ELISA鑒別條件下的野生羊肚菌菌種分離方法*

肖江勇，何秀霞，王 丹，劉 歡，劉春洋，王一東

（長春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130022）

〈育種與馴化〉

ELISA鑒別條件下的野生羊肚菌菌種分離方法*

肖江勇，何秀霞，王 丹，劉 歡，劉春洋，王一東**

（長春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130022）

為了提高分離的羊肚菌菌種的可靠性，在傳統(tǒng)菌種分離的基礎(chǔ)上，增加了酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）鑒別檢驗(yàn)。對采自于吉林省吉林市的野生羊肚菌發(fā)生地的羊肚菌土壤基質(zhì)及子實(shí)體分別進(jìn)行了菌種分離，對分離得到的3株疑似羊肚菌的菌株進(jìn)行了間接酶聯(lián)免疫吸附法（間接ELISA）免疫學(xué)方法檢測，確定其中的2株純培養(yǎng)菌絲為羊肚菌菌種。

羊肚菌；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）；菌種分離

羊肚菌（Morchella）是世界知名的食用菌，屬于子囊菌亞門 （Ascomycotina）、盤菌綱 （Discomycetes）、盤菌目 （Pezizales）、羊肚菌科（Morchellaceae）、羊肚菌屬（Morchella），因其味美、稀缺、具有保健價(jià)值而受到人們的重視，具有巨大的市場價(jià)值和商業(yè)前景[1－2]。由于羊肚菌出菇所需要條件很難掌握，目前還難于實(shí)現(xiàn)完全人工栽培[3－8]。影響羊肚菌人工栽培的諸多因素中，羊肚菌菌種的分離與采用是關(guān)鍵因素之一。有效、準(zhǔn)確地分離菌種對實(shí)現(xiàn)羊肚菌的人工栽培意義重大[9]。由于出菇周期較長，不易出菇，且缺少形態(tài)學(xué)鑒別手段，這給羊肚菌菌種的鑒定造成了一定困難。目前有研究報(bào)道對羊肚菌ITS區(qū)測序來鑒定羊肚菌菌絲的方法[10－11]，這樣的檢測技術(shù)雖然精確，但操作手續(xù)繁瑣，對設(shè)備要求高，不便于廣大羊肚菌研究者及菇農(nóng)使用，本研究所采用的ELISA免疫學(xué)鑒定方法[12－14]，可彌補(bǔ)這一不足。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株、羊肚菌子實(shí)體及土壤樣本

羊肚菌（Morehella esculenta）菌株（51589號），購于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心。

毛柄金錢菌（Flammulina velutiper）菌種、黑木耳（Auricularia auricula） 菌種，購于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)菌物研究所。

野生羊肚菌子實(shí)體及其發(fā)生地土壤樣本，2012年5月采自于吉林市松花湖地區(qū)，現(xiàn)保存于本實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑

HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG（H+I），購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司；TMB，Sigma公司產(chǎn)品；培養(yǎng)基，用于普通真菌菌絲培養(yǎng)的馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）；抗羊肚菌單克隆抗體（W8C9株腹水），長春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院制備并保存于該實(shí)驗(yàn)室[15]。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備

HZQ-QX型恒溫振蕩培養(yǎng)箱、MDF-192型低溫冰箱，SANYO公司；ELx800TM酶標(biāo)儀，美國伯騰儀器有限公司，等。

1.2方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)羊肚菌菌絲的培養(yǎng)及標(biāo)準(zhǔn)抗原的制備

將51589號羊肚菌菌種在無菌條件下轉(zhuǎn)接到PDA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速110 r·min-1、溫度23.5℃。3 d后在無菌條件下挑取少量培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至PDA固體平皿中進(jìn)行培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)，鏡下觀察菌絲形態(tài)。

對上述PDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的菌絲球進(jìn)行離心收集，將收集的菌絲放入研缽中，加適量的滅菌海砂及pH7.4的磷酸鹽緩沖液（以下簡稱PBS），進(jìn)行充分研磨破碎，收集研磨后液體進(jìn)行離心，5 000 r·min-1離心5 min，離心上清液即為羊肚菌抗原原液。用同樣的方法制備金針菇及木耳抗原液。

1.2.2 ELISA間接法檢測羊肚菌抗原方法的建立

包被：將羊肚菌抗原原液用0.05 mol·L-1pH9.6的碳酸鹽包被緩沖液進(jìn)行適量稀釋，在酶標(biāo)板每孔中加入0.1 mL，4℃包被過夜，棄去孔內(nèi)溶液，用含有吐溫20的PBS（以下簡稱PBS-T）洗滌緩沖液浸泡、沖洗3次，3 min·次-1。同時(shí)做金針菇、木耳及空白包被對照。

將抗羊肚菌單克隆抗體W8C9使用PBS進(jìn)行適量稀釋（一抗），于上述已包被的反應(yīng)孔中每孔加0.1 mL，置于37℃溫育1 h，PBS-T洗滌4次，3 min·次-1。

將HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG用PBS稀釋3 000倍（二抗），于每個(gè)反應(yīng)孔中加入0.1 mL，37℃溫育50 min，PBS-T洗滌4次，3 min·次-1。

在各反應(yīng)孔中加入現(xiàn)配的底物TMB顯色液0.1 mL，室溫下避光反應(yīng)10 min。

終止反應(yīng)，在各個(gè)孔中加入0.05 mL 2 mol·L-1的硫酸。

結(jié)果檢測，利用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處OD值。

1.2.3 野生羊肚菌菌種分離

（1）土壤基質(zhì)菌種分離法

將土壤基質(zhì)樣本用無菌生理鹽水按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀釋度，稀釋成土壤樣本懸液，無菌條件下用無菌移液器分別由上述稀釋液中各吸取0.1 mL，加入到已標(biāo)記好稀釋度的固體PDA平皿中進(jìn)行涂布；挑取10-1的土壤懸液，直接在平皿上進(jìn)行劃線分離，室溫下避光進(jìn)行培養(yǎng)，觀察。

（2）子實(shí)體孢子分離法

用新鮮羊肚菌子實(shí)體，在無菌條件下收集羊肚菌孢子，將收集的孢子制成孢子懸液并鏡檢，并用無菌移液器吸取孢子液0.1 mL加入到平皿培養(yǎng)基中進(jìn)行涂布，室溫下避光培養(yǎng)，觀察。

（3）分離疑似羊肚菌菌落

無菌挑取上述平皿上疑似羊肚菌的白色菌落進(jìn)行顯微檢查，將疑似羊肚菌的菌落做好標(biāo)記后，分離培養(yǎng)并接種至PDA液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，收集培養(yǎng)物，參照標(biāo)準(zhǔn)抗原的處理方法，按標(biāo)號制備成待檢抗原。

1.2.4 ELISA間接法檢測分離菌株

按方法1.2.2，將待檢抗原替代標(biāo)準(zhǔn)羊肚菌抗原進(jìn)行包被，其他步驟相同。檢測待檢樣品的OD值，以P/N比（樣本與陰性對照的OD值比值）≥2.1為陽性，＜2.1為陰性。

1.2.5 菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)與保存

將經(jīng)過常規(guī)菌種分離得到的疑似羊肚菌菌種，經(jīng)ELISA檢測，結(jié)果為陽性的菌株確定為分離得到的羊肚菌菌種。按編號接種至試管斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，待菌絲長出后，作為分離得到的羊肚菌菌種，轉(zhuǎn)到4℃進(jìn)行保存。

2 結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)羊肚菌菌絲形態(tài)

PDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d開始形成菌絲球，初期為乳白色，此時(shí)培養(yǎng)液較為澄清，其菌絲在顯微鏡下為絲狀體形態(tài)，具有隔膜，分枝較多，胞內(nèi)的細(xì)胞器清晰可見。隨著培養(yǎng)時(shí)間的加長，菌絲球逐漸增大，顏色變暗。

PDA固體平皿培養(yǎng)3 d開始出現(xiàn)白色菌落，7 d后菌絲長滿。顯微鏡下可見氣生菌絲相對營養(yǎng)菌絲較細(xì)，隔膜不明顯，胞內(nèi)細(xì)胞器亦清晰可見。

2.2ELISA間接法檢測標(biāo)準(zhǔn)羊肚菌抗原方法的建立

采用ELISA間接法分別對標(biāo)準(zhǔn)羊肚菌抗原、木耳及金針菇進(jìn)行檢測，以P/N比≥2.1判定為陽性，結(jié)果見表1。

表1 ELISA間接法檢測標(biāo)準(zhǔn)羊肚菌抗原結(jié)果Tab.1 The results of morel antigen detection by indirect ELISA

由表1可以看出，標(biāo)準(zhǔn)羊肚菌抗原經(jīng)ELISA間接法檢測后，顯示出相對較高的陽性（以P/N＞2.1為陽性），金針菇、木耳經(jīng)過同濃度包被，其OD值與陰性對照相比（P/N比）的值遠(yuǎn)小于2.1，可見單抗W8C9與木耳、金針菇等食用菌之間沒有交叉反應(yīng)。經(jīng)過多次檢測，結(jié)果均表現(xiàn)較好的重復(fù)性。

2.3菌種分離結(jié)果

參照羊肚菌平皿菌落及菌絲顯微形態(tài)，分離得到3個(gè)疑似羊肚菌菌絲的菌株，分別編號T-01、T-02、B-01。按照標(biāo)準(zhǔn)羊肚菌抗原的處理方法，處理得到3個(gè)對應(yīng)編號的待檢抗原，4℃保存。

2.4ELISA間接法鑒定分離菌株

采用ELISA間接法對分離的菌株進(jìn)行檢測，以P/N比≥2.1判定為陽性，檢測結(jié)果見表2。

由表2可見，以標(biāo)準(zhǔn)羊肚菌抗原為陽性對照，抗原空白包被為陰性對照進(jìn)行了ELISA間接法檢測，檢測結(jié)果顯示T-01、B-01為陽性，T-02、金針菇、木耳為陰性（以P/N＞2.1為陽性）。經(jīng)過多次檢測，結(jié)果均表現(xiàn)出較好的重復(fù)性，確定T-01、B-01為羊肚菌菌絲。對分離得到的T-01、B-01羊肚菌菌株進(jìn)行菌種擴(kuò)大，保存。

表2 ELISA間接法檢測分離菌株檢測結(jié)果Tab.2 The results of isolated stains detection by indirect ELISA

3 討論

與傳統(tǒng)的擔(dān)子菌食用菌菌種分離不同，由于羊肚菌還不能實(shí)現(xiàn)完全人工栽培，不易通過栽培出菇的形態(tài)學(xué)方法對分離的菌種進(jìn)行鑒定，因此對其菌種的分離鑒定就顯得尤為困難。本研究對野生羊肚菌樣本材料進(jìn)行常規(guī)菌種分離，對分離得到的疑似菌株進(jìn)行免疫學(xué)方法檢測，排除了無羊肚菌特異性抗原的疑似菌株，確定了2株含有羊肚菌特異性抗原的純培養(yǎng)物為羊肚菌菌種。

本研究所用的W8C9株單克隆抗體，是以51589號羊肚菌菌種為抗原，經(jīng)細(xì)胞融合篩選得到的單克隆雜交瘤細(xì)胞株制得，對該單克隆抗體進(jìn)行多次該單抗與其他羊肚菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（51536#、51537#）及近10種常見食用菌菌絲抗原交叉試驗(yàn)，檢測結(jié)果表明該單抗對標(biāo)準(zhǔn)羊肚菌菌絲及采集的羊肚菌子實(shí)體樣本表現(xiàn)出良好的特異性結(jié)合、與其他食用菌不結(jié)合。本實(shí)驗(yàn)中表1即為特異性檢驗(yàn)的結(jié)果。

與常規(guī)檢測抗原的雙抗體夾心ELISA法相比，間接ELISA法在檢測少量抗原樣本時(shí)具有方法簡單、影響因素少、成本低、快速的特點(diǎn)，故本研究采用間接ELISA法進(jìn)行羊肚菌菌絲的鑒別檢測。

本研究方法的建立，為羊肚菌菌種的快速鑒別提供了一個(gè)可行的參考方法，同時(shí)也為更加便捷快速的羊肚菌金標(biāo)檢測試紙條、ELISA快速定量檢測試劑盒等免疫學(xué)方法的建立提供實(shí)驗(yàn)參考。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)從羊肚菌子實(shí)體孢子分離得到的羊肚菌菌絲，在固體培養(yǎng)基培養(yǎng)初期菌絲為白色，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，其菌絲連同培養(yǎng)基顏色轉(zhuǎn)變?yōu)楹稚?，與有關(guān)研究報(bào)道相符；但購買的標(biāo)準(zhǔn)羊肚菌菌絲和羊肚菌基質(zhì)土壤分離得到的菌絲，在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)始終呈現(xiàn)為白色，引起這種差別的原因，有待進(jìn)一步探討。

在實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，無論是標(biāo)準(zhǔn)羊肚菌菌種還是經(jīng)分離鑒定為羊肚菌的菌種，其在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)及處理得到的抗原過程中，均散發(fā)著一股獨(dú)特的清香氣味，這可能與羊肚菌分泌的揮發(fā)性氨基酸有關(guān)。這種現(xiàn)象可否作為實(shí)際工作中羊肚菌菌絲的快速鑒定指標(biāo)之一還有待驗(yàn)證。

[1]朱林，程顯好，田吉騰.羊肚菌的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（10）：4054-4057.

[2]謝占玲，謝占青.羊肚菌研究綜述[J].青海大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007，25（2）：36-40.

[3]朱斗錫.羊肚菌人工栽培研究進(jìn)展[J].中國食用菌，2008，27（4）：3-5.

[4]李華，包海鷹，李玉.羊肚菌研究進(jìn)展[J].菌物研究，2004，2（4）：53-60.

[5]Brock TD.Studies on culture of Morchella[J].Mycologia，1951（43）：402-422.

[6]馬向東.食用菌栽培新技術(shù)[M].開封：河南大學(xué)出版社，2002：270.

[7]Ower R.Notes on the development of the morel aseoea RP：Morchella esculenta[J].Myeologia,1982,74(1):35-38.

[8]戴玉淑，徐方杰，趙艷春.羊肚菌的栽培技術(shù)[J].中國農(nóng)村小康科技，2008（3）：40-41.

[9]王廣耀，蔣曉成，程喆.羊肚菌菌種分離及母種培養(yǎng)基的篩選[J].食用菌，2009（9）：211-214.

[10]沈洪，陳明杰，趙永昌，等.云南羊肚菌rDNA的ITS序列與親緣關(guān)系分析[J].食用菌學(xué)報(bào)，2007，14（2）：15-18.

[11]Daniel Wipe,JC Munch,B Botton,etc.DNA polymorphism in morels:complete sequences of the internal transcribed spacer of genes coding for rRNA in Morchella esculenta (Yellow Morel) and Morchella conica (Black Morel)[J]. Applied And Environmental Microbiology,1996:3541-3543.

[12]田雪，劉建，孫樺男，等.以羊肚菌茵絲為抗原的不同免疫程序?qū)alb/c鼠抗體水平的影響[J].長春理工大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2012，35（1）：156-160.

[13]于秋麗，趙曉娥，胡林勇，等.間接EILSA法檢測羊促乳素抗體方法的建立[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，37（2）：48-50．

[14]馬帥，陳華林，王雅文，等.免疫酶染色法對羊肚菌菌絲特異性靶位的初步定位與分析[J].菌物研究，2014，12（6）：115-118.

[15]王一東，劉建.一株抗羊肚菌單克隆抗體及其制備方法：中國，200910218152.8[P].2010-06-09.

云南：昆明食用菌研究所努力促進(jìn)產(chǎn)業(yè)升級轉(zhuǎn)型

據(jù)悉，昆明食用菌研究所多舉措服務(wù)于特色食用菌產(chǎn)業(yè)的“最后一公里”，為云南高原特色食用菌產(chǎn)業(yè)升級轉(zhuǎn)型發(fā)展夯實(shí)了基礎(chǔ)。

據(jù)了解，該研究所先后構(gòu)建完善食用菌技術(shù)支撐研發(fā)平臺4個(gè)，改造建設(shè)食用菌資源庫、優(yōu)良菌種選育、精深加工和新產(chǎn)品開發(fā)、檢驗(yàn)檢測服務(wù)等實(shí)驗(yàn)室400多平方米，配套購置儀器19件（臺）。并建立4個(gè)首席科學(xué)家牽頭的技術(shù)服務(wù)團(tuán)隊(duì)，設(shè)立5個(gè)專家工作站和技術(shù)服務(wù)組，選派5組10個(gè)科技特派員，開展包括人工栽培食用菌、食用菌精深加工、羊肚菌原生境擴(kuò)繁促產(chǎn)、野生食用菌保護(hù)利用、人工食用菌高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培5個(gè)方面的技術(shù)指導(dǎo)、培訓(xùn)及技術(shù)服務(wù)。

同時(shí)，該研究所還建設(shè)了培育食用菌良種繁育及新品種（菌種）栽培、食用菌標(biāo)準(zhǔn)化栽培、食用菌精深加工等3個(gè)示范基地，在昆明雙龍、馬龍等地改造大棚33 000多平方米；在昆明雙龍、永勝、馬龍、保山施甸等地建立香菇、平菇、木耳、金針菇、雙孢菇等栽培示范基地15個(gè)，示范面積60多萬平方米，生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菇逾2 200 t；在野生食用菌主產(chǎn)區(qū)，建立松茸、羊肚菌、牛肝菌、大紅菇等野生食用菌保護(hù)培育及擴(kuò)繁基地13個(gè)，面積超過8 400畝。

此外，該研究所還篩選了食用菌良種19個(gè)：黑木耳良種3個(gè)、香菇良種7個(gè)、茶樹菇良種6個(gè)、平菇良種1個(gè)、金針菇良種1個(gè)、金耳優(yōu)良菌種1個(gè)；建立了食用菌良種繁育生產(chǎn)線1條，年產(chǎn)300萬瓶（袋）以上，完成優(yōu)良菌種制種200萬瓶（袋），示范良種配套栽培20萬平方米。同時(shí)，還開展了食用菌精深加工研發(fā)示范，研發(fā)產(chǎn)品42個(gè)，共計(jì)生產(chǎn)5 050 t。研究所還制（修）食用菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程5項(xiàng)，食用菌標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程6個(gè)，企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)3項(xiàng)，通過標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施服務(wù)菇農(nóng)2 0000多人次。

中國食用菌信息網(wǎng)

2015.04.30

The Methods of Vegetative Mycelium Isolated from Wild Morchella under the Identification of ELISA

XIAO Jiang-yong,HE Xiu-xia,WANG Dan,LIU Huan,LIU Chun-yang,WANG Yi-dong
（Changchun University of Science and Technology,School of Life Science and Technology,Changchun 130022,China）

In order to improve the dependance of strains isolation from the Morchella,the ELISA was added to identification on the basis of traditional strains separation.Isolating strains from fruit body and the soil collected from Jilin.Three strains that were similar to Morchella hyphae have been got.The uncertain isolated strains were detected by the way of ELISA.Two of them were proved to be Morchella.

Morel;Enzyme－linked immunosorbent(ELISA);strains isolation

S646.9

A

1003-8310（2015）03-0011-04

10.13629/j.cnki.53－1054.2015.03.003

長春理工大學(xué)“大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目”（2012S46、2013x108）。

肖江勇（1990－），男，本科，研發(fā)工程師，主要從事珍稀食藥用真菌栽培研究。E－mail:XJY_job5983@163.com

**通信作者：王一東（1962－）男，本科，高級實(shí)驗(yàn)師，主要從事食品與衛(wèi)生檢驗(yàn)研究。E－mail:wyd@cust.edu.cn

2015－03－10