γ-PGA的方法主要有:有機(jī)溶劑沉淀法、化學(xué)沉淀法和膜分離法[6,7]等.有機(jī)溶劑沉淀法是最常用的方法,但有機(jī)溶劑的用量太大,提取成本較高,限制了其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用[8,9];化學(xué)沉淀法的后續(xù)脫鹽步驟比較復(fù)雜[10];膜分離法容易堵塞、連續(xù)化程度低[11].
雙水相萃取具有處理量大、萃取效率高、易于連續(xù)操作、易于工藝放大[12]等特點(diǎn),可彌補(bǔ)傳統(tǒng)γ-PGA提取方式的缺點(diǎn).目前,雙水相萃取技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于提取蛋白質(zhì)[13]、氨基酸[14]、酶[15]、抗生素[16]等領(lǐng)域.
本文采用正丙醇/碳酸鈉雙水相體系提取發(fā)酵液中的γ-PGA,主要是利用γ-PGA在兩相中的選擇性分配,實(shí)現(xiàn)與發(fā)酵液中其它雜質(zhì)分離的目的.應(yīng)用了正交試驗(yàn)優(yōu)化雙水相體系提取γ-PGA的系統(tǒng)組成以及操作條件,從而確定了提取的最佳工藝.
1材料與方法
1.1材料與試劑
無(wú)水乙醇、異丙醇、磷酸氫二鉀、無(wú)水碳酸鈉、無(wú)水硫酸鈉(分析純,天津市天利化學(xué)試劑有限公司);正丙醇(分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);γ-聚谷氨酸發(fā)酵液(實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵制得,發(fā)酵液中γ-PGA的含量為10.17 g/L).
1.2儀器與設(shè)備
紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(上海美普達(dá)儀器有限公司);電子天平(福州華志科學(xué)儀器有限公司);pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司);電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司);快速混勻器(上海浦東物理光學(xué)儀器廠(chǎng)).
1.3實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1繪制相圖
配制濃度為20%(w/w)的有機(jī)溶劑溶液和12%(w/w)的無(wú)機(jī)鹽溶液.向25 mL刻度試管中加入一定量的有機(jī)溶劑溶液,再逐滴加入鹽溶液,直至溶液渾濁;然后逐滴加入水,直至溶液澄清,計(jì)算此時(shí)系統(tǒng)中有機(jī)溶劑和無(wú)機(jī)鹽的濃度;再加入鹽溶液使溶液渾濁,如此反復(fù)操作,直至溶液不出現(xiàn)渾濁或澄清.以鹽濃度為橫坐標(biāo)、有機(jī)溶劑濃度為縱坐標(biāo),繪制雙水相相圖.
圖1為不同有機(jī)溶劑/鹽雙水相體系的相圖.
(a)乙醇/磷酸氫二鉀(硫酸鈉、碳酸鈉)雙水相系統(tǒng)相圖
(b)正丙醇/磷酸氫二鉀(硫酸鈉、碳酸鈉)雙水相系統(tǒng)相圖
(c)異丙醇/磷酸氫二鉀(硫酸鈉、碳酸鈉)雙水相系統(tǒng)相圖圖1 不同有機(jī)溶劑/鹽雙水相系統(tǒng)相圖
1.3.2雙水相體系制備
根據(jù)相圖,確定用于提取γ-PGA的雙水相體系中兩相的大致范圍.在25 mL刻度試管中,按照計(jì)算量依次加入有機(jī)溶劑溶液、無(wú)機(jī)鹽溶液、發(fā)酵液等,用蒸餾水補(bǔ)足至20 g,振蕩混合,靜置分相.
1.3.3單因素實(shí)驗(yàn)
采用正丙醇/碳酸鈉雙水相體系提取γ-PGA的目的是彌補(bǔ)傳統(tǒng)提取方式的缺點(diǎn).實(shí)驗(yàn)中以提取率作為考察指標(biāo)(同時(shí)適當(dāng)考慮分配系數(shù)),考察了各因素對(duì)γ-PGA提取效果的影響,應(yīng)選擇適宜的操作條件.
(1)不同雙水相體系對(duì)γ-PGA提取率的影響
選擇20%無(wú)水乙醇、正丙醇、異丙醇等和12%磷酸氫二鉀、硫酸鈉、碳酸鈉等進(jìn)行兩兩組合,組成9組雙水相體系.靜置分相后,測(cè)定上下相中γ-PGA的濃度,并計(jì)算提取率.
(2)正丙醇濃度對(duì)γ-PGA分配行為的影響
在碳酸鈉濃度為12%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、溫度25 ℃、pH 9.5、分相時(shí)間2.5 h時(shí),正丙醇的濃度依次為15%、18%、21%、24%、27%、30%、33%等,在此條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn),測(cè)定上下相中γ-PGA的濃度,計(jì)算提取率和分配系數(shù),并選取適宜的正丙醇濃度.
(3)碳酸鈉濃度對(duì)γ-PGA分配行為的影響
在正丙醇濃度為18%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、溫度25 ℃、pH 9.5、分相時(shí)間2.5 h時(shí),碳酸鈉的濃度依次為9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%等,在此條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn),測(cè)定上下相中γ-PGA的濃度,計(jì)算提取率和分配系數(shù),并選取適宜的碳酸鈉濃度.
(4)溫度對(duì)γ-PGA分配行為的影響
在正丙醇濃度為18%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、碳酸鈉濃度為14%、pH 9.5、分相時(shí)間2.5 h時(shí),溫度依次為30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃等,在此條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn),測(cè)定上下相中γ-PGA的濃度,計(jì)算提取率和分配系數(shù),并選取適宜的溫度.
(5)pH對(duì)γ-PGA分配行為的影響
在正丙醇濃度為18%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、碳酸鈉濃度為14%、溫度40 ℃、分相時(shí)間2.5 h時(shí),pH依次為9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5等,在此條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn),測(cè)定上下相中γ-PGA的濃度,計(jì)算提取率和分配系數(shù),并選取適宜的pH值.
1.3.4正交試驗(yàn)
單因素實(shí)驗(yàn)選取實(shí)驗(yàn)因素和水平,再做正交試驗(yàn)以確定最佳組合,最終確定最佳系統(tǒng)組成和操作條件.
1.3.5分析方法
γ-聚谷氨酸的測(cè)定:CTAB濁度法[17].
1.3.6計(jì)算
(1)相比:R=Vt/Vb,其中Vt為上相體積(mL);Vb為下相體積(mL).
(2)分配系數(shù):K=Ct/Cb,其中Ct為上相中γ-PGA的濃度(g/L);Cb為下相中γ-PGA的濃度(g/L).
(3)提取率:Y= 1 / (1+RK),其中K為分配系數(shù).
2結(jié)果與討論
2.1γ-PGA的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和回歸方程
在235 nm處分別測(cè)定8μg/mL、16μg/mL、24μg/mL、32μg/mL、40μg/mL、48μg/mLγ-PGA標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度,得到回歸方程為Y= 0.017 75X+0.047 93,R2=0.997 49.
2.2不同雙水相體系對(duì)γ-PGA提取率的影響
不同雙水相體系對(duì)γ-PGA的提取率如圖2所示.從圖2可以看出,乙醇/碳酸鈉體系不分相,乙醇/硫酸鈉和乙醇/磷酸氫二鉀體系的提取率相差不大,異丙醇和三種鹽組成的體系提取率相差也不大,正丙醇/磷酸氫二鉀體系的提取率最低,正丙醇/碳酸鈉體系的提取率最高,達(dá)到96.3%.因此,選擇正丙醇/碳酸鈉體系進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn).
1.乙醇-碳酸鈉;2.乙醇-硫酸鈉;3.正丙醇-碳酸鈉;4.正丙醇-硫酸鈉;5.正丙醇-磷酸氫二鉀;6.異丙醇-碳酸鈉;7.異丙醇-硫酸鈉;8.異丙醇-磷酸氫二鉀圖2 不同雙水相系統(tǒng)對(duì)γ-PGA提取率的影響
2.3正丙醇濃度對(duì)γ-PGA分配行為的影響
正丙醇濃度對(duì)γ-PGA分配行為的影響如圖3所示.由圖3可知,總體上看提取率Y和分配系數(shù)K都隨著正丙醇濃度的增加呈現(xiàn)減小的趨勢(shì),在正丙醇濃度為18%時(shí)體系的提取率達(dá)到最大.有機(jī)溶劑/鹽雙水相體系的分相過(guò)程是有機(jī)溶劑和無(wú)機(jī)鹽爭(zhēng)奪水分子的過(guò)程,隨著正丙醇濃度的增加,上相中水的含量下降,γ-PGA更易分配于下相,因此分配系數(shù)K減小,但是由于相比一直增加,所以提取率Y呈現(xiàn)下降趨勢(shì).因此,確定正丙醇濃度為18%.
柱形圖:分配系數(shù)K;折線(xiàn)圖:提取率Y圖3 正丙醇濃度對(duì)γ-PGA分配行為的影響
2.4碳酸鈉濃度對(duì)γ-PGA分配行為的影響
碳酸鈉濃度對(duì)γ-PGA分配行為的影響如圖4所示.由圖4可知,提取率隨碳酸鈉濃度變化的總體趨勢(shì)是先增大后減小,在碳酸鈉濃度為14%時(shí),提取率最大.其原因是隨著碳酸鈉濃度的增加,水合能力增強(qiáng),下相的含水量增大,γ-PGA更易分配于下相,分配系數(shù)減小,提取率增大.因此,可確定碳酸鈉的濃度為14%.
柱形圖:分配系數(shù)K;折線(xiàn)圖:提取率Y圖4 碳酸鈉濃度對(duì)γ-PGA分配行為的影響
2.5溫度對(duì)γ-PGA分配行為的影響
溫度對(duì)γ-PGA分配行為的影響如圖5所示.由圖5可以看出,當(dāng)溫度大于40 ℃后,分配系數(shù)增加,提取率減小;在40 ℃時(shí)分配系數(shù)最小,提取率最大.這是因?yàn)闇囟仍黾邮贵w系的黏度降低有利于分相,進(jìn)而影響γ-PGA的分配.而且,溫度還影響γ-PGA的溶解度,隨著溫度的升高,γ-PGA的溶解度增大,當(dāng)溫度大于40 ℃時(shí),下相中γ-PGA已經(jīng)達(dá)到飽和,濃度基本保持不變,所以提取率和分配系數(shù)變化的幅度較小.因此,選擇溫度為40 ℃.
柱形圖:分配系數(shù)K;折線(xiàn)圖:提取率Y圖5 溫度對(duì)γ-PGA分配行為的影響
2.6pH對(duì)γ-PGA分配行為的影響
pH對(duì)γ-PGA分配行為的影響如圖8所示.由圖8可知,當(dāng)pH>10時(shí),體系的提取率顯著降低.這是因?yàn)棣?PGA是由帶負(fù)電荷的谷氨酸單體組成,溶液pH的改變將影響?hù)然慕怆x平衡,以及其與雙水相體系的靜電效應(yīng),從而影響γ-PGA的分配結(jié)果.在堿性環(huán)境下,γ-PGA帶負(fù)電,且pH越高,γ-PGA解離為負(fù)二價(jià)狀態(tài)存在的比例越高,從而使之更難分配到電位為負(fù)的下相,所以分配系數(shù)增加,萃取率減?。划?dāng)pH減小時(shí),負(fù)二價(jià)狀態(tài)存在的比例減少,體系的相間電位差減小,提取率增大.因此,選擇pH值為10.
柱形圖:分配系數(shù)K;折線(xiàn)圖:提取率Y圖6 pH對(duì)γ-PGA分配行為的影響
2.7正交試驗(yàn)
根據(jù)以上單因素實(shí)驗(yàn),確定正丙醇濃度、碳酸鈉濃度、溫度和pH四個(gè)因素,并分別選取相應(yīng)的水平值進(jìn)行正交試驗(yàn),且以提取率作為主要的研究對(duì)象.正交試驗(yàn)的因素水平表如表1所示.
表1 因素水平表
表2為正交試驗(yàn)結(jié)果極差分析表.其實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,pH的極差最大,對(duì)γ-PGA提取率的影響最大,溫度對(duì)γ-PGA提取率的影響顯著性高于碳酸鈉的影響,正丙醇濃度的影響最小.故各因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)影響的主次順序依次為DCBA.因?yàn)檎嫉臉O差最小,故以正丙醇濃度為誤差,做方差分析,其結(jié)果如表3所示.
表3為正交試驗(yàn)方差分析表.由表3可知,在給定的置信度α= 0.05時(shí),F(xiàn)α(2,2)=19.只有pH的F比大于F臨界值,表明只有pH對(duì)提取率有顯著影響.影響γ-PGA提取率的正交試驗(yàn)各因素的最優(yōu)組合為A2B3C2D2.
表2 正交試驗(yàn)結(jié)果極差分析表
表3 正交試驗(yàn)方差分析表
通過(guò)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行直觀(guān)分析可知,影響γ-PGA提取率的正交試驗(yàn)各因素水平的最佳組合為A2B3C2D2,即正丙醇濃度18%、碳酸鈉濃度14%、溫度40 ℃、pH10.表4為驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果.由表4可知,在最佳提取條件下,γ-PGA的提取率為98.07%,高于正交試驗(yàn)中所得的最優(yōu)結(jié)果97.95%(見(jiàn)表2所示).因此,確定雙水相體系的組成為:正丙醇濃度18%、碳酸鈉濃度14%、溫度40 ℃、pH10.
表4 驗(yàn)證性試驗(yàn)
3結(jié)論
本文實(shí)現(xiàn)了直接從發(fā)酵液中提取γ-PGA,菌體富集在上相,γ-PGA聚集在下相.通過(guò)正交試驗(yàn)得到了最佳提取條件為:雙水相系統(tǒng)組成為正丙醇濃度18%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、碳酸鈉14%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、溫度40 ℃、pH10,其γ-PGA的提取率達(dá)98.07%.這一結(jié)果比正交試驗(yàn)中的最大值提高了1.22%,為γ-PGA的分離純化提供了一種新方法.
參考文獻(xiàn)
[1]BaiqiHuang,PeiyongQin,ZhiweiXu,etal.EffectofCaCl2on viscosity of culture broth,and on activities of enzymes around the 2-oxoglutarate branch,in Bacillus subtilisCGMCC2108producing[J].BioresourceTechnology,2011,102(3):3 595-3 598.
[2]FanZhu,JinCai,XiangtingWu,etal.Themainbyproductsandmetabolicfluxprofilingofγ-PGA-producingstrainB.subtilisZJU-7underdifferentpHvalues[J].JournalofBiotechnology,2013,164(1):67-74.
[3]HuiliZhang,JianzhongZhu,XiangchengZhu,etal.High-levelexogenousglutamicacid-independentproductionofpoly-(γ-glutamicacid)withorganicadditioninanewisolatedBacillus subtilisC10[J].BioresourceTechnology,2012,116:241-246.
[4]曹名鋒,金映虹,解慧.γ-聚谷氨酸的微生物合成、相關(guān)基因及應(yīng)用展望[J].微生物學(xué)通報(bào), 2011,38(3):388-395.
[5]劉青芝.微生物發(fā)酵法生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的研究[D].濟(jì)南:山東大學(xué),2010.
[6]王雷.雙水相系統(tǒng)提取γ-聚谷氨酸的研究[D].天津:天津商業(yè)大學(xué),2009.
[7]鞠蕾,馬霞.γ-聚谷氨酸的提取方法改進(jìn)[J].現(xiàn)代化工,2011,31(s1):267-270.
[8]曾慶東,李文杰,王志偉,等.甲醇-乙醇分步沉淀法提取γ-聚谷氨酸[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2014,40(5):222-228.
[9]李文婧.γ-聚谷氨酸發(fā)酵及提取工藝研究[D].濟(jì)南:山東輕工業(yè)學(xué)院,2010.
[10]石冬霞.γ-聚谷氨酸的微生物合成、分離純化及性質(zhì)與應(yīng)用研究[D].哈爾濱:哈爾濱商業(yè)大學(xué),2010.
[11]趙蘭坤,徐恒山,樓良旺.發(fā)酵產(chǎn)γ-聚谷氨酸的提取工藝研究現(xiàn)狀[J].發(fā)酵科技通訊,2014,43(2):27-28.
[12]郭晶晶.雙水相萃取技術(shù)進(jìn)展[J].廣州化工,2014,42(19):26-28.
[13]劉楊,王雪青,龐廣昌,等.雙水相萃取法富集分離螺旋藻藻藍(lán)蛋白的研究[J].海洋科學(xué),2008,32(7):30-37.
[14]李青云,袁鳳梅,吳金英.聚乙二醇/硫酸鈉雙水相萃取懶氨酸[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2014,40(4):221-226.
[15]黎志德,蟻細(xì)苗,黃思鴻,等.聚乙二醇-硫酸銨雙水相體系萃取α-葡聚糖酶[J].甘蔗糖業(yè),2013(1):38-42.
[16]柴麗.二元小分子醇/鹽雙水相體系中抗生素的分離富集行為[D].西安:長(zhǎng)安大學(xué),2013.
[17]張慶慶,金鑫強(qiáng),陳劍翔,等.發(fā)酵液中γ-聚谷氨酸含量快速測(cè)定方法研究[J].食品工業(yè)科技,2012(19):294-296.
Study on n-propanol/sodium carbonate aqueous two-phase
system to extract polyγ-glutamic acid from fermentation broth
ZHANG Zhi-wei, LIU Ting, HAN Fei
(College of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)
Abstract:The work attempted to study and optimize the aqueous two-phase systems (n-propanol/sodium carbonate) to extract γ-PGA from fermentation broth,in which γ-PGA was enriched in salt phase,the effect of several parameters such as concentration of phase forming components (n-propanol and sodium carbonate),temperature and pH on the extraction rate and partition coefficient of γ-PGA were studied.Orthogonal experiment design was applied to determine the optimum technical conditions for extraction.The results showed that the optimum extraction condition of n-propanol/sodium carbonate aqueous two-phase system were 18%(w/w) n-propanol and 14%(w/w) sodium carbonate at 40 ℃ and pH=10.Under the optimal condition,the extraction rate was 98.07%.In conclusion, the method has good reliability.
Key words:aqueous two-phase system; extraction; poly γ-glutamic acid; orthogonal experiment design
中圖分類(lèi)號(hào):TQ922+.1
文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A
文章編號(hào):1000-5811(2015)05-0130-05
作者簡(jiǎn)介:張智維(1967-),女,陜西西安人,高級(jí)工程師,研究方向:食品微生物發(fā)酵
基金項(xiàng)目:陜西省科技廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2009JM2005); 陜西省教育廳專(zhuān)項(xiàng)科研計(jì)劃項(xiàng)目(09KJ373)
收稿日期:*2015-05-19