響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取皺蓋假芝脂溶性成分的研究*

黃紀國，韓園園，謝意珍，潘鴻輝**

（1.廣東省微生物研究所 省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點實驗室 廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點實驗室 廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實驗室，廣東 廣州 510070；2.廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司，廣東 廣州 510663）

響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取皺蓋假芝脂溶性成分的研究*

黃紀國1，2，韓園園1，謝意珍1，2，潘鴻輝1，2**

（1.廣東省微生物研究所 省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點實驗室 廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點實驗室 廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實驗室，廣東 廣州 510070；2.廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司，廣東 廣州 510663）

為了優(yōu)化超聲輔助提取皺蓋假芝脂溶性成分的工藝。在單因素的實驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法進行實驗設(shè)計，選取料液比、提取時間、提取溫度、提取功率進行四因素三水平實驗，最終得到超聲輔助提取皺蓋假芝脂溶性成分的最佳工藝條件為：料液比36.74 mL·g－1，提取時間47.31 min，提取溫度90℃，提取功率82 W。在此條件下，提取率為8.4891%。因此超聲輔助提取工藝簡單且穩(wěn)定，是可行的提取方案。

皺蓋假芝；脂溶性成分；超聲輔助提取；

靈芝為多孔菌科真菌赤芝 [Ganoderma luicdum（Leyss.ex Fr.）Karst.]或紫芝（G.sinense Zhao，Xu et Zhang）干燥子實體[1]，具有滋補強壯、延年益壽、補氣安神等功效。目前，從靈芝中分離得到150多個化合物，如三萜類、甾醇類、揮發(fā)油、生物堿、甘露醇、呋喃衍生物等[2]。由于靈芝本身可以食用，對人體具有低毒性，并且活性成分具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、消炎抗菌以及保肝護肝等功效，毒副作用小，因此成為各種抗腫瘤、抗病毒等藥物的重要來源[3－9]。

皺蓋假芝隸屬于靈芝科假芝屬，在我國主要分布于華南和西南地區(qū)，其子實體因受損會分泌紅色的液體，又名血芝[10]。前期研究發(fā)現(xiàn)，相比其他食用菌，皺蓋假芝在抗腫瘤活性方面明顯優(yōu)于其他食用菌（包括靈芝），其中抑制腫瘤細胞繁殖及誘導(dǎo)凋亡的主要活性成分來自小分子化合物（脂溶性成分）[11]。因此提高皺蓋假芝脂溶性成分提取率，為后期開發(fā)皺蓋假芝提供科學依據(jù)具有重要的意義。

響應(yīng)面分析法（Response Surface Methodology，RSM）是一種優(yōu)化反應(yīng)條件和加工工藝參數(shù)的有效方法，廣泛應(yīng)用于化學化工、生物工程、食品工業(yè)等方面。它與正交試驗設(shè)計法不同，具有試驗周期短，求得的回歸方程精度高，能研究幾種因素間交互作用等優(yōu)點，而且超聲波輔助技術(shù)具有快速、高效、安全、產(chǎn)率高、節(jié)能、生物活性保持率高等特點[12-14]。本試驗擬在單因素試驗基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對超聲輔助提取皺蓋假芝脂溶性成分進行工藝優(yōu)化。

1 材料與儀器

AS10200BDT超聲波清洗器，添加奧特賽恩斯儀器有限公司；95%乙醇（食品級），廣東環(huán)凱微生物科技技術(shù)有限公司；科恩電子天平（ALT 160-4NM），德國科恩公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（EYEL4 SB-1100），日本東京理化器械（株）；電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-P053A），上海百典儀器設(shè)備有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 RE-3000，上海亞榮生化儀器廠；DLSB-5/20型低溫冷卻液循環(huán)泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；SHB-S循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

皺蓋假芝購自安徽大別山種植戶，并經(jīng)廣東省微生物研究所食用菌研究發(fā)展中心鑒定。

2 提取流程

稱量一定量的干燥、粉碎后皺蓋假芝子實體，加入一定量的75%食用酒精，一定的提取溫度、時間和提取功率進行成分提取，收集皺蓋假芝提取液并且過濾濃縮，干燥，即得到皺蓋假芝脂溶性成分。計算皺蓋假芝子實體脂溶性成分提取率（Y）公式如下：

式中：m為皺蓋假芝脂溶性成分的重量（g）；M為皺蓋假芝子實體的干重（g）。

3 實驗

3.1單因素試驗

在其他條件相同的情況下，分別考察提取溫度（50℃、60℃、80℃、95℃），提取時間（30 min、45 min、60 min、75 min），提取功率（50 W、70 W、90 W、100 W），料液比（15 mL·g-1、25 mL·g-1、35 mL·g-1、45 mL·g-1）四因素對皺蓋假芝子實體脂溶性成分提取率的影響。

3.2響應(yīng)曲面法試驗設(shè)計

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取四因素三個水平進行響應(yīng)面實驗，并進行皺蓋假芝子實體脂溶性成分提取工藝的研究。采用Design-Expert.8.05b（原版）軟件設(shè)計的Box-Benhnken設(shè)計方案，試驗因素水平編碼見表1。

表1 響應(yīng)面分析影響因素及水平Tab.1 RSA experiment factors and levels

以皺蓋假芝子實體脂溶性成分提取率為響應(yīng)值（Y），設(shè)計了四因素三水平的響應(yīng)分析實驗，總計29個試驗。

4 結(jié)果與討論

4.1單因素對皺蓋假芝子實體脂溶性成分提取率的影響

4.1.1 料液比對皺蓋假芝子實體脂溶性成分提取率的影響

料液比對脂溶性成分提取率的影響見圖1。

由圖1可見，相同條件下的皺蓋假芝子實體（60 min、85 W、75℃），料液比越高，皺蓋假芝子實體與溶劑的接觸面濃度差越大，滲透壓越大，脂溶性成分越容易浸出；當達到一定程度后，由于脂溶性成分含量減少，提取率逐漸趨于穩(wěn)定。當料液比35 mL·g-1時，其脂溶性成分提取率達到6.47%。

4.1.2 提取時間對皺蓋假芝子實體脂溶性成分提取率的影響

提取時間對皺蓋假芝子實體脂溶性成分提取率的影響見圖2。

圖1 料液比對提取率的影響Fig.1 Effects of solid-liquid ratio on the extraction yield

圖2 提取時間對提取率的影響Fig.2 Effects of extraction time on the extraction yield

由圖2可見，相同條件下的皺蓋假芝子實體（35∶1、75℃、85 W），提取時間越長，超聲波對子實體的作用就越充分，脂溶性成分提取越充分；當?shù)竭_一定的時間后，達到平衡，提取率趨于穩(wěn)定。提取時間為60 min，其脂溶性成分提取率達到6.65%。

4.1.3 提取溫度對皺蓋假芝子實體脂溶性成分提取率的影響

提取溫度對皺蓋假芝子實體脂溶性成分提取率的影響見圖3。

圖3 提取溫度對提取率的影響Fig.3 Effects of extraction temperature on the extraction yield

由圖3可見，相同條件下的皺蓋假芝子實體（35∶1、60 min、85 W），當提取溫度提高時，有利于脂溶性成分的浸出；由于酒精沸點為79℃，當溫度高于80℃以后，酒精蒸發(fā)出來，溶劑的極性增加，但整個料液比有所降低，因此提取率增加速度變緩。當提取溫度為80℃，皺蓋假芝的提取率達到7.076%。

4.1.4 提取功率對皺蓋假芝子實體脂溶性成分提取率的影響

提取功率對皺蓋假芝子實體脂溶性成分提取率的影響見圖4。

圖4 提取功率對提取率的影響Fig.4 Effects of extraction power on extraction power

由圖4可見，相同條件下的皺蓋假芝子實體（35∶1、60 min、75℃），超聲功率越大，空化和機械作用效果越明顯，脂溶性成分滲出的越多；當提取功率超過90 W時，反而不利于脂溶性成分的滲出。

4.2響應(yīng)面實驗結(jié)果與分析

4.2.1 響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果

以X1、X2、X3、X4為自變量，皺蓋假芝脂溶性成分的提取率為響應(yīng)值Y，利用Design-Expert.8.05b軟件，采用Box-Benhnken設(shè)計方案及結(jié)果見表2。

4.2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果方差分析

利用Design-Expert.8.05b軟件對響應(yīng)值進行回歸分析，經(jīng)回歸擬合后，各因子與響應(yīng)值的回歸方程為：Y=－29.73720＋0.27915×X1＋0.43016×X2＋0.29496×X3＋0.15853×X4－0.000938667×X1×X2－0.00209333×X1×X3＋0.0000746667×X1×X4－2.45333E－003×X2×X3－0.000459556×X2×X4－0.00066×X3×X4－0.000714347×X12-0.00144919×X22＋0.000122815×X32－0.000488074×X42。模型方差分析見表3。

模型中，如果模型項p≤0.05，說明Y與因子之間的回歸方程的關(guān)系是顯著的，如果p≤0.01，說明Y與因子之間的回歸方程的關(guān)系是極其顯著的；如果p≤0.05的項，表示該項對Y影響顯著，p≤0.01的項，表示該項對Y影響極其顯著，由方差分析結(jié)果可知，該回歸方程模型極其顯著，其中X1、X3、X2X3三項對脂溶性成分的提取率影響極其顯著；X4、X1X3、X22三項對脂溶性成分的提取率影響顯著，其他影響因子對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。

表2 Box－Behnken設(shè)計方案及試驗結(jié)果Tab.2 Box－behnken design of extraction technology and results

表3 方差分析表Tab.3 Results of extraction regression analysis

4.2.3響應(yīng)曲面及等值線分析

利用Design－Expert.8.05b軟件對表2的數(shù)據(jù)進行回歸方程擬合，建立響應(yīng)面及等高線，結(jié)果見圖5～圖10。

圖5反映的是料液比與提取時間對提取率的影響。從圖5可以看出，當料液比不變時，隨著提取時間的延長，其提取率先是逐漸增加，達到一定值之后又逐漸下降；當提取時間一定時，料液比越高，提取越充分。

圖6反映的是料液比與提取溫度對提取率的影響。從圖6可以看出，當料液比一定，提取溫度越高，其提取率越高；當溫度恒定時，料液比越大，脂溶性成分提取率也提高。

圖7反映的是料液比與提取功率對提取率的影響。從圖7可以看出，當料液比相同時，提取功率越高，提取率也越高；功率相同時，料液比越高，提取率也越高。

圖8反映的是提取時間、提取溫度與提取率三者之間的作用關(guān)系。由圖8可見，當提取溫度相同時，提取時間越長，越有利于脂溶性成分的浸出；提取時間相同時，隨著提取溫度的升高，提取率逐漸增加。

圖9反映的是提取時間與提取功率之間如何作用于提取率的。相同的時間內(nèi)，提取功率越高，其提取率也越高；當功率相同時，時間不同，提取率也不同，提取率是先逐漸增加，到達最大值后又慢慢的減小。

圖10反映的是提取溫度與提取功率對提取率的影響。當提取溫度相同，提取功率越高，其相應(yīng)的提取率也越高；當功率相同時，提取率隨著提取溫度的提高而增加。

圖5 料液比與提取時間對提取率影響的等高線和響應(yīng)面Fig.5 Responsive surfaces and contours of extraction yield Y(%)with influencing factors solid-liquid ratio(X1)and extraction time (X2)

圖6 料液比與提取溫度對提取率影響的等高線和響應(yīng)面Fig.6 Responsive surfaces and contours of extraction yield Y(%)with influencing factors solid-liquid ratio(X1)and extraction temperature(X3)

圖7 料液比與提取功率對提取率影響的等高線和響應(yīng)面Fig.7 Responsive surfaces and contours of extraction yield Y(%)with influencing factors solid-liquid ratio(X1)and extraction power(X4)

圖8 提取時間與提取溫度對提取率影響的等高線和響應(yīng)面Fig.8 Responsive surfaces and contours of extraction yield Y(%)with influencing factors extraction time(X2)and extraction temperature(X3)

圖10 提取溫度與提取功率對提取率影響的等高線和響應(yīng)面Fig.10 Responsive surfaces and contours of extraction yield Y(%)with influencing factors extraction temperature(X3)and extraction power(X4)

5 結(jié)論

通過Design-Expert.8.05b軟件分析，推算出皺蓋假芝脂溶性成分的提取最佳工藝為：料液比36.74 mL·g-1，提取時間47.31 min，提取溫度90℃，提取功率82 W，在此條件下皺蓋假芝脂溶性成分的提取率為8.49%。通過與實際情況相比較，相同工藝條件下，實際測得提取率為8.4891%，與理論預(yù)測值的相對誤差較小。因此最終確定超聲輔助提取皺蓋假芝脂溶性成分的最佳工藝條件與推算的最佳工藝條件相同。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）2010年版[Z].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：174.

[2]姜芳燕，馬軍，陳永敢，等.靈芝活性成分的研究進展[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學，2014，8（1）：137-142.

[3]張萱.靈芝活性成分的提取工藝及抗腫瘤成分的研究[D].天津：天津大學，2006.

[4]袁帶秀，侯娟.靈芝活性成分、藥理作用及其應(yīng)用[J].中國民族民間醫(yī)藥雜志，2006（2）：110-113.

[5]王敏慧.硬孔靈芝化學成分及多糖的體外抗氧化活性研究[D].福州：福建中醫(yī)藥大學，2013.

[6]潘鴻輝，謝意珍，李向敏，等.靈芝孢子對腫瘤細胞生長的抑制效果研究[J].中國食用菌，2010（5）：33-36.

[7]藺麗，方能虎，吳旦.靈芝有效成份的研究概況[J].中成藥，2002（10）：57-60.

[8]康越.靈芝的化學成分及保肝活性研究[D].延吉：延邊大學，2012.

[9]季哲.靈芝活性成分抗腫瘤作用機制的研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2007.

[10]馬海昇，李海珍姚志偉.血芝液體培養(yǎng)及條件優(yōu)化的初步研究[J].化學與生物工程，2010，27（3）：70-72.

[11]Jiao CW,Xie YZ,Yang XL,et al.Anticancer activity of A－mauroderma rude[J].PLoS One,2013,8(6):66504-66517.

[12]趙靚，趙天瑞，樊建.云南野生大紅菇多糖水提法工藝研究[J].中國食用菌，2012，31（1）：29-32.

[13]王磊，邱芳萍，王志兵，等.糞鬼傘多糖提取工藝優(yōu)化及單糖組成的研究[J].中國食用菌，2008，27（5）：38-40.

[14]劉艷君，陶鴻.作物秸稈栽培雞腿蘑的試驗研究[J].中國食用菌，1999，19（3）：12-13.

Optimization of Ultrasound-assisted Extraction Process for Fat-soluble Components from Amauroderma rude by Response Surface Analysis

HUANG Ji-guo1,2,HAN Yuan-yuan1,XIE Yi-zhen1,2,PAN Hong-hui1,2
(1.Guangdong Institute of Microbiology,State Key Laboratory of Applied Microbiology Southern China,Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application,Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology, Guangzhou 510070,China;2.Guangdong Yuewei Edible Fungi Technology Co.Ltd,Guangzhou 510663,China)

For optimizing the ultrasound－assisted extraction technology of fat－soluble components from Amauroderma rude,the impact of solid－liquid ratio,extraction time,extraction temperature and extraction power on the yield of fat－soluble components from Amauroderma rude were investigated.Through Box－Benhnken central combination design and response surface methodology,it was indication that the optimum extraction condition as follows:solid－liquid ratio 36.74 mL·g－1,extraction time 47.31 min, extraction temperature 90℃and extraction power 82 W.Under such conditions,extraction yield was up to 8.4891%and it was a feasible extraction program.

Amauroderma rude;fat－soluble components;the ultrasound－assisted extraction

S646.9

A

1003-8310（2015）03-0041-06

10.13629/j.cnki.53－1054.2015.03.011

廣東省產(chǎn)學研省部合作專項基金項目（2012B090600050）；廣東省工程技術(shù)研究開發(fā)中心建設(shè)項目（2010B080100068）。

黃紀國 （1986－），男，碩士，研究助理，主要從事食（藥）用真菌研究及開發(fā)方面工作。E－mail:huangjiguo@126.com

**通信作者：潘鴻輝 (1979－），女，博士，副研究員，主要從事食（藥）用真菌研究及開發(fā)方面工作。E－mail:phhcys@yahoo.com

2015－03－10