TRIB3基因rs2295490多態(tài)性與2型糖尿病合并冠心病的相關(guān)性

·基礎(chǔ)研究·

TRIB3基因 rs2295490多態(tài)性與2型糖尿病合并冠心病的相關(guān)性

張繼旺唐治貴袁永強(qiáng)

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶402160)

摘要〔〕目的探討TRIB3基因 rs2295490多態(tài)性與2型糖尿病(T2DM)和T2DM合并冠心病(CHD)的關(guān)系。方法用基因測(cè)序方法對(duì)126例健康對(duì)照組、101例T2DM組、94例T2DM合并CHD組TRIB3基因 rs2295490多態(tài)性進(jìn)行分型，同時(shí)對(duì)其生化指標(biāo)如空腹血糖(FPG)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、糖化血紅蛋白(HbA1c)等進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果3組間TRIB3基因rs2295490多態(tài)性基因型和等位基因分布頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。健康對(duì)照組中AA基因型TG水平明顯低于AG+GG基因型(P<0.05)；T2DM組中AA基因型TC與TG水平明顯低于AG+GG基因型(P<0.05)；T2DM+CHD組AA基因型TC、TG、LDL-C水平明顯低于AG+GG基因型(P<0.05)，AA基因型HDL-C水平明顯高于AG+GG基因型(P<0.05)。結(jié)論TRIB3基因rs2295490多態(tài)性與T2DM合并CHD無(wú)明顯關(guān)聯(lián)，但可能與T2DM及T2DM并發(fā)CHD患者的血脂異常有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕TRIB3;基因多態(tài)性;2型糖尿病;冠心病

中圖分類號(hào)〔〕R587.1；R541.4〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)基金資助(2011AA02A111);重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院院內(nèi)課題(YJYB201404)

通訊作者：袁永強(qiáng)(1963-)，男，副主任技師，主要從事生化檢驗(yàn)研究。

第一作者：張繼旺(1987-)，男，在讀碩士，主要從事糖尿病病因及機(jī)制研究。

Correlation between polymorphism of TRIB3 gene rs2295490 and type 2 diabetes mellitus combined with coronary heart disease

ZHANG Ji-Wang,TANG Zhi-Gui,YUAN Yong-Qiang.

Clinical Laboratory,Yongchuan Hospital Affiliated to Chongqing Medical University,Chongqing 402160,China

Abstract【】ObjectiveTo explore the correlation between the polymorphism of TRIB3 gene rs2295490 and type 2 diabetes mellitus(T2DM),T2DM combined with coronary heart disease(CHD).MethodsGenotypes of TRIB3 gene rs2295490 polymorphisms and the distribution frequency of allele in 126 healthy individuals，101 patients with T2DM and 94 patients with T2DM combined CHD were detected by PCR and Sequenee-based testing.Fasting plasma glucose (FPG),total cholesterol(TC),triglyceride(TG),high density lipoprotein cholesterol(HDL-C),low density lipoprotein cholesterol(LDL-C) and hemoglobin A1c(HbA1c) were measured.ResultsThere was no significant difference of genotype and allele frequencies of rs2295490 among the T2DM patients,T2DM patients combined with CHD and healthy controls(P>0.05).In healthy control group，the level of TG of the AG/GG genotype was higher than that of AA genotype.In T2DM group,the levels of TC and TG of AG/GG genotype were higher than those of AA genotype.In T2DM combined CHD group,the levels of TC,TG and LDL-C of the AG/GG genotype were higher than those of AA genotype,the level of HDL-C of AG/GG genotype was lower than that of AA genotype.ConclusionsTRIB3 gene rs2295490 polymorphism has no correlation with T2DM and T2DM combined with CHD in Chongqing area，but it might be correlated with dyslipidemia in T2DM and T2DM combined CHD patients.

【Key words】TRIB3 gene;Polymorphism;Type 2 diabetes mellitus;Coronary heart disease

TRIB3基因位于人類20號(hào)染色體p13〔1〕，與2型糖尿病(T2DM)相關(guān)〔2〕。2005年，Prudente等〔3〕在意大利高加索人群中鑒定到TRIB3的一個(gè)功能性多態(tài)性位點(diǎn)rs2295490，研究發(fā)現(xiàn)，TRIB3多態(tài)性與胰島素抵抗具有明顯的相關(guān)性，還與心血管異常具有相關(guān)性。國(guó)外學(xué)者〔4〕發(fā)現(xiàn)，TRIB3基因rs2295490多態(tài)性可能通過(guò)阻礙胰島素信號(hào)傳導(dǎo)和NO產(chǎn)物的生成來(lái)引起冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。國(guó)內(nèi)學(xué)者〔5〕也通過(guò)細(xì)胞和動(dòng)物研究證實(shí)了TRIB3主要抑制Akt、p38MAPK/AP-1通路參與氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡，從而引起體內(nèi)大血管的動(dòng)脈粥樣硬化。然而，有關(guān)重慶地區(qū)TRIB3基因rs2295490多態(tài)性與T2DM及并發(fā)冠心病(CHD)相關(guān)性方面的研究仍未見(jiàn)報(bào)道，本研究通過(guò)基因測(cè)序技術(shù)初步了解重慶地區(qū)TRIB3基因rs2295490多態(tài)性的基因型及頻率的分布，并探討其與T2DM及T2DM并發(fā)CHD的相關(guān)性。

1對(duì)象與方法

1.1對(duì)象收集2013年10月至2014年6月于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院做體檢的表觀健康人126例，男41例，女85例，年齡(46.22±12.86)歲。體質(zhì)指數(shù)〔BMI,(22.60±3.10)kg/m2〕排除患T2DM及CHD等代謝性疾病的病例。

選取同時(shí)期于內(nèi)分泌科住院的T2DM病人101例，男50例，女51例，年齡(56.38±12.77)歲，BMI(26.69±3.91)kg/m2。參照1999年WHO規(guī)定的T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)〔6〕，即空腹血糖(FPG)≥126 mg/dl(7.0 mmol/L)，或者OGTT 2 h血糖≥200 mg/dl(11.1 mmol/L)，無(wú)CHD病史，心電圖無(wú)ST的改變。

收集同時(shí)期于本院內(nèi)分泌科及心內(nèi)科住院的T2DM并發(fā)CHD的病人94例，男42例，女52例，年齡(69.90±7.66)歲，BMI(25.10±3.56)kg/m2。CHD診斷標(biāo)準(zhǔn)：具有明確的心肌梗死病史，或者行冠狀動(dòng)脈造影檢查顯示冠脈狹窄≥50%。

上述患者及健康體檢人員(健康對(duì)照組)均來(lái)自重慶地區(qū)漢族人群，無(wú)血緣關(guān)系。入選者均無(wú)嚴(yán)重肝、腎、肺功能不全，貧血、惡性腫瘤、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病。身高、體重由專業(yè)人員測(cè)量并計(jì)算BMI，病史等臨床資料摘自患者病歷。所有研究對(duì)象均經(jīng)知情同意。

1.2方法

我國(guó)油頁(yè)巖資源儲(chǔ)量豐富。油頁(yè)巖干餾后可得到類似于天然石油的頁(yè)巖油，被公認(rèn)為現(xiàn)階段較為理想的石油替代能源。而油頁(yè)巖資源不論品位，也不論采用何種干餾技術(shù)，最終的煉油產(chǎn)品主要有頁(yè)巖油、干餾瓦斯尾氣、干餾污水、油泥及干餾后的頁(yè)巖廢渣等5種。

1.2.1標(biāo)本收集所有研究對(duì)象均空腹12～14 h后采集靜脈血5 ml 2管，其中一管用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，2 ml用于糖化血紅蛋白(HbA1c)測(cè)定，剩余血用于提取全基因組DNA，進(jìn)行基因多態(tài)性分型；另一管不抗凝，分離血清用于生化檢測(cè)。

1.2.2生化指標(biāo)的檢測(cè)低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)檢測(cè)試劑盒購(gòu)于四川邁克生物技術(shù)股份有限公司。FPG用葡萄糖氧化酶法測(cè)定；TG和TC用酶法測(cè)定。高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、FPG、LDL-C測(cè)定用日本第一化學(xué)株式會(huì)社試劑盒，方法為均相測(cè)定法。HbA1c檢測(cè)方法為高效液相離子交換色譜法。均嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行，用高低2個(gè)水平質(zhì)控品進(jìn)行質(zhì)量控制，所有生化項(xiàng)目均取得衛(wèi)生部和重慶市室間質(zhì)量評(píng)價(jià)合格。

1.2.3基因多態(tài)性的檢測(cè)用血液基因組柱式小量提取試劑盒提取全基因組DNA，然后用PCR及基因測(cè)序?qū)RIB3基因rs2295490多態(tài)性進(jìn)行分型。①引物序列:正義：5'-GGCCACCAAGCAGTCTCAC-3'，反義：5'-CGCCCATGATCCCTAAGTTC-3',擴(kuò)增產(chǎn)物為594 bp。②PCR反應(yīng)體系共50 μl，其中2×Es Taq MasterMix 25 μl、正義反義引物各2 μl，模板DNA 1 μg，最后RNase-Free Water加至50 μl。③PCR循環(huán)條件:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，65℃退火30 s ，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)后，72℃終末延伸10 min，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)來(lái)驗(yàn)證。④PCR產(chǎn)物送上海英濰捷基有限公司測(cè)序?qū)蜻M(jìn)行分型。

血液基因組柱式小量提取試劑盒、PCR試劑均購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，引物合成及PCR產(chǎn)物測(cè)序均由上海英濰捷基有限公司完成。

2結(jié)果

2.1TRIB3基因rs2295490多態(tài)性測(cè)序結(jié)果分析TRIB3基因rs2295490多態(tài)性不同基因型測(cè)序圖，見(jiàn)圖1～圖3。

2.2TRIB3基因rs2295490位點(diǎn)基因型及等位基因分布頻率不同組人群TRIB3基因rs2295490位點(diǎn)多態(tài)性分布情況均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，所觀察的基因型頻數(shù)與預(yù)期的基因型頻數(shù)相符合，具有群體代表性。AA、AG、GG 3種基因型頻率在健康對(duì)照組和T2DM組、T2DM+CHD組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),A、G等位基因頻率在三組間亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

圖1　rs2295490位點(diǎn)AA基因型測(cè)序圖

圖2　rs2295490位點(diǎn)AG基因型測(cè)序圖

圖3　rs2295490位點(diǎn)GG基因型測(cè)序圖

組別n基因型頻率AAAGGG等位基因頻率AG健康對(duì)照組12672(57.1)50(39.7)4(3.2)194(77.0)58(23.0)T2DM組10167(66.3)31(30.7)3(3.0)165(81.7)37(18.3)T2DM+CHD組9455(58.5)35(37.2)4(4.3)145(77.1)43(22.9)

表2　各組內(nèi)不同基因型生化指標(biāo)的比較( ± s)

與同組內(nèi)AA型比較：1)P<0.05；與對(duì)照組比較：2)P<0.05；與T2DM組比較：3)P<0.05

3討論

TRIB3是一種具有腳手架功能的調(diào)控蛋白，生物學(xué)作用廣泛。它可以和絲/蘇氨酸蛋白激酶B(PKB/Akt)結(jié)合，從而抑制胰島素對(duì)Akt的激活，進(jìn)而阻礙GSK-3β等Akt底物蛋白的磷酸化，影響糖原合成及Glu代謝。TRIB3在胰島素PI-3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中也起著重要的作用〔7～9〕；TRIB3還作用于C/EBPβ、PPARγ等因子，影響脂肪細(xì)胞分化、血脂代謝等代謝過(guò)程〔10,11〕。有學(xué)者證實(shí)，TRIB3基因rs2295490位點(diǎn)多態(tài)性與代謝綜合征存在相關(guān)性，并且可能通過(guò)肥胖、高甘油三酯血癥、胰島素抵抗來(lái)引起動(dòng)脈粥樣硬化〔12〕。Formoso等〔13〕在高加索及亞洲人中分別證實(shí)TRIB3 rs2295490多態(tài)性與頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度(IMT)存在相關(guān)性，并認(rèn)為這種多態(tài)性與血管反應(yīng)性、內(nèi)皮中膜厚度、斑塊形成有關(guān)。TRIB3通過(guò)泛素連接酶組成型光形態(tài)建成蛋白1(COP1)促進(jìn)乙酰輔酶A羧化酶(ACC)的泛素化和降解，增加脂質(zhì)的氧化分解，減少脂質(zhì)的合成〔14〕。Takahashi 等〔10〕發(fā)現(xiàn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子PPARγ與過(guò)表達(dá)的TRIB3相互作用，抑制PPARγ的活性及其靶基因的表達(dá)，導(dǎo)致脂肪細(xì)胞分化延遲或受阻。

本研究結(jié)果提示，T2DM和T2DM并發(fā)CHD的病人常常伴發(fā)肥胖和血糖、血脂的異常，這符合T2DM和T2DM并發(fā)CHD病人的臨床特征。

本研究還顯示，TRIB3基因rs2295490位點(diǎn)的3種基因型AA、AG、GG頻率及A、G等位基因頻率在健康對(duì)照組、T2DM組、T2DM+CHD組間無(wú)顯著差異，表明該位點(diǎn)多態(tài)性可能與重慶地區(qū)漢族人群T2DM及CHD的發(fā)生無(wú)關(guān)，這與國(guó)內(nèi)其他學(xué)者的研究結(jié)果相似〔15〕。我們通過(guò)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)證實(shí)，基因型頻率達(dá)到遺傳平衡，具有群體代表性。

在健康對(duì)照組中，AA基因型的FPG水平低于AG+GG基因型中Glu水平，但是差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與Shi等〔16〕的報(bào)道相一致。Prudente等〔3〕在645例非糖尿病人群中發(fā)現(xiàn)，AA基因型血糖水平低于AG+GG基因型中血糖水平，與本研究結(jié)果也一致。AA基因型的TG水平明顯低于AG+GG基因型中TG的水平，這與國(guó)內(nèi)其他學(xué)者〔15〕的研究結(jié)果一致。

T2DM組AA基因型中的TC、TG和LDL-C水平低于AG+GG基因型且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。T2DM+CHD組中AA基因型TC、TG和LDL-C水平低于AG+GG基因型，而AA基因型的HDL-C水平高于其在AG+GG基因型中的水平，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與Gong等〔12〕在代謝綜合征中的研究結(jié)果相一致。結(jié)果出現(xiàn)差異的原因尚不清楚，可能與疾病種類、疾病多基因與環(huán)境因素共同作用的復(fù)雜性、入選對(duì)象的年齡、性別和抽樣誤差等有關(guān)。從我們的數(shù)據(jù)可以推斷G等位基因可能和T2DM及T2DM并發(fā)CHD患者的血脂異常有關(guān)。

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〔2014-12-07修回〕

(編輯李相軍)