蟲草多糖對哮喘模型大鼠血清白細(xì)胞介素-17和IgE水平動態(tài)變化的影響

蟲草多糖對哮喘模型大鼠血清白細(xì)胞介素-17和IgE水平動態(tài)變化的影響

吳海弟劉禮榮陳永倖

(海南省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，海南海口570311)

摘要〔〕目的研究蟲草多糖對哮喘模型大鼠血清白細(xì)胞介素(IL)-17和IgE水平動態(tài)變化的影響。方法選取SPF級雄性SD大鼠80只，隨機分為兩組，其中實驗組60只，給予50 μg卵清蛋白(OVA)+150 μl氫氧化鋁干粉+50 μl生理鹽水腹腔注射，建立支氣管哮喘大鼠模型，正常對照組20只，予等量生理鹽水灌胃；造模成功過后，將實驗組隨機分為模型組30只和蟲草組30只。蟲草組大鼠予150 mg/kg蟲草多糖每日一次灌胃，連續(xù)14 d；模型組大鼠給予等量的生理鹽水每日一次灌胃，連續(xù)14 d。實驗結(jié)束后，對比實驗前后各組大鼠血清IL-17和IgE水平、支氣管肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞比例、嗜酸性粒細(xì)胞比例及總細(xì)胞數(shù)。結(jié)果①實驗組大鼠的血清IL-17含量明顯高于正常對照組(P<0.05)；治療后，蟲草組大鼠血清IL-17含量與模型組(13.01±1.65)比較明顯較低(P<0.05)；②實驗組大鼠血清IgE含量明顯高于正常對照組(P<0.05)；治療后，蟲草組大鼠血清IgE含量與模型組比較明顯較低(P<0.05)。③實驗組大鼠肺泡灌洗液細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞比例以及嗜酸性粒細(xì)胞比例均明顯高于正常對照組(P<0.05)；治療后，蟲草組大鼠肺泡灌洗液細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞比例以及嗜酸性粒細(xì)胞比例明顯低于模型組(P<0.05)。④大鼠血清IL-17與IgE水平存在明顯的正相關(guān)關(guān)系(r=0.963，P<0.01)。結(jié)論蟲草多糖能夠明顯降低哮喘模型大鼠血清IL-17和IgE水平，減輕炎癥反應(yīng)。

關(guān)鍵詞〔〕蟲草多糖；哮喘；白細(xì)胞介素-17；IgE

中圖分類號〔〕R562.2+5〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

第一作者：吳海弟(1980-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事呼吸系統(tǒng)疾病基礎(chǔ)與臨床研究。

支氣管哮喘是由中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T嗜酸性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞參與而引起的一種氣道慢性炎癥性疾病〔1〕。本病臨床表現(xiàn)為氣道高反應(yīng)而引起的氣喘、胸悶、咳嗽、呼吸困難等癥狀，嚴(yán)重者可出現(xiàn)低氧血癥，甚至危及生命〔2〕。中醫(yī)屬“哮病”的范疇。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，本病人們更加重視疾病防治及預(yù)后，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)多采取擴張支氣管、激素類藥物抗炎等對癥療法〔3〕，但只能暫時控制病情發(fā)展，而且激素類藥物存在免疫力下降、體態(tài)改變、骨質(zhì)疏松等副作用，治療效果并不理想，亟需尋找治療哮喘的新思路。研究發(fā)現(xiàn)，哮喘屬于變態(tài)反應(yīng)性疾病，發(fā)生過程中有大量的免疫細(xì)胞參與，與機體免疫功能的改變密切相關(guān)〔4〕，蟲草多糖能夠止咳、化痰、改善呼吸系統(tǒng)，能夠提高人體免疫力〔5〕，但關(guān)于其治療哮喘的實驗研究較少，為了增強療效，緩解痛苦，改善哮喘患者預(yù)后。本文觀察蟲草多糖對急性哮喘模型大鼠血清白細(xì)胞介素(IL)-17和IgE水平。

1對象與方法

1.1實驗動物與分組選取成年的SPF級雄性SD大鼠80只(由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗室提供)，體重(280±20)g。將大鼠隨機分為2組，實驗組60只，正常對照組20只。給予安靜、溫暖、光照適合、通風(fēng)良好的飼養(yǎng)環(huán)境，保持室內(nèi)溫度20℃左右，濕度設(shè)定在40%～60%，投喂標(biāo)準(zhǔn)飼料，讓其自由進(jìn)食，調(diào)節(jié)光照，晝夜節(jié)律正常。

1.2主要試劑和儀器卵清蛋白(OVA，北京索萊寶科技有限公司)；氫氧化鋁干粉(沈陽化工廠)；蟲草多糖(含量90%，由云南省微生物所提供)；大鼠IL-17抗體試劑盒和大鼠IgE抗體試劑盒(上海凱博生化試劑有限公司)；PBS漂洗緩沖液(BOSTER公司)；離心機(美國貝克曼庫爾特公司)；DW-86W100超低溫冰箱(青島海爾)；SpectraMax M5酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices)；光學(xué)顯微鏡(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。

1.3造模方法兩組大鼠均正常適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d，之后于第0天、第7天、第14天，分別給予實驗組大鼠腹腔注射致敏劑(50 μg OVA+150 μl氫氧化鋁干粉+50 μl生理鹽水，制成混懸液)，正常對照組給予等量生理鹽水腹腔注射；第7天，給予實驗組大鼠皮下注射10 g/L OVA溶液，以增強過敏反應(yīng)，正常對照組給予等量生理鹽水腹腔注射；第14天開始每日一次霧化吸入OVA溶液(10 g/L)，每次持續(xù)30 min，連續(xù)4 d；正常對照組予霧化吸入等量生理鹽水。實驗組大鼠出現(xiàn)呼吸急促、噴嚏、不安、口唇發(fā)紺、毛發(fā)干枯等表現(xiàn)即為造模成功，實驗組大鼠全部造模成功。

1.4實驗方法及標(biāo)本采集造模成功后，將模型組大鼠隨機分為模型組30只和蟲草組30只。蟲草組大鼠予150 mg/kg蟲草多糖每日一次灌胃，連續(xù)14 d；模型組大鼠給予等量的生理鹽水每日一次灌胃，連續(xù)14 d；各組小鼠均正常飼養(yǎng)。造模前后及治療后，分別從各組大鼠的眼眶抽取靜脈血3 ml，利用離心機3 000 r/min離心，取上清液，分成兩部分，分別置于4℃和-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。靜脈血采集完成后，處死大鼠，迅速阻斷左側(cè)支氣管，采用PBS液對右側(cè)支氣管進(jìn)行灌洗，反復(fù)3次，抽吸收集灌洗液備用。

1.5觀察指標(biāo)及檢測方法

1.5.1酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清IL-17、IgE含量取出-80℃保存的血清測定IL-17含量，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒的說明書操作，將血清和試劑在室溫下放置30 min→將50 μl樣本、標(biāo)準(zhǔn)品滴加到酶標(biāo)板上→90 min后，孔內(nèi)滴加大鼠IL-17抗體工作液0.1 ml→置入37℃保溫箱中1 h→采用PBS進(jìn)行洗滌，反復(fù)3次后→滴加酶標(biāo)工作液(0.1 ml/孔)→置入37℃保溫箱中1 h→ 200 μlPBS液洗滌，反復(fù)5次→滴加50 μl顯色液TMB→培育30 min，至標(biāo)準(zhǔn)品藍(lán)染→滴加TMB終止液0.1 ml，可見藍(lán)色變?yōu)辄S色→利用450 nm酶標(biāo)儀測定光密度(OD)值→計算樣品IL-17含量。取出4℃保存的血清按照以上步驟測定血清IgE含量。

1.5.2肺泡灌洗液中總細(xì)胞數(shù)目、中性粒細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞比例測定取出收集的肺泡灌洗液，利用離心機3 000 r/min離心5 min，棄上清，沉渣中加入PBS液制成懸濁液，涂于載玻片上，95%乙醇固定后進(jìn)行HE染色，于光鏡下觀察總細(xì)胞數(shù)目，并計算中性粒細(xì)胞比例以及嗜酸性粒細(xì)胞比例。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS19.0進(jìn)行t檢驗及χ2檢驗；相關(guān)性采用線性相關(guān)分析。

2結(jié)果

2.1治療前后各組大鼠血清IL-17水平比較實驗組大鼠的血清IL-17含量明顯高于正常對照組(P<0.05)；治療后，蟲草組大鼠的血清IL-17含量，與模型組(13.01±1.65)比較明顯較低(P<0.05)，見表1。

表1　治療前后各組大鼠血清IL-17、IgE水平及肺泡灌洗液細(xì)胞數(shù)比較( ± s)

與正常對照組比較:1)P<0.05；與模型組治療后比較:2)P<0.05

2.2治療前后各組大鼠血清IgE水平比較實驗組大鼠血清IgE含量明顯高于正常對照組(P<0.05)；治療后，蟲草組大鼠血清IgE含量與模型組比較明顯較低(P<0.05)，見表1。

2.3各組大鼠肺泡灌洗液細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞比例及嗜酸性粒細(xì)胞比例比較實驗組大鼠肺泡灌洗液細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞比例及嗜酸性粒細(xì)胞比例均明顯高于正常對照組(P<0.05)；治療后，蟲草組大鼠肺泡灌洗液細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞比例以及嗜酸性粒細(xì)胞比例明顯低于模型組(P<0.05)，見表1。

2.4哮喘大鼠血清IL-17與IgE水平的相關(guān)性哮喘大鼠血清IL-17與IgE水平呈正相關(guān)(r=0.963，P<0.01)，見圖1。

圖1　哮喘血清IL-17與IgE水平相關(guān)性

3討論

支氣管哮喘與遺傳、過敏源、環(huán)境污染等多種因素有關(guān)〔6〕，是由多種炎性細(xì)胞及細(xì)胞因子參與的氣道高反應(yīng)性疾病。近年來，隨著環(huán)境及生活方式的改變，支氣管哮喘的發(fā)病率不斷增加，以其發(fā)病急、臨床表現(xiàn)重、易反復(fù)等特點〔7〕，嚴(yán)重影響人們的生命健康和生活質(zhì)量，而目前的激素類藥物對癥治療副作用較大，臨床效果并不理想。有研究發(fā)現(xiàn)〔8〕，哮喘模型大鼠體內(nèi)存在Th1/Th2細(xì)胞的失衡，Th17細(xì)胞增多，同時各種相關(guān)細(xì)胞因子含量也升高，免疫功能異常，為支氣管哮喘的治療提供了新思路。蟲草多糖提取自古老的中藥冬蟲夏草，中醫(yī)認(rèn)為，冬蟲夏草性溫，味甘，具有補虛損、益精氣、止咳化痰之功〔9〕，現(xiàn)代臨床研究亦證實，蟲草多糖在治療呼吸系統(tǒng)疾病、提高免疫力方面具有良好的臨床療效〔10〕。

本研究顯示，哮喘大鼠血清IL-17、IgE含量明顯高于正常大鼠；治療后，蟲草組大鼠的血清IL-17、IgE含量與模型大鼠比較明顯較低。IL-17是一種多功能的細(xì)胞因子〔11〕，能夠促進(jìn)中性粒細(xì)胞發(fā)育，放大氣道的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)哮喘發(fā)作；IgE可以促使嗜酸性粒細(xì)胞增多〔12〕，加重哮喘發(fā)作。IL-17和IgE起到相輔相成的作用，這與本研究結(jié)果相同。本研究結(jié)果提示蟲草多糖可以通過降低IL-17、IgE水平，從而降低哮喘反應(yīng)程度，蟲草多糖能夠使中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的含量降低，減輕炎癥反應(yīng)，這可能與其降低IL-17、IgE水平有關(guān)。

總之，蟲草多糖能夠明顯降低哮喘模型大鼠血清IL-17和IgE水平，減輕炎癥反應(yīng)，對臨床具有指導(dǎo)意義，值得臨床推廣。

4參考文獻(xiàn)

1中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會哮喘學(xué)組.支氣管哮喘防治指南(支氣管哮喘的定義、診斷、治療和管理方案)〔J〕.中華結(jié)核和呼吸雜志,2008;31(3):177-85.

2曹蘭芳.支氣管哮喘的臨床表現(xiàn)、診斷及鑒別診斷〔J〕.實用兒科臨床雜志,2008;23(4):243-6.

3趙啟華,賈云義,潘貽珍,等.支氣管哮喘患兒吸入糖皮質(zhì)激素治療前后細(xì)胞因子及免疫功能變化〔J〕.實用兒科臨床雜志,2003;18(10):784-5.

4陳慧中,朱春梅.支氣管哮喘的免疫學(xué)發(fā)病機制〔J〕.實用兒科臨床雜志,2004;19(12):1015-7.

5羅兆永.中醫(yī)治療支氣管哮喘的療效觀察——附307例療效分析〔C〕.全國第六屆中西醫(yī)結(jié)合呼吸病學(xué)術(shù)研討會論文匯編,2002:69-71.

6Wang L,Du YC,Xu JY.Evaluation of quality of life in patients with bronchial asthma and influence factors analysis of 〔J〕.Int J Biotechnol,2011;31 (15):1165-8.

7薛培麗,曾鳳英,聶丹丹,等.支氣管哮喘患者吸入激素治療依從性分析〔J〕.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2007;34(15):2970-1.

8 韓詩淼,崔雁輝.支氣管哮喘患者外周血單核細(xì)胞因子Th1/Th2失衡的檢測〔J〕.中國基層醫(yī)藥,2007;14(3):439-40.

9陳曉燕.冬蟲夏草的藥理與臨床研究進(jìn)展〔J〕.中醫(yī)藥導(dǎo)報,2009;15(2):91-3.

10廖東江,盧心鵬,趙瑾,等.人工冬蟲夏草在大鼠慢性阻塞性肺疾病中的治療作用和機制研究〔J〕.國際呼吸雜志,2012;32(13):969-973,封3.

11Xu M,Wu KS.IL-17 family and chronic inflammatory disease of airway 〔J〕.Int J Immunol,2013;36 (1):45-8.

12吳紅梅,于瑩,張莉,等.支氣管哮喘患兒血清總IgE、TNF-α檢測及其臨床意義〔J〕.中國實驗診斷學(xué),2010;14(8):1244-6.

〔2013-12-21修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)