L-谷氨酰胺產(chǎn)生菌的分離及其發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

徐海燕，曹 斌，辛國芹，汪祥燕，汪孟娟，董佩佩，谷 巍

（山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東泰安 271000）

L-谷氨酰胺（Gln）是 L-谷氨酸 γ-羧基酰胺化的一種氨基酸，是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本氨基酸之一，在生物體代謝中起著非常重要的作用（劉春暉和張偉國，2009）。生產(chǎn)L-Gln的方法主要包括化學(xué)合成法、酶轉(zhuǎn)化法和直接發(fā)酵法，目前Gln的生產(chǎn)均采用發(fā)酵法。李爽等 （1998）以黃色短桿菌SGr和DONr抗性菌株作為生產(chǎn)菌株，采用16 L發(fā)酵罐發(fā)酵44 h，L-Gln的合成量達(dá)到55.2 g/L。張克旭等（1992）以天津短桿菌TG-866-174為出發(fā)菌株，經(jīng)亞硝基胍和硫酸二乙酯誘變得到菌株GW-77，可代謝累積L-Gln 31.4 g/L，最高可產(chǎn)33.2 g/L。 Yamada 等（1979）對產(chǎn)黃菌（Flavobacterium rigense）FERM-P no.3556進(jìn)行紫外誘變，得到了一株具有青霉素抗性的突變菌株FERM-P no.3628，可產(chǎn) L-Gln 25 g/L。汪世華等（2002）對谷氨酸棒桿菌S9114進(jìn)行紫外線及硫酸二乙酯（DES）誘變處理，定向選育出1株生產(chǎn)菌SH44，其L-Gln產(chǎn)量可代謝累積達(dá)到41.4 g/L左右。本試驗(yàn)旨在利用紙層析法定向篩選L-Gln產(chǎn)生菌，并通過紫外線和化學(xué)誘變劑對菌株進(jìn)行誘變選育，使其合成L-Gln的能力進(jìn)一步提升，同時(shí)采用正交試驗(yàn)對其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 果蔬攤土、活禽攤土、樹林土等。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 分離培養(yǎng)基 葡萄糖2%、牛肉膏0.5%、酵母膏0.5%、蛋白胨1%、氯化鈉0.5%、制霉素50 U/mL，瓊脂1.5%，pH 7.0，30℃培養(yǎng) 24 h。

1.2.2 活化斜面培養(yǎng)基 葡萄糖0.1%、牛肉膏1%、蛋白胨1%、氯化鈉0.5%、瓊脂粉1.5%，pH 7.0，30℃培養(yǎng) 24 h。

1.2.3 斜面保存培養(yǎng)基 蛋白胨1%、牛肉膏1%、氯化鈉0.5%，瓊脂 1.5%，pH 7.0。

1.2.4 種子培養(yǎng)基 葡萄糖4%、尿素0.5%、磷酸氫二鉀0.2%、硫酸鎂0.05%、玉米漿2.2%，pH 7.0，30℃培養(yǎng) 12 h。

1.2.5 發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖12%、磷酸二氫鉀0.25%、硫酸鎂 0.05%、硫酸錳 4 mg/L、硫酸鋅2.5 mg/L、玉米漿 1%、硫酸銨7%，pH 7.0。

1.2.6 完全培養(yǎng)基 葡萄糖0.5%、牛肉膏1%、蛋白胨1%、酵母膏0.5%、氯化鈉0.5%、瓊脂粉1.5%，pH 7.0。

1.2.7 篩選培養(yǎng)基

1.2.7.1 磺胺胍（SG）藥物培養(yǎng)基 在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加適量的SG（400～800 mg/L）。

1.2.7.2 高濃度硫酸銨培養(yǎng)基 在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加適量的硫酸銨（60～100 g/L）。

配制發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，硫酸銨配成400 g/L的溶液，用NaOH溶液調(diào)pH 7.0，與發(fā)酵液分開滅菌，接種前與發(fā)酵液混合。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種的分離篩選 取果蔬攤土、活禽攤土等土樣5.0 g，置于盛有50 mL滅菌生理鹽水的250 mL三角瓶內(nèi)，進(jìn)行梯度稀釋，選取合適稀釋度的樣品液涂布于分離培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)48 h，挑選生長良好、菌落較大的單菌落，接種于斜面培養(yǎng)基上，冰箱4℃保藏。

初篩菌種的初步鑒定：將初篩到的菌種進(jìn)行革蘭氏染色，革蘭氏陽性菌保存，革蘭氏陰性菌棄用。

紙層析法復(fù)篩菌種：將初篩得到的革蘭氏陽性菌菌株搖瓶振蕩培養(yǎng)24 h，利用紙層析法鑒定發(fā)酵液中是否含有L-Gln，定性復(fù)篩產(chǎn)L-Gln的菌株。

1.3.2 菌種生長曲線的測定 將菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，每2 h取樣一次測定發(fā)酵液的OD562（以空白培養(yǎng)基作對照），繪制生長曲線。

1.3.3 菌株的培養(yǎng)方法

1.3.3.1 液體種子培養(yǎng) 將斜面菌種接種到裝有10 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，30℃、170 r/min搖床振蕩培養(yǎng)8 h。

1.3.3.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 500 mL三角瓶中裝入發(fā)酵培養(yǎng)基50 mL，接入一環(huán)菌體或液體種子1 mL，30℃、170 r/min搖床振蕩培養(yǎng)60 h。

1.3.4 菌株的誘變

1.3.4.1 紫外誘變 把待誘變菌株培養(yǎng)至對數(shù)生長期，5000 r/min離心5 min，去上清液，把菌體用無菌水再次離心洗滌，將菌體加入到含有玻璃珠的15 mL無菌生理鹽水中振蕩20 min，然后用無菌生理鹽水稀釋至108個(gè)/mL，將2 mL稀釋的菌液加至無菌平皿中，放入無菌磁力攪拌子，再將平皿放在操作臺(tái)紫外燈下照射20、40、60 s，照射后吸取菌體進(jìn)行逐級稀釋，并涂平板進(jìn)行培養(yǎng)，挑取長得快、菌落大的進(jìn)行斜面保存。

1.3.5 分析方法

1.3.5.1 L-Gln含量的測定 采用紙層析法。（1）展開：采用新華3號濾紙，每個(gè)樣品點(diǎn)樣1 μL，在室溫下用不飽和法展開，展開劑用（苯酚∶水=4∶1）上行法展開；（2）定量：配制1%的Gln標(biāo)準(zhǔn)品，點(diǎn)樣1 μL；菌株發(fā)酵液經(jīng)離心后，取其上清液點(diǎn)樣1 μL，放入層析缸中展開；（3）顯色：展開完畢后用電吹風(fēng)吹干濾紙，噴上0.5%的茚三酮無水乙醇溶液，60℃顯色30 min；（4）比色測定：剪下Gln斑點(diǎn)，用5 mL硫酸銅乙醇溶液（0.1%硫酸銅溶液∶75%乙醇=2∶38）浸泡 30 min，然后在 510 nm 處測定A值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的A值和樣品的A值即可計(jì)算出樣品的L-Gln的含量。

1.3.5.2 pH的測定 采用PHS-3C型精密pH測定。

1.3.6 菌株的鑒定

1.3.6.1 16S rDNA的擴(kuò)增與序列分析 目的菌株接種于新鮮的種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，采用天根公司的試劑盒提取菌體DNA，并對其進(jìn)行16S rDNA序列擴(kuò)增。所用引物為通用引物：1492r 5'-ggttaccttgttacgactt-3'27f 5'-agagttgatcctggctcag-3'；PCR 反應(yīng)體系（50 μL）為：Mixture 25 μL（含Taq DNA聚合酶及dNTP等，天根生化科技有限公司），上下游引物各 1 μL，模板 DNA 2 μL，超純水21 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，52℃退火 1 min，72℃延伸 2 min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物送北京博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定。

1.3.6.2 系統(tǒng)發(fā)育分析 登錄 GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）對菌株16SrDNA測序結(jié)果利用Blast進(jìn)行檢索，并下載相關(guān)屬種的16S rDNA 序列， 采用 DNAMAN、DNAclub、MEGA3.1等軟件進(jìn)行同源性分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的分離篩選

2.1.1 菌種的初篩 從泰安周邊的樹林土、果蔬攤土、活禽攤土等樣品中進(jìn)行菌株的分離、篩選。經(jīng)過1～2 d的培養(yǎng)，平板上出現(xiàn)明顯的菌落，經(jīng)過反復(fù)分離純化，共分離出細(xì)菌菌株56株；菌株菌落多為白色、黃色、淺黃色，還有部分為褐色、黃褐色，菌落多數(shù)為圓形，表面光滑；菌體多為粗短不一的桿狀、球狀。將其中革蘭氏染色為陽性的菌株保存?zhèn)溆茫脖４?2株。

土木工程的項(xiàng)目施工過程有很強(qiáng)的流動(dòng)性，當(dāng)前施工工程規(guī)模不斷擴(kuò)大，造成了當(dāng)前土木工程的施工地點(diǎn)往往不固定，施工中需要進(jìn)行多次的移動(dòng)。同時(shí)，土木工程中施工人員大都未能經(jīng)過完善的訓(xùn)練和學(xué)習(xí)，專業(yè)施工技術(shù)的缺乏使得土木工程施工技術(shù)使用存在不足，且施工人員流動(dòng)性強(qiáng)。這兩類問題往往造成了施工內(nèi)容和施工質(zhì)量的不穩(wěn)定，直接影響了土木工程施工效率和施工質(zhì)量。

2.1.2 菌種的復(fù)篩 紙層析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從活禽攤土分離到的菌株的發(fā)酵液均有層析帶出現(xiàn)，果蔬攤土及樹林土中分離到的菌株中僅有個(gè)別的菌株有層析帶的出現(xiàn)，并且與L-Gln標(biāo)準(zhǔn)品在同一位置。表明這些菌株的發(fā)酵液中含有L-Gln，其中有6株的L-Gln的含量在1 g/L以上，但含量最高的也僅有2 g/L左右，其編號為BL-12。

2.2 菌株BL-12的誘變選育 菌株BL-12經(jīng)過紫外線和硫酸二乙酯化學(xué)誘變，再經(jīng)過磺胺胍、高濃度硫酸銨平板篩選和搖瓶發(fā)酵，篩選得到一株具有磺胺胍、高濃度硫酸銨抗性的菌株BLCC7-0162，在未經(jīng)培養(yǎng)基優(yōu)化的條件下，可產(chǎn)生L-Gln 8.0 g/L左右。

2.3 菌株BLCC7-0162生長曲線的測定 由圖1可以看出，菌株BLCC7-0162的延滯期是0～2 h，較短，2 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，10 h達(dá)到穩(wěn)定期，穩(wěn)定期持續(xù)的時(shí)間比較長。

2.4 菌株BLCC7-0162發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

圖1 菌株BLCC7-0162的生長曲線

2.4.1 碳酸鈣濃度對菌株合成L-Gln的影響 發(fā)酵液中由于硫酸銨的不斷利用及伴隨著谷氨酸和L-Gln的形成，使發(fā)酵液的pH值下降，進(jìn)而影響菌株的生長和產(chǎn)物的形成。碳酸鈣具有緩沖發(fā)酵液pH的作用，因此可使pH維持在一個(gè)比較適宜的水平。從圖2可以看出，不同的碳酸鈣添加水平對菌株合成L-Gln的能力有較大的影響，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加3%的碳酸鈣更有利于L-Gln的積累。過高，會(huì)影響菌體生長和發(fā)酵期間的溶氧，過低，無法中和氫離子，導(dǎo)致發(fā)酵液pH下降，不利于L-Gln的合成。

圖2 碳酸鈣濃度對L-Gln產(chǎn)量的影響

2.4.2 葡萄糖濃度對菌株合成L-Gln的影響 葡萄糖能夠直接影響到菌體的生長和產(chǎn)酸的水平。本試驗(yàn)采用不同濃度的葡萄糖進(jìn)行發(fā)酵。從圖3可以看出，葡萄糖含量在12%以下時(shí)，L-Gln產(chǎn)量相對較高，大于14%時(shí)L-Gln產(chǎn)量明顯下降。

圖3 葡萄糖濃度對L-Gln產(chǎn)量的影響

2.4.3 硫酸銨濃度對菌株合成L-Gln的影響 硫酸銨為菌株的生長提供了氮源，同時(shí)高濃度的NH4+是L-Gln發(fā)酵中抑制谷氨酸合成以及刺激L-Gln合成的必要條件，所以要求培養(yǎng)基中必須有較高水平的硫酸銨。但NH4+的濃度過高會(huì)抑制L-谷氨酰胺合成酶的活性，不利于L-谷氨酸向L-谷氨酰胺的轉(zhuǎn)化。從圖4可以看出，硫酸銨濃度在6%以下時(shí)，L-Gln的合成相對較高，其中以4%時(shí)產(chǎn)量最高，在7%以上明顯下降。

圖4 硫酸銨濃度對L-Gln產(chǎn)量的影響

2.4.4 玉米漿濃度對菌株合成L-Gln的影響 由于玉米漿的主要成分是氨基酸和多肽類，還含有豐富生長因子，成分較復(fù)雜，其成分受玉米來源及處理方法的影響而不同。本試驗(yàn)考察了添加不同濃度的玉米漿對菌株合成L-Gln的影響，結(jié)果見圖5。從圖5可以看出，隨著玉米漿濃度的增加，L-Gln的合成量呈下降趨勢，添加量為0.5%時(shí)，L-Gln的合成量相對較高。

圖5 玉米漿濃度對Gln產(chǎn)量的影響

2.4.5 不同初始pH對菌株合成L-Gln的影響L-Gln在菌株合成累積的過程中會(huì)被L-谷氨酰胺酶降解為谷氨酸。谷氨酸是酸性氨基酸，在堿性條件下更利于谷氨酸的生成，同時(shí)由于本試驗(yàn)中添加了具有pH緩沖作用的碳酸鈣，所以本試驗(yàn)采用不同的初始pH進(jìn)行菌株對L-Gln合成的影響，結(jié)果見圖6。從圖6可以看出，起始pH為7.0～7.5時(shí)更有利于L-Gln的生成。

圖6 不同初始pH對L-Gln產(chǎn)量的影響

2.4.6 正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基組成 根據(jù)上述各因素的單因子試驗(yàn)結(jié)果，對葡萄糖、硫酸銨及玉米漿進(jìn)行3因素3水平試驗(yàn)，結(jié)果見表1。由表1可以看出，影響L-Gln產(chǎn)量的因素的主次順序?yàn)椋浩咸烟牵居衩诐{＞硫酸銨。試驗(yàn)所得的最佳組合為A2B2C2，即葡萄糖12%、硫酸銨5%、玉米漿1%。采用此配方，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果顯示，L-Gln的產(chǎn)量為（45.82±1.23）g/L。 因此，后續(xù)試驗(yàn)采用此配方進(jìn)行。

表1 L9（33）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

2.4.7 正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基中無機(jī)鹽的組成 以篩選出的葡萄糖12%、硫酸銨5%、玉米漿1%、碳酸鈣3%為基礎(chǔ)配方，進(jìn)行硫酸鎂、硫酸鋅、硫酸錳及磷酸二氫鉀的四因素三水平正交試驗(yàn)。由表2試驗(yàn)結(jié)果可以看出，影響L-Gln產(chǎn)量的因素的主次順序?yàn)椋毫姿岫溻?硫酸鋅＞硫酸鎂＞硫酸錳。試驗(yàn)所得的最佳組合為A2B1C1D2，即磷酸二氫鉀 0.1%、硫酸鎂 0.04%、硫酸錳 2 mg/L、硫酸鋅2.5 mg/L。采用此配方，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果顯示，L-Gln 的產(chǎn)量為（46.89±1.06）g/L。

2.5 菌株BLCC7-0162的鑒定

2.5.1 菌落及菌體形態(tài) 該菌株在篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，其菌落呈圓形，白色，邊緣整齊，表面光滑、濕潤，顯微鏡下觀察菌體呈短桿至小棒狀，有時(shí)微彎曲，兩端鈍圓，單個(gè)或成八字排列，革蘭氏染色陽性。

2.5.2 16S rDNA序列和系統(tǒng)發(fā)育分析 該菌株的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，在分子量大小為1500 bp左右得到一條特異性好的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖7）。

表2 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

圖7 菌株BLCC7-0162 16S rDNA的PCR電泳圖

將菌株BLCC7-0162的16S rDNA序列與http：//www.ncbi.nlm.nih.gov網(wǎng)站上己登錄的部分菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示菌株BLCC7-0162與已報(bào)道的Corynebacterium glutamicum （DQ171711.1）的序列同源性達(dá)到100%。鑒定該菌株屬于谷氨酸棒狀桿菌。

選擇與BLCC7-0162同源性較高的部分已登錄的相關(guān)菌株序列，用ClustalX1.83軟件進(jìn)行陣列比對后利用MEGA 3.1軟件進(jìn)行分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖8）。

3 小結(jié)

3.1 從樹林土、果蔬攤土、活禽攤土等樣品中分離篩選到6株產(chǎn)L-Gln含量在1 g/L以上的菌株，發(fā)現(xiàn)其中活禽攤土是L-Gln產(chǎn)生菌較好的來源。

圖8 菌株BLCC7-0162與相關(guān)菌株的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

3.2 以BL-12為出發(fā)菌株，經(jīng)過紫外線及化學(xué)（硫酸二乙酯）誘變，再通過磺胺胍、高濃度硫酸銨定向篩選，得到一株產(chǎn)L-Gln能力較強(qiáng)的菌株BLCC7-0162，在未經(jīng)培養(yǎng)基優(yōu)化的條件下，三角瓶發(fā)酵48 h可以產(chǎn)生8.0 g/L的L-Gln。

3.3 通過對發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，菌株BLCC7-0162經(jīng)60 h搖瓶發(fā)酵后L-Gln產(chǎn)量達(dá)到47 g/L左右。優(yōu)化后的培養(yǎng)基為：葡萄糖12%、硫酸銨5%、玉米漿1%、磷酸二氫鉀0.1%、硫酸鎂0.04%、硫酸錳2 mg/L、硫酸鋅2.5 mg/L、碳酸鈣3%、初始pH 7.0～7.5。

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