超聲波協(xié)同高壓熱水浸提法提取金針菇多糖的研究

王廣慧， 張騰霄， 于德涵

（黑龍江省綏化學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，黑龍江綏化 152061）

金針菇[Flammulina velutiper（Fr.)Sing]，學(xué)名毛柄金錢菌。研究表明，金針菇多糖是一種非特異免疫刺激劑，具有降血糖、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、護(hù)肝、抗衰老等作用，既可開發(fā)為功能性食品，也可作為動(dòng)物飼料添加劑使用 （張圣杰等，2014；黃瓊等，2014；張麗霞和趙麗娟，2014）。傳統(tǒng)的金針菇多糖提取方法有：熱水浸提法、酸浸提法、堿浸提法等。大量試驗(yàn)表明，熱水浸提法提取時(shí)間長(zhǎng)、雜質(zhì)多且只能提取胞外多糖；稀酸浸提法易引起糖苷鍵斷裂；稀堿浸提法提取的多糖中雜質(zhì)多，還易導(dǎo)致多糖降解。本研究嘗試使用超聲波協(xié)同高壓熱水浸提技術(shù)提取金針菇多糖，并通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)金針菇多糖的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，以期為開發(fā)利用金針菇資源開辟一條新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 金針菇，購(gòu)于綏化市大潤(rùn)發(fā)超市；無水乙醇、苯酚、3，5-二硝基水楊酸（DNS）、濃硫酸、三氯乙酸等，均為國(guó)產(chǎn)分析純；高速萬能粉碎機(jī)（FW100型，天津市泰斯特儀器有限公司）、超聲波細(xì)胞粉碎儀（JY92-ⅡDN型，寧波新芝生物科技有限公司）、立式壓力蒸汽滅菌器（BL-50A型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）、電熱恒溫水浴鍋（DK-98-ⅡA型，天津市泰斯特儀器有限公司）、紫外可見分光光度計(jì)（752型，上海菁華科技儀器有限公司）。

1.2 測(cè)定方法及試驗(yàn)參數(shù)的確定 以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-硫酸法測(cè)定總糖含量，3，5-二硝基水楊酸（DNS）法測(cè)定還原糖含量（北京大學(xué)生物系生物化學(xué)教研室，1980）。

多糖提取率/%=多糖量/金針菇子實(shí)體干重×100；

多糖量=總糖量-還原糖量。

1.3 超聲波協(xié)同高壓熱水浸提法提取金針菇多糖的操作方法 金針菇經(jīng)除雜、50℃烘箱干燥以及高速萬能粉碎機(jī)粉碎（80目）等預(yù)處理后，得到金針菇子實(shí)體干粉。準(zhǔn)確稱取金針菇粉若干份，每份1.0 g，放入燒杯中，按一定比例加入蒸餾水，先進(jìn)行超聲波處理，再進(jìn)行高壓熱水浸提。提取后離心，取上清液，用70～80℃水浴濃縮至原體積的1/2，然后按1∶3的體積比加入15%三氯乙酸溶液后靜置12 h，離心，將上清液適當(dāng)濃縮后按1∶3的體積比加入95%乙醇，4℃下醇沉過夜，離心，將沉淀用無水乙醇洗2～3次后用蒸餾水溶解并定容，適當(dāng)稀釋后即可測(cè)總糖含量和還原糖含量。

1.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 料液比對(duì)金針菇多糖提取率的影響 取5份金針菇粉，分別按照料液比（g/mL）為 1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70 加入蒸餾水，然后在功率 300 W下超聲波處理6 min，再在108℃下高壓熱水浸提80 min。后面的處理方法如1.3所述。

1.4.2 超聲波功率對(duì)金針菇多糖提取率的影響取5份金針菇粉，均按最佳料液比加蒸餾水，分別在 200、250、300、350、400W 功率下超聲波處理6 min。再在108℃下高壓熱水浸提80 min。以后的處理方法如1.3所述。

1.4.3 超聲時(shí)間對(duì)金針菇多糖提取率的影響 取5份金針菇粉，在最佳料液比、最適超聲波功率的條件下分別超聲波處理 2、4、6、8、10 min， 再在108℃下高壓熱水浸提80 min。以后的處理方法如1.3所述。

1.4.4 高壓熱水浸提溫度對(duì)金針菇多糖提取率的影響 取5份金針菇粉，在最佳料液比、最適超聲波功率、最佳超聲時(shí)間的條件下，分別在75、90、108、115、121℃進(jìn)行高壓熱水浸提80 min。后面的處理方法如1.3所述。

1.4.5 高壓熱水浸提時(shí)間對(duì)金針菇多糖提取率的影響 取5份金針菇粉，在最佳料液比、最適超聲波功率、最佳超聲時(shí)間及最佳高壓熱水浸提溫度的條件下，分別設(shè)置高壓熱水浸提時(shí)間為40、60、80、100、120 min。 后面的處理方法如 1.3所述。

1.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選擇對(duì)金針菇多糖提取率影響較大的因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，以確定金針菇多糖提取工藝的最佳條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)定方法及試驗(yàn)參數(shù)的確定

2.1.1 苯酚-硫酸法測(cè)總糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線 根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果得到苯酚-硫酸法測(cè)定總糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為：y=0.0071x-0.0049，R2=0.9902。

2.1.2 3，5-二硝基水楊酸（DNS）法測(cè)還原糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線 根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果得到DNS法測(cè)定還原糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為：y=0.001x+0.0658，R2=0.9981。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 料液比對(duì)金針菇多糖提取率的影響 試驗(yàn)設(shè)置了 5 個(gè)不同的料液比，分別為 1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70，獲得的提取率分別為 12.18%、13.24%、15.61%、14.73%、13.36%。由此結(jié)果可知，提取金針菇多糖的最佳料液比為1∶50。

2.2.2 超聲波功率對(duì)金針菇多糖提取率的影響試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)不同的超聲波功率，分別為200、250、300、350、400 W，得到的提取率分別是14.72%、14.25%、15.61%、15.32%、14.17%。由此結(jié)果可知，提取金針菇多糖的最佳超聲波功率為300 W。

2.2.3 超聲時(shí)間對(duì)金針菇多糖提取率的影響 試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)不同的超聲時(shí)間，分別為2、4、6、8、10 min，提取率分別為13.54%、14.33%、15.61%、14.45%、13.83%。由此結(jié)果可知，超聲時(shí)間為6 min時(shí)，多糖提取率最高。

2.2.4 高壓熱水浸提溫度對(duì)金針菇多糖提取率的影響 試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)不同的高壓熱水浸提溫度，分別是 75、90、108、115、121 ℃， 得到的提取率分別為 13.74%，14.91%、15.61%、15.24%、14.57%。由此結(jié)果可知，高壓熱水浸提溫度為108℃時(shí)，多糖提取率最高。

2.2.5 高壓熱水浸提時(shí)間對(duì)金針菇多糖提取率的影響 試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)不同的高壓熱水浸提時(shí)間，分別是 40、60、80、100、120 min。 得到的提取率分別為 12.61%，14.83%、15.61%、14.48%，13.76%。由此結(jié)果可知，高壓熱水浸提時(shí)間為80 min時(shí)，多糖提取率最高。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選擇對(duì)金針菇多糖提取率影響較大的因素進(jìn)行L16（45)正交試驗(yàn)。試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，各因素對(duì)提取率的影響大小順序?yàn)?A（料液比）＞C（超聲時(shí)間）＞E（高壓熱水浸提時(shí)間）>B（超聲波功率）＞D（高壓熱水浸提溫度）。由此確定提取金針菇多糖的最優(yōu)條件為A2C2E2B3D2，即：料液比為 1∶50（g/mL），超聲時(shí)間為6 min，高壓熱水浸提時(shí)間為80 min，超聲波功率為300 W，高壓熱水浸提溫度為108℃。在此條件下金針菇多糖提取率為15.64%。

3 討論與結(jié)論

超聲波提取是依靠超聲波產(chǎn)生的 “空化作用”對(duì)細(xì)胞膜的破壞所形成的強(qiáng)大沖擊波或高速射流對(duì)有效成分與水相之間阻滯層進(jìn)行消除的一種提取技術(shù)，另外超聲波的次級(jí)效應(yīng)，如機(jī)械振動(dòng)、乳化、擴(kuò)散、擊碎、化學(xué)效應(yīng)等也能加速欲提取成分的擴(kuò)散釋放并充分與溶劑混合，有利于提取。在高壓條件下，被提取物的組織細(xì)胞及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生了解體，從而使細(xì)胞內(nèi)成分能夠與溶媒充分接觸而更易被釋放。超聲波協(xié)同高壓熱水浸提法綜合了兩種提取技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，使多糖更容易從細(xì)胞中釋出，因此獲得了較高的提取率。本研究通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)超聲波協(xié)同高壓熱水浸提法提取金針菇多糖的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。

試驗(yàn)結(jié)果表明，超聲波協(xié)同高壓熱水浸提法提取金針菇多糖可獲得較高的提取率。此法提取多糖的最適條件是：料液比為 1∶50（g/mL），超聲波功率為300 W，超聲時(shí)間為6 min，高壓熱水浸提溫度為108℃，高壓熱水浸提時(shí)間為80 min。在此條件下，金針菇多糖提取率為15.64%。

[1]北京大學(xué)生物系生物化學(xué)教研室.生物化學(xué)試驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：人民教育出版社，1980.22～24.

[2]黃瓊，黃曉梅，張平，等.金針菇多糖的抗氧化活性[J].食品研究與開發(fā)，2014，35（4)：66 ～ 69.

[3]張麗霞，趙麗娟.金針菇多糖的抗氧化活性研究 [J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，27（1)：240 ～ 243.

[4]張圣杰，陳相艷，李文香，等.超聲聯(lián)合超微粉碎法提取金針菇多糖新探究[J].食品工業(yè)，2014，35（4)：83 ～ 86.