黑逍遙散含藥血清對 Aβ25～35誘導(dǎo)阿爾茨海默病細(xì)胞模型的影響

黑逍遙散含藥血清對Aβ25～35誘導(dǎo)阿爾茨海默病細(xì)胞模型的影響

吳紅彥1李海龍1張蕓2趙鵬顧靜車敏王虎平1

(甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730000)

摘要〔〕目的 觀察黑逍遙散含藥血清對由Aβ25～35片段毒性誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞阿爾茨海默病(AD) 模型凋亡的影響。方法利用細(xì)胞計數(shù)、MTT 及流式細(xì)胞術(shù)測定觀察黑逍遙散含藥血清處理由Aβ片段誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞活力、形態(tài)學(xué)及細(xì)胞凋亡的改變。結(jié)果黑逍遙散含藥血清能增加Aβ25～35導(dǎo)致的升高PC12細(xì)胞的活力，降低 LDH釋放，流式細(xì)胞術(shù)分析顯示, 黑逍遙散含藥血清能降低增加細(xì)胞凋亡率。結(jié)論黑逍遙散含藥血清能升高PC12細(xì)胞的活力，降低 LDH釋放，對Aβ25～35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡有明顯的保護作用。

關(guān)鍵詞〔〕黑逍遙散; 阿爾茨海默病; PC12細(xì)胞；Aβ25～35；細(xì)胞凋亡

中圖分類號〔〕R289.3〔

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81060284)；甘肅省財政廳高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費項目(甘財教〔2009〕192號)

The effects of serum containing Heixiaoyao powder on apoptosis of cell model of Alzheimer's disease induced by Aβ25～35fragment

WU Hong-Yan,LI Hai-Long,ZHANG Yun,etal.

Basic Medical School of Gansu College of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730000,Gansu,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the influence of serum containing Heixiaoyao powder on apoptosis of PC12 ,a model of Alzheimer's disease (AD)induced by Aβ25～35 fragment toxic effects.MethodsCell viability, morphological changes and apoptosis of AD model of PC12 cells induced by Aβ25～35 fragment were detected by cell counting,MTT and flow cytometry.ResultsThe serum containing Heixiaoyao powder increased the vitality of PC12 cells,reduced the release of LDH,and reduced apoptosis rate.ConclusionsThe serum containing Heixiaoyao powder have significant protective effects on apoptosis of PC12 cells induced by Aβ25～35.

【Key words】Heixiaoyao powder;Alzheimer's disease; PC12 cells; Aβ25～35;Apoptosis

1甘肅省中藥新產(chǎn)品創(chuàng)新工程實驗室2甘肅省中醫(yī)院

第一作者：吳紅彥(1963-)，男，教授，主要從事方劑藥理與新藥開發(fā)研究。

中醫(yī)傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，阿爾茨海默病(AD)的發(fā)生與心、腎最為密切，屬本虛標(biāo)實。中醫(yī)治療AD一般多從心、腎等不同臟腑及氣、血、痰、瘀、火、郁等病機論治。針對中醫(yī)對于AD病位在腦、心、肝、脾、腎和“虛、瘀、痰”的三大病機治療AD。課題組通過文獻回顧，結(jié)合循證醫(yī)學(xué)及臨床研究，提出從肝論治AD的假說。因而，本實驗擬以Aβ25～35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞復(fù)制AD細(xì)胞模型，采用黑逍遙散含藥血清以不同濃度加以干預(yù)，從細(xì)胞活力、細(xì)胞膜損傷和細(xì)胞凋亡的變化入手，探索其藥理機制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物及細(xì)胞SPF級Wistar大鼠40只，雌雄各半，體重(300±20)g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實驗動物中心提供, 動物質(zhì)量合格證編號：SCXK(甘)2004-0006-0000994，實驗設(shè)施使用許可證編號：SYXK(甘)2004-0006-0000308。動物分籠飼養(yǎng)，食固體飼料，飼料由甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實驗動物中心提供，食水自由，室溫20℃～25℃，相對濕度45%～52%。PC12細(xì)胞(中分化)購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.1.2實驗藥品與試劑中藥材均購于甘肅蘭州老字號“復(fù)興厚”藥材公司；DMEM：Sigma公司，批號：NVL0337。細(xì)胞培養(yǎng)液：將DMEM培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清和1%雙抗，0.22 μm濾器過濾除菌，pH7.2～7.4，4℃保存。磷酸鹽緩沖液(PBS)：購于Gibco公司，批號：20101025；用雙蒸水定容至1 000 ml，0.22 μm濾器過濾除菌，pH7.2～7.4，4℃保存。Hank:Solarbio，批號：H1025。胎牛血清：杭州四季青公司，批號：100528；56℃滅活30 min，無菌分裝，-20℃保存，使用前經(jīng)4℃、室溫、37℃緩慢溶解備用。胰蛋白酶：購于鵬程公司，批號：0458；用PBS液配制成濃度為0.25%溶液，0.22 μm濾器過濾除菌，4℃保存。四氮唑藍(lán)(MTT)：購于鵬程生物工程公司，批號：0793；用pH7.4的PBS溶解，用時配成終濃度5 mg/ml的溶液，4℃避光保存。二甲基亞砜(DMSO)：購于鵬程公司。LDH試劑盒：購于南京建成生物工程研究所，批號：20101025。Aβ25～35：sigma公司，批號：108k4794。AnnexingV/PI試劑盒：杭州聯(lián)科生物公司，批號：JK100929。

1.2方法

1.2.1Aβ配制方法將1 mg Aβ25～35溶解于BPS液中，配制成濃度為1 mmol/L母液。儲存于-30℃冰箱中備用。使用時將其稀釋10倍至100 μmol/L，并置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中3～7 d以增強其毒性。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)PC12細(xì)胞株完全培養(yǎng)液為DMEM+10%(體積比)胎牛血清+青鏈霉素，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3～4 d傳代1次。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況。

1.2.3實驗分組正常組：只加細(xì)胞懸液，不加任何處理因素；模型組：取20 μmol/L終濃度的Aβ25～3530 μl處理細(xì)胞24 h；空白血清組：加入空白血清30 μl預(yù)處理24 h后加入20 μmol/L終濃度Aβ25～3530 μl共同孵育24 h；藥物組：高劑量組、中劑量組、小劑量組含藥血清30 μl預(yù)處理24 h后加入20 μmol/L終濃度Aβ25～3530 μl共同孵育24 h。

1.2.4MTT法測細(xì)胞活力取對數(shù)生長期PC12細(xì)胞，消化、離心后用完全培養(yǎng)液重懸，濃度為104/ml，接種于96孔板，每孔加細(xì)胞培養(yǎng)液100 μl，細(xì)胞貼壁后，吸取舊的培養(yǎng)液，每組設(shè)4個平行樣本，按上述分組處理后，各孔吸去上清液20 μl，加濃度為0.5 mg/ml MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后每孔加200 μl二甲基亞砜，震蕩8 min，使紫色結(jié)晶充分溶解，空白孔調(diào)零，酶聯(lián)免疫檢測儀上測每孔吸光度即OD值(檢測波長570 nm)。

1.2.5LDH測定取對數(shù)生長期PC12細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，吹打成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞按照以1×105/孔的密度接種于96孔板，每孔加細(xì)胞培養(yǎng)液90 μl，每組設(shè)8個平行樣本，根據(jù)實驗分組處理后，按LDH試劑盒說明進行標(biāo)本的測定。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值)。LDN活性=(ODu-ODc)/(ODs-ODb)×Cs×N×1000式中：ODu為測定管吸光度值、ODc空白管吸光度值、ODs為標(biāo)準(zhǔn)管吸光度值、ODb為對照管吸光度值、Cs為標(biāo)準(zhǔn)濃度(2 mmol/L)、N為樣品測試前稀釋倍數(shù)。

1.2.6流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡①取對數(shù)生長期PC12細(xì)胞(1×105/孔)，接種于6孔板，實驗分組如前處理②處理后經(jīng)胰酶消化、吹打成單細(xì)胞懸液，移入離心管中。③將離心管于1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS漂洗1次后，重復(fù)離心洗滌一次。④依據(jù)試劑盒說明進行操作，將細(xì)胞重懸于500 μl binding buffer中，再分別加入5 μl的AnnexinV-FITC溶液和10 μl PI染液，避光于室溫放置5 min。④轉(zhuǎn)至流式檢測管，上機檢測，實驗同法重復(fù)3次。

2結(jié)果

2.1培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察正常組PC12細(xì)胞生長速度快，貼壁良好，大多伸出長的軸突，容易成簇生長。在模型組中細(xì)胞明顯損傷，數(shù)量顯著減少，可見PC12細(xì)胞腫脹、圓縮，突起回縮，貼壁功能下降，有脫壁漂浮現(xiàn)象。

2.2MTT檢測結(jié)果見表1。與正常組相比，造模組PC12細(xì)胞的OD值明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，含藥血清組細(xì)胞的OD值明顯升高(P<0.05)；黑逍遙散含藥血清組間比較，與模型組比較1)P<0.05,2)P<0.01;與黑逍遙散高劑量比較:3)P<0.05,4)P<0.01高劑量組細(xì)胞的OD值顯著高于其他兩個劑量組(P<0.05或P<0.01)。

分組nOD值LDH活性正常組80.630±0.1712)433.47±99.852)模型組80.224±0.069875.51±102.27空白組80.234±0.082832.72±186.95黑逍遙散低劑量組80.322±0.0721)4)737.49±85.231)4)黑逍遙散中劑量組80.424±0.0731)3)624.32±76.761)3)黑逍遙散高劑量組80.522±0.0681)507.14±74.081)

2.3LDH檢測結(jié)果見表1。神經(jīng)細(xì)胞損傷程度與LDH 釋放量呈正比。與正常組相比，模型組細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH釋放量明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，不同濃度的黑逍遙散含藥血清組細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH釋放量顯著降低(P<0.05)；黑逍遙散含藥血清組間比較，高劑量組LDH釋放量明顯低于其他兩個劑量組(P<0.05或P<0.01)。

2.4細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果見表2。與正常組比較，模型組細(xì)胞活力降低(P<0.01)、細(xì)胞凋亡率升高(P<0.01)；與模型組比較，黑逍遙散含藥血清組細(xì)胞活力升高(P<0.01)、細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.01)；含藥血清組間比較，高劑量組的細(xì)胞活力明顯高于其他兩個劑量組，凋亡率明顯低于其他兩個劑量組(P<0.01)。

分組n細(xì)胞活力細(xì)胞凋亡率(%)正常組368.07±8.781)21.10±3.151)模型組329.73±1.2063.57±5.92空白組337.13±2.2554.13±1.26黑逍遙散低劑量組340.93±1.781)3)46.75±0.681)3)黑逍遙散中劑量組345.23±2.301)3)43.47±0.601)2)黑逍遙散高劑量組353.50±2.801)38.00±1.351)

與模型組比較:1)P<0.01;與黑逍遙散高劑量比較:2)P<0.05,3)P<0.01

3討論

黑逍遙散由逍遙散加熟地演化而成，黑逍遙散以逍遙散疏肝解郁，健脾養(yǎng)血之功的前提下，更加熟地滋陰養(yǎng)血，益腎補精，填精益髓之力更強。組方中藥物的現(xiàn)代研究表明：從地黃葉中提取的麥角甾苷能劑量依賴性保護細(xì)胞免受葡萄糖氧化酶的細(xì)胞凋亡、避免細(xì)胞凋亡〔1〕；地黃抗氧化損傷的保護作用可能通過激活MAP激酶、Erk、Bcl-2家族蛋白實現(xiàn)〔2〕；熟地〔3〕可以提高SOD、NOS活性、減少MDA、LPO含量，能改善衰老大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，明顯降低模型大腦皮層衰老相關(guān)-β半乳糖苷酶陽性表達的細(xì)胞數(shù)，可以延緩大鼠腦衰老。柴胡醇能提高中樞神經(jīng)興奮性〔4〕；柴胡皂苷可以抑制膽堿酯酶，減少乙酰膽堿的水解，發(fā)揮擬膽堿作用，對神經(jīng)系統(tǒng)有調(diào)節(jié)作用〔5〕。當(dāng)歸中藁本內(nèi)酯有較強的鎮(zhèn)靜作用〔6〕；其水提醇沉所得總浸膏有鎮(zhèn)痛、抗驚厥、延長戊巴比妥所致的睡眠、緩解記憶缺失作用〔7〕；還可明顯提高D-半乳糖誘導(dǎo)的亞急性衰老小鼠大腦皮層中SOD活性，Ca2+-ATP酶活性，降低脂褐素含量，高劑量時效果更加明顯，證明當(dāng)歸具有抗衰老作用〔8〕。白芍總甙具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、促智、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗膽堿能作用〔9〕；芍藥甙對海馬和隔區(qū)神經(jīng)元的存活和生長具有促進作用〔10〕；甲醇提取的芍藥苷(0.001～1.0 mg/kg)有劑量依賴性改善作用〔11〕。白術(shù)及白術(shù)多糖能提高小鼠學(xué)習(xí)記憶和抗氧化作用〔12〕；白術(shù)水煎劑給老年小鼠灌胃四周，可顯著提高全血GSH-Px活力，明顯降低紅細(xì)胞中MDA含量，具有一定的抗衰老作用〔13〕。茯苓多糖〔14〕制劑能不同程度增加血清中SOD活性，降低MDA含量，還能延緩小鼠游泳死亡時間，具有抗寒、抗疲勞及抗衰老作用。綜上所述，黑逍遙散用于老年性癡呆的治療，既有從肝、脾論治的理論依據(jù)，亦符合中醫(yī)辨證論治以法統(tǒng)方，以法用方、譴藥配伍的原則，更有現(xiàn)代藥理研究的客觀依據(jù)。

本實驗結(jié)果表明，在Aβ25～35誘導(dǎo)的作用下，PC12細(xì)胞發(fā)生顯著的凋亡，各含藥血清均升高PC12細(xì)胞的活力，降低 LDH釋放，對Aβ25～35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡有明顯的保護作用。

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〔2012-06-17修回〕

(編輯袁左鳴)