GC-MS法分析比較兩種處理方式所得酵母細(xì)胞自溶成分

趙 巍， 孫 喆， 鄭艷秋， 趙小麗， 甄玉國(guó)，2*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)吉農(nóng)博瑞奶牛飼料研發(fā)中心，吉林長(zhǎng)春 130118；2.長(zhǎng)春博瑞飼料集團(tuán)有限公司技術(shù)中心，吉林長(zhǎng)春 130114）

酵母細(xì)胞自溶物是指酵母細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)經(jīng)過(guò)物理或化學(xué)手段使細(xì)胞內(nèi)部釋放的物質(zhì)，其成分復(fù)雜，包括糖類(lèi)、蛋白質(zhì)、氨基酸、有機(jī)酸、無(wú)機(jī)鹽、酶類(lèi)、核酸、B族維生素等（李祥等，2001）。

酵母細(xì)胞自溶物具有降血壓、降血脂、促進(jìn)傷口愈合、促進(jìn)動(dòng)物和微生物生長(zhǎng)等多種生理活性作用。研究這些化學(xué)成分，對(duì)于進(jìn)一步闡明酵母細(xì)胞代謝過(guò)程和調(diào)控機(jī)制有重要的意義。本試驗(yàn)利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）分析酵母細(xì)胞自溶物的乙酸乙酯萃取物，比較不同促溶劑所得酵母細(xì)胞自溶物所含揮發(fā)性成分的差別，初步探討酵母細(xì)胞自溶物的主要化學(xué)成分，以為酵母細(xì)胞代謝的基礎(chǔ)研究積累數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及藥品來(lái)源 發(fā)酵罐，上海百侖生物有限公司；氣相色譜質(zhì)譜儀，安捷倫公司；水浴鍋，無(wú)錫市蘇德試驗(yàn)設(shè)備有限公司；pH計(jì)，上海科曉科學(xué)儀器有限公司；氯化鈉，北京北化有限公司；木瓜蛋白酶，武漢萬(wàn)榮科技發(fā)展有限公司。

1.2 樣品采集與處理 取高密度發(fā)酵所得酵母發(fā)酵液 （菌體密度為干重46.12 g/L），5000 r/min離心后得到的菌體用蒸餾水洗滌3次后，所得菌體按照以下條件進(jìn)行自溶。

以NaCl為促溶劑的自溶條件：添加與酵母菌體濕重同等重量的蒸餾水，添加酵母細(xì)胞干重9%的NaCl，調(diào)節(jié)pH為5.0，控制溫度40℃ 12 h，50 ℃ 24 h，60℃ 12 h。

以木瓜蛋白酶為促溶劑的自溶條件：添加與酵母菌體濕重同等重量的蒸餾水，添加酵母細(xì)胞干重1%的木瓜蛋白酶，調(diào)節(jié)pH為6.0，控制溫度55℃ 48 h。

自溶結(jié)束后置于85℃水浴保持15 min滅酶活，5000 r/min離心10 min，上清液即為酵母細(xì)胞自溶液。

取10 mL酵母細(xì)胞自溶液，置于分液漏斗中，加入2倍量乙酸乙酯，充分振搖，靜置，待分層后吸取上清液，重復(fù)兩次，將乙酸乙酯層揮干后用1 mL丙酮定容，密封，4℃儲(chǔ)存，測(cè)定時(shí)10000 r/min離心5 min，取上清液直接注入氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀器進(jìn)行分析。

1.3 儀器與測(cè)定條件 儀器：氣相色譜GC7890/質(zhì)譜MS5970聯(lián)用儀（美國(guó)安捷倫公司）。

氣相條件：色譜柱為HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細(xì)管柱，柱溫70℃（保留5 min），以4℃/min升溫至100℃，保持5 min；以10℃/min升溫至150℃，保持10min；以5℃/min升溫至240℃，保持8 min；以10℃/min升溫至270℃，保持5 min；載氣為高純He（99.999%）；柱前壓 7.62 psi，載氣流量 1.0 mL/min；進(jìn)樣量 1 μL；分流比 10∶1，溶劑延遲時(shí)間 3 min。

質(zhì)譜條件：離子源為EI源；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；電子能量70 eV；接口溫度280℃；質(zhì)量范圍20～800 amu。譜圖檢索：Nist11譜庫(kù)（Thompson 等，1997）。

2 結(jié)果與分析

對(duì)不同促溶劑所得酵母細(xì)胞自溶物乙酸乙酯萃取物進(jìn)行GC-MS分析。通過(guò)MSD化學(xué)工作站，Nist11質(zhì)譜圖庫(kù)進(jìn)行鑒定。按峰面積歸一化法進(jìn)行計(jì)算求得各化學(xué)成分在樣品中的相對(duì)含量。由表1可知，以NaCl為促溶劑的酵母細(xì)胞自溶物乙酸乙酯萃取物共分離出49種化合物，鑒定了其中28種化學(xué)成分，相對(duì)總量為92.14%，總離子流圖見(jiàn)圖1。以木瓜蛋白酶為促溶劑的酵母細(xì)胞自溶物乙酸乙酯萃取物共分離出49種化合物，鑒定了其中27種化學(xué)成分，相對(duì)總量為91.006%，見(jiàn)表1，總離子流圖見(jiàn)圖2。

圖1 以NaCl為促溶劑的酵母細(xì)胞自溶物乙酸乙酯萃取物總離子流圖

圖2 以木瓜蛋白酶為促溶劑的酵母細(xì)胞自溶物乙酸乙酯萃取物總離子流圖

3 討論與結(jié)論

酵母細(xì)胞自溶物的成分極其復(fù)雜，本試驗(yàn)通過(guò)萃取的方式去除酵母細(xì)胞自溶物中大分子物質(zhì)（蛋白質(zhì)、多肽、多糖等），保留中極性小分子物質(zhì)。通過(guò)GC-MS分析添加不同促溶劑 （NaCl和木瓜蛋白酶）所得酵母細(xì)胞自溶物的乙酸乙酯萃取物中的揮發(fā)性成分。添加NaCl所得自溶物的乙酸乙酯萃取物共分離出49種成分，鑒定出28種，占總量的 92.14%，其中酯類(lèi)3種，酸類(lèi)5種，醇類(lèi)4種，雜環(huán)類(lèi)6種（吡咯、呋喃、吡咯并吡嗪、嘧啶、吡唑等），酚類(lèi)2種、飽和芳香烴3種、飽和脂肪烴5種；添加木瓜蛋白酶所得自溶物的乙酸乙酯萃取物中共分離出49種成分，鑒定出27種，占總量的91.006%，其中酯類(lèi)2種，酸類(lèi)4種，醇類(lèi)4種，雜環(huán)類(lèi)7種（吡咯、呋喃、吡咯并吡嗪、嘧啶、噻唑、吡喃等），酚類(lèi)5種，飽和芳香烴2種，不飽和芳香烴2種，以及腈類(lèi)1種。

表1 不同促溶劑所得乙酸乙酯萃取物GC-MS成分分析

不同處理方式所得酵母細(xì)胞自溶物乙酸乙酯萃取物共有21種成分，二者含量大于1%的共有化合物有：異辛酯鄰苯二甲酸、二異辛酯鄰苯二酸、4-羥基-4-甲基-2-戊酮、3-甲基-丁酸、甘油、2，4-二芐基-5，8-二甲氧基-6-甲基-1-萘酚、2，4-雙（1，1-二甲基乙基）-苯酚、苯乙醇、棕櫚酸、4-羥基-苯乙醇、甲基丙二酸二乙酯等11種。

以NaCl為促溶劑的酵母細(xì)胞自溶物乙酸乙酯萃取物較木瓜蛋白酶為促溶劑的酵母細(xì)胞自溶物乙酸乙酯萃取物多出：十八烷、二十烷、二十四烷、二十六烷等飽和烴，1，3-二甲基苯和甲基丙二酸二乙酯6種物質(zhì)。以木瓜蛋白酶為促溶劑的酵母細(xì)胞自溶物乙酸乙酯萃取物較以NaCl為促溶劑的酵母細(xì)胞自溶物乙酸乙酯萃取物多出：苯甲酸、4-甲基-5-噻唑、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、3-（4-羥基苯基）丙腈、3-（2-乙氧基）-苯酚、3，4，5-三甲氧基-苯酚等 6種物質(zhì)。

將兩個(gè)總離子流圖中Y軸均置于2000000，可粗略比較兩種酵母細(xì)胞自溶物乙酸乙酯萃取物的成分含量。兩組中以NaCl為促溶劑組含量較高的有：4-羥基-苯乙醇、1-甲基-3-丙基-1H-吡唑-5-羧酸 （4-（甲硫基） 苯甲酸）、2-（苯基乙炔基）-吡啶、3-（2-乙氧基）-苯酚、吡咯并[1，2-a]吡嗪-1，4-二酮、六氫-3-（2-甲基丙基）等；以木瓜蛋白酶為促溶劑組含量較高的有：2，4-雙 （1，1-二甲基乙基）-苯酚、棕櫚酸、十八烷酸等。

以木瓜蛋白酶為促溶劑所得酵母細(xì)胞自溶物香味較濃且為肉香味，以NaCl為促溶劑所得酵母細(xì)胞自溶物組香味較淡，氣味清香。這可能是由于兩者具有的揮發(fā)性物質(zhì)種類(lèi)及含量有所差異造成的（Peter，2000）。

目前多以GC-MS研究酵母發(fā)酵酒精飲品（白酒、啤酒、紅酒）等的香味成分以改善酒類(lèi)產(chǎn)品的口味，研究酵母抽提物的揮發(fā)性成分以生產(chǎn)不同味道的酵母味素（沈國(guó)惠等，1991）。產(chǎn)酒精發(fā)酵結(jié)束后，酵母菌培養(yǎng)基中揮發(fā)性代謝物多為短鏈脂肪酸醇酯等，包括乙酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸異戊酯、癸酸乙酯等及醇類(lèi)中的苯乙醇等香味物質(zhì)（陶興無(wú)，2004）。酵母抽提物多采用SPME-GCMS進(jìn)行香味成分分析。本研究利用乙酸乙酯萃取酵母細(xì)胞自溶物與文獻(xiàn)報(bào)道SPME-GCMS所得成分差異較大（李祥等，2001），與其相比含有較多大分子物質(zhì)以及芳香烴等。由于生產(chǎn)工藝、原料來(lái)源、產(chǎn)品批次的不同會(huì)得到不同的結(jié)果，但此結(jié)果也可能是由于萃取方法不同所導(dǎo)致。

[1]李祥，彭莉，王毅，等.酵母抽提物輻照揮發(fā)性成分分析[J].中國(guó)釀造，2001，115（5）：17 ～ 19.

[2]沈國(guó)惠，劉楊氓，施翔，等.啤酒酵母自溶條件的優(yōu)化及其抽提物的揮發(fā)性風(fēng)味成份[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，1991，3：8 ～ 17.

[3]陶興無(wú).酵母抽提物香氣活性化合物的分離與鑒定 [J].中國(guó)釀造，2004，141（12）：13 ～ 16.

[4]Peter.酵母萃取物中揮發(fā)性含硫香味成分的研究[J].農(nóng)業(yè)知識(shí)，2000，16：51～62.

[5]Thompson J，Robbins E，Baker L.The Nonhomogeneity of Soybean-“Gamma-Sitosterol”[J].Sterols，1997，62（5），505 ～ 512.