低等級(jí)胚胎囊胚培養(yǎng)及凍融周期移植后臨床結(jié)局分析

王雅琴，楊菁，徐望明，吳庚香

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，武漢 430060）

在輔助生殖技術(shù)（ART）中，對(duì)低等級(jí)胚胎的處理一直是生殖領(lǐng)域棘手的難題，一方面低等級(jí)胚胎移植后種植率低，另一方面冷凍后復(fù)蘇率低。這部分胚胎是直接廢棄，還是有繼續(xù)利用的臨床價(jià)值？目前在生殖醫(yī)學(xué)界尚無明確定論。隨著囊胚體外培養(yǎng)體系的不斷優(yōu)化，囊胚培養(yǎng)作為一種對(duì)胚胎發(fā)育潛能進(jìn)一步篩選的方法，已被廣泛應(yīng)用于臨床［1］。由于囊胚培養(yǎng)有一定的淘汰率，既往的研究認(rèn)為，當(dāng)?shù)?天（D3）有3個(gè)以上8細(xì)胞的優(yōu)質(zhì)胚胎時(shí)，可以考慮行囊胚培養(yǎng)篩選優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植，從而提高種植率及臨床妊娠率［2］。但對(duì)于多個(gè)低等級(jí)胚胎，囊胚培養(yǎng)是否有助于其篩選出有發(fā)育潛能的胚胎、增加妊娠機(jī)會(huì)，仍有待臨床進(jìn)一步考證。本研究主要應(yīng)用鮮胚周期D3的低等級(jí)胚胎繼續(xù)進(jìn)行體外囊胚培養(yǎng)，觀察囊胚形成情況及相關(guān)臨床資料，并進(jìn)一步追蹤鮮胚周期未妊娠續(xù)行凍融周期囊胚移植患者的臨床妊娠結(jié)局，以評(píng)價(jià)低等級(jí)胚胎行囊胚培養(yǎng)及移植的可行性，為提高低等級(jí)胚胎的有效利用和臨床囊胚移植尋找理論依據(jù)。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選擇2012年1月至2014年3月在我院生殖醫(yī)學(xué)中心接受體外受精-胚胎移植或卵胞漿內(nèi)單精子注射-胚胎移植（IVF-ET／ICSI-ET）的679例不孕癥患者684個(gè)周期不符合凍存標(biāo)準(zhǔn)的3 536個(gè)剩余低等級(jí)胚胎進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，回顧性分析患者鮮胚周期各臨床指標(biāo)參數(shù)以及鮮胚未妊娠凍融囊胚復(fù)蘇后的臨床妊娠情況。本研究得到了醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并與患者簽署知情同意書。

二、方法

1.臨床促排卵方案和移植時(shí)間：促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑（GnRH-a，達(dá)必佳，輝凌公司，德國）0.1mg／d注射后14～16d達(dá)到垂體降調(diào)節(jié)后給予促性腺激素，陰道B 超監(jiān)測卵泡直徑發(fā)育至至少有兩個(gè)主導(dǎo)卵泡的直徑達(dá)18mm 以上時(shí)，注射人絨毛膜促性腺激素（HCG，珠海麗珠）8 000～10 000U，36～37h后經(jīng)陰道超聲下穿刺取卵，取卵后72h選取2個(gè)胚胎進(jìn)行移植。

2.囊胚培養(yǎng)和囊胚評(píng)級(jí)：將新鮮胚胎移植后（或全胚冷凍周期）D3剩余的優(yōu)胚進(jìn)行冷凍，其它低等級(jí)胚胎轉(zhuǎn)行囊胚培養(yǎng)，使用Quinns AdvantageTM囊胚培養(yǎng)基（SAGE，美國）進(jìn)行胚胎體外培養(yǎng)。本研究中低等級(jí)胚胎的納入標(biāo)準(zhǔn)是D3低等級(jí)胚胎數(shù)≥4個(gè)，胚胎卵裂球數(shù)在3～5 個(gè)、胚胎碎片在5%～20%。卵裂球數(shù)＜3個(gè)細(xì)胞或碎片＞20%的質(zhì)量極差胚胎不納入本研究低等級(jí)胚胎中。所有低等級(jí)胚胎行囊胚序貫培養(yǎng)至D5／D6，觀察是否有囊胚形成，并對(duì)形成的囊胚選用Gardner等［3］分級(jí)方法進(jìn)行分級(jí)，D5評(píng)分≥3BB 為優(yōu)質(zhì)囊胚，≥3CC 行囊胚玻璃化冷凍保存。

3.解凍囊胚并行凍融周期囊胚移植：采用人工周期或自然周期準(zhǔn)備內(nèi)膜，在黃體酮注射5d后進(jìn)行超聲引導(dǎo)下囊胚移植。囊胚在移植前1d解凍并體外培養(yǎng)。

4.妊娠確認(rèn)：移植后12d抽血測HCG，陽性者診斷為生化妊娠，移植后30d行陰道B 超見孕囊者則診斷為臨床妊娠。

5.觀察指標(biāo)：觀察低等級(jí)胚胎的囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率、鮮胚周期臨床妊娠率、種植率、流產(chǎn)率及宮外孕率，凍融周期囊胚移植的種植率、妊娠率、流產(chǎn)率及異位妊娠率。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料用率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料采用（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、囊胚培養(yǎng)情況

患者年齡22～41歲，平均年齡（31.0±4.6）歲，共684個(gè)周期的3 536枚胚胎進(jìn)行囊胚培養(yǎng)（平均每周期4～12 個(gè)胚胎），有475 個(gè)周期形成囊胚1 187個(gè)，囊胚形成率為33.6%，209個(gè)周期無囊胚形成。根據(jù)患者年齡將患者分為＞35歲組和≤35歲組，結(jié)果顯示＞35歲組囊胚形成率為21.9%，≤35歲組囊胚形成率為34.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。根據(jù)有無囊胚形成將患者分為有囊胚形成組與無囊胚形成組，比較兩組間平均年齡、獲卵數(shù)、基 礎(chǔ)FSH 值、Gn 天 數(shù)，Gn 用 量，HCG 日E2值，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。進(jìn)一步將獲卵數(shù)分為≤10個(gè)組和＞10個(gè)組，結(jié)果顯示，≤10個(gè)組有囊胚形成周期比率為61.4%，無囊胚形成周期比率為38.6%；＞10個(gè)組有囊胚形成周期比率為79.2%，無囊胚形成周期比率為30.8%。比較兩組間受精方式與囊胚形成的關(guān)系，有囊胚形成組IVF周期比率為69.1%，ICSI周期比率為30.9%；無囊胚形成組IVF周期比率占46.2%，無囊胚形成組ICSI周期比率占53.8%。

二、鮮胚移植周期與囊胚形成率的關(guān)系

新鮮周期胚胎移植患者中，有囊胚形成組426個(gè)周期，無囊胚形成組187個(gè)周期，有囊胚形成鮮胚移植組受精率、臨床妊娠率、種植率顯著高于無囊胚形成組，流產(chǎn)率低于無囊胚形成組，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

三、囊胚解凍復(fù)蘇后臨床妊娠情況

共122個(gè)周期鮮胚移植未妊娠患者進(jìn)入凍融囊胚周期，共解凍低等級(jí)胚胎囊胚培養(yǎng)形成的囊胚220個(gè)，囊胚復(fù)蘇率為81.4%（179／220），共111個(gè)周期成功復(fù)蘇囊胚并移植。平均移植囊胚數(shù)為（1.6±0.2）個(gè)，囊胚移植周期臨床妊娠率（40.5%），種植率（27.4%），流產(chǎn)率（8.89%），與同期卵裂期胚胎凍融周期臨床妊娠率（43.0%）、種植率（24.0%）、流產(chǎn)率（7.8%）比 較，兩 組 間 差 異 無 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義（P ＞0.05）；囊胚移植組復(fù)蘇率（81.4%）、異位妊娠率（8.9%）與同期卵裂期胚胎凍融周期復(fù)蘇率（94.4%）、異位妊娠率（3.7%）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表3）。

四、凍融周期囊胚移植異位妊娠發(fā)生情況

111個(gè)凍融周期囊胚移植中45 個(gè)周期臨床妊娠，共有4例發(fā)生異位妊娠。其中，輸卵管妊娠3例，卵巢妊娠1例，移植囊胚均為優(yōu)質(zhì)囊胚（表4）。

表1 有囊胚形成組與無囊胚形成組一般情況的比較（±s）

表1 有囊胚形成組與無囊胚形成組一般情況的比較（±s）

組 別 例數(shù) 年齡（歲）不孕時(shí)間（年）獲卵數(shù)（個(gè)）bFSH（U／L）Gn用量（支）Gn天數(shù)（d）HCG 日E2 值（pmol／L）1.4 11.7±2.2 15 510.3±7 265.8無囊胚形成組 209 31.1±4.6 3.9±3.0 14.2±6.6 6.9±3.4 29.9±1有囊胚形成組 475 30.8±4.2 4.1±2.5 17.7±6.4 6.3±3.1 28.7±1 4.3 11.5±2.6 14 609.3±6 869.1

表2 有囊胚形成移植組與無囊胚形成移植組指標(biāo)比較（n，%）

表3 凍融囊胚移植組與卵裂期胚胎移植組間妊娠情況比較

表4 囊胚移植后異位妊娠患者移植囊胚情況

討 論

胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分是目前最常用的胚胎評(píng)估方法［4］，卵裂期胚胎評(píng)分主要對(duì)卵裂球數(shù)目、細(xì)胞均勻程度以及碎片多少進(jìn)行評(píng)估，具有無創(chuàng)、快速、簡便的優(yōu)點(diǎn)。臨床上對(duì)卵裂期胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分為低等級(jí)胚胎的處理尚無定論，目前多數(shù)學(xué)者建議可繼續(xù)行囊胚培養(yǎng)進(jìn)行篩選。盡管與優(yōu)質(zhì)胚胎相比，低等級(jí)胚胎囊胚形成率較低，但進(jìn)一步延長體外培養(yǎng)時(shí)間可以讓其有更多自我選擇的機(jī)會(huì)［5］。如發(fā)生胚胎發(fā)育阻滯，可以及早取消避免無效移植。本研究共納入了3 536個(gè)D3形態(tài)學(xué)評(píng)分判定為低等級(jí)胚胎，獲得了33.6%的囊胚形成率，并在凍胚周期囊胚復(fù)蘇移植后獲得了40.5%的臨床妊娠率。本結(jié)果提示：胚胎的發(fā)育潛能并非與其形態(tài)完全一致，即使形態(tài)學(xué)評(píng)分為低等級(jí)的胚胎仍有獲得優(yōu)質(zhì)囊胚的可能，僅僅根據(jù)常規(guī)的卵裂期胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分來預(yù)測胚胎的發(fā)育潛能仍有相對(duì)的局限性。臨床上對(duì)剩余的低等級(jí)胚胎可延長體外培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)至囊胚，篩選出具有發(fā)育潛能的胚胎并冷凍保存，從而可以最大限度地利用胚胎，增加患者妊娠機(jī)會(huì)。

回顧性分析鮮胚周期低等級(jí)胚胎囊胚形成影響因素中，我們發(fā)現(xiàn)＞35歲組囊胚形成率明顯低于≤35歲組，提示年齡是影響低等級(jí)胚胎囊胚形成的原因之一，年齡越大，胚胎發(fā)育潛能下降。此外，研究中比較無囊胚形成組與有囊胚形成組間獲卵數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但進(jìn)一步將獲卵數(shù)分為≤10 個(gè)組和＞10個(gè)組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)≤10個(gè)組無囊胚形成周期比率明顯高于＞10個(gè)組，這一結(jié)果提示，對(duì)于獲卵數(shù)及胚胎數(shù)較少、且胚胎質(zhì)量不佳者，進(jìn)一步行囊胚培養(yǎng)可能增加患者無胚胎移植風(fēng)險(xiǎn)。研究中比較受精方式與囊胚形成關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，無囊胚形成組ICSI周期比率明顯高于無囊胚形成組，分析原因可能與男方精子質(zhì)量與胚胎發(fā)育潛能有一定的關(guān)系。

進(jìn)一步分析鮮胚周期剩余低等級(jí)胚胎囊胚形成率與臨床妊娠率的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，剩余胚胎有囊胚形成周期的受精率、優(yōu)胚率、臨床妊娠率及種植率均顯著高于無囊胚形成周期，這與大部分文獻(xiàn)報(bào)道［6］結(jié)果一致。胚胎能否逾越8細(xì)胞阻滯期發(fā)育到囊胚，往往可間接預(yù)示著本周期其它胚胎的種植能力。本研究中有111個(gè)周期鮮胚移植后有囊胚形成而未妊娠者繼續(xù)行凍融周期囊胚移植，囊胚移植組臨床妊娠率、種植率及流產(chǎn)率與同期卵裂期胚胎移植周期比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本結(jié)果還提示通過囊胚培養(yǎng)對(duì)低等級(jí)胚胎進(jìn)行篩選，一旦形成囊胚并在凍融周期行囊胚移植可達(dá)到與卵裂期凍胚移植相似的妊娠率和種植率，最大程度地增加了患者累積妊娠率，從而改善輔助生殖助孕結(jié)局。

與自然妊娠相比，IVF 周期異位妊娠率提高了接近2.5～5倍。ART 中發(fā)生異位妊娠可能與輸卵管病變、子宮內(nèi)膜異位癥致盆腔微環(huán)境改變、移植管的置管深度、移植時(shí)的推注速度、植入胚胎的數(shù)目、移植的時(shí)機(jī)、胚胎在宮腔內(nèi)游走及胚胎與子宮內(nèi)膜發(fā)育的同步性等因素有關(guān)［7-8］。有研究顯示，與D2移植比較，D3移植異位妊娠率有降低的趨勢，原因可能與隨著黃體期的延長，子宮收縮力降低有關(guān)。Fanchin等［9］研究發(fā)現(xiàn)，與HCG 當(dāng)日比較，HCG 日后7d從宮底至宮頸的子宮收縮運(yùn)動(dòng)明顯減少。與卵裂期胚胎移植相比，囊胚期移植理論上更符合自然生理規(guī)律，更接近子宮內(nèi)膜的開窗期，且囊胚期卵巢黃體分泌孕酮更為旺盛，使得子宮壁及輸卵管運(yùn)動(dòng)收縮明顯減弱，加上囊胚體積較大，運(yùn)動(dòng)游走更為困難，以上因素均有利于減少異位妊娠的發(fā)生。然而，在本研究中我們發(fā)現(xiàn)凍融周期囊胚移植組異位妊娠率高于卵裂期胚胎移植組，分析原因可能與樣本量尚小可能影響結(jié)果偏倚有關(guān)，我們將繼續(xù)擴(kuò)大觀察樣本嚴(yán)密追蹤。此4例囊胚期移植宮外孕患者均移植的是優(yōu)質(zhì)囊胚，3例為輸卵管妊娠，另1例為較罕見的卵巢妊娠，此現(xiàn)象說明囊胚移植至宮腔后仍能發(fā)生遠(yuǎn)處游走。近年關(guān)于囊胚期移植是否降低異位妊娠率仍有一定的爭論［10-11］，我們目前的數(shù)據(jù)尚無足夠的統(tǒng)計(jì)學(xué)證據(jù)表明囊胚移植可以降低異位妊娠的風(fēng)險(xiǎn)，我們認(rèn)為，不應(yīng)為避免異位妊娠而選擇囊胚移植。

綜上所述，我們認(rèn)為，對(duì)胚胎質(zhì)量的評(píng)估手段依然需要不斷完善，對(duì)形態(tài)學(xué)評(píng)估為低等級(jí)的胚胎不應(yīng)完全放棄，囊胚培養(yǎng)可幫助篩選出有發(fā)育潛能的胚胎，以增加胚胎的有效利用率和累計(jì)妊娠率。對(duì)于高齡、獲卵數(shù)少的患者，行低等級(jí)胚胎囊胚培養(yǎng)具有一定的風(fēng)險(xiǎn)，需謹(jǐn)慎。囊胚培養(yǎng)不能降低異位妊娠及流產(chǎn)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。盡管有學(xué)者對(duì)發(fā)育滯后的低等級(jí)胚胎持有應(yīng)用安全性方面的疑問，比如囊胚培養(yǎng)延長體外培養(yǎng)時(shí)間，增加單卵雙胎率及影響胚胎的基因表達(dá)和表觀遺傳修飾等風(fēng)險(xiǎn)，但這些問題都有待于進(jìn)一步研究探索。

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