骨橋蛋白OPN在哺乳動物生殖上的作用及在生豬生產(chǎn)應(yīng)用上的展望

葉 超，陳志林，馮美瑩，衛(wèi)恒習(xí)，張守全

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣州 510642）

骨橋蛋白OPN在哺乳動物生殖上的作用及在生豬生產(chǎn)應(yīng)用上的展望

葉 超，陳志林，馮美瑩，衛(wèi)恒習(xí)，張守全

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣州 510642）

骨橋蛋白(osteopontion，OPN)是細(xì)胞外基質(zhì)中的一種分泌性糖基類酸性蛋白質(zhì)，富含天冬氨酸、谷氨酸和絲氨酸。有研究表明，骨橋蛋白在雌性、雄性哺乳動物生殖系統(tǒng)中廣泛表達(dá)，與哺乳動物的生殖機(jī)能息息相關(guān)。它不僅影響子宮內(nèi)膜容受性的建立、胚胎的著床，且在精卵融合過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。就OPN在哺乳動物生殖上的相關(guān)作用和機(jī)理進(jìn)行了綜述，并對該蛋白今后在生豬生產(chǎn)上的應(yīng)用進(jìn)行展望。

骨橋蛋白；精卵融合；胚胎著床；子宮內(nèi)膜容受性建立

1 OPN與雄性哺乳動物生殖

骨橋蛋白相對分子質(zhì)量大小在25KD～80KD。它于1979年被Senger首次發(fā)現(xiàn)，在而后的幾十年國內(nèi)外學(xué)者相繼在骨、肺、肝、膀胱、乳腺、睪丸、骨髓和蛻膜等組織結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)這種蛋白質(zhì)。最近的研究結(jié)果表明該蛋白質(zhì)參與腫瘤惡化、骨基質(zhì)的礦化和吸收、組織創(chuàng)傷修復(fù)等生理過程，且在心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及泌尿系統(tǒng)中扮演著重要的角色。骨橋蛋白是機(jī)體內(nèi)多種組織細(xì)胞均能合成并分泌的一種重要的分泌性細(xì)胞因子，其作為細(xì)胞外基質(zhì)中的一種重要的非膠原蛋白，具有多種生理作用。目前研究發(fā)現(xiàn)，OPN蛋白在哺乳動物生殖系統(tǒng)中廣泛存在，與雄性哺乳動物的生殖機(jī)能息息相關(guān)。

1.1 OPN在雄性哺乳動物生殖系統(tǒng)中的分布與表達(dá)

Killian等人[1]通過應(yīng)用雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù)，在具有高繁殖性能的荷斯坦公牛個體精清上發(fā)現(xiàn)了OPN，并初步確定OPN于荷斯坦公牛的繁殖性能有關(guān)；隨后，Hammerstedt等人[2]通過雙向電泳蛋白質(zhì)圖譜比對分析，最終確定OPN是一種與受精能力有關(guān)的蛋白。另外，OPN蛋白通過免疫印跡的方法在對馬的研究上，也確定了OPN與馬的繁殖力有關(guān)[3]。

Luedtke等人[4]應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)，大鼠從出生開始一直到發(fā)育成熟，其睪丸、附睪、輸精管均有OPN蛋白表達(dá)。而且在睪丸組織中，OPN主要表達(dá)于精原細(xì)胞至早粗線期的精母細(xì)胞中；在附睪中，OPN主要在無纖毛細(xì)胞中表達(dá)；在附睪中，OPN蛋白的表達(dá)顯現(xiàn)出特定區(qū)域性及特定細(xì)胞性。相比之下，公牛的OPN蛋白最早發(fā)現(xiàn)于牛精液中。隨后有學(xué)者通過Western印跡的方法，分別在精囊、輸精管壺腹部檢測到OPN的表達(dá)，由于得到的OPN 分子質(zhì)量與精清中的OPN 分子質(zhì)量一致，故認(rèn)為精清中的OPN可能來源于精囊或者輸精管壺腹部[4]。Novak S[5]等人研究發(fā)現(xiàn)公豬的生殖系統(tǒng)內(nèi)亦有OPN蛋白的表達(dá)。Taekyun Shin等人[6]用兔抗人OPN抗體對豬睪丸進(jìn)行Western Blot檢測后，發(fā)現(xiàn)在1日齡的公豬睪丸上只存在66kD的OPN蛋白，在6月齡的公豬睪丸上分別存在32kD和66kD的2條OPN蛋白帶，同時通過免疫組織化學(xué)檢測后，發(fā)現(xiàn)不同階段的精母細(xì)胞上存在OPN，在支持細(xì)胞上也有少量的OPN表達(dá)，然而晚期精子細(xì)胞和成熟的精子細(xì)胞上卻沒有發(fā)現(xiàn)OPN的表達(dá)，這些發(fā)現(xiàn)暗示著OPN能在大多數(shù)的生殖細(xì)胞上檢測到，且OPN可能參與精子的發(fā)生與形成過程。Souza等人[7]通過免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，在狗的生殖系統(tǒng)上也發(fā)現(xiàn)了OPN蛋白的表達(dá)。

綜上所述，OPN廣泛表達(dá)于雄性哺乳動物生殖系統(tǒng)中，如睪丸、附睪、前列腺、輸精管等。但OPN蛋白的表達(dá)量因動物種屬、動物個體甚至相同個體不同時期而不同。根據(jù)目前的研究數(shù)據(jù)顯示，OPN蛋白的表達(dá)量與哺乳動物的繁殖力密切相關(guān)，但其中的具體分子機(jī)制尚需深入研究。

1.2 OPN對哺乳動物精子受精的影響

OPN蛋白含有精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)序列，該序列在不同物種的OPN中普遍存在，對OPN發(fā)揮黏附功能起著至關(guān)重要的作用。RGD序列為高度保守的特異性細(xì)胞黏附功能閾，該序列可特異性地與細(xì)胞表面整合素受體 αvβ、αvβ3、 αvβ5、β3等結(jié)合，參與糖蛋白與細(xì)胞間的黏附過程，引起局部黏附，改變細(xì)胞骨架，促進(jìn)細(xì)胞遷移。RGD序列具有高度保守性，一旦變異或缺失將喪失其促黏附的功能[8，9]。

受精對個體的遺傳基因傳遞起著至關(guān)重要的作用，同時也預(yù)示著一個新生命的誕生。在哺乳動物中，受精起始于精子與卵子的直接相互作用，這個過程由一系列的四旋蛋白、整合素、解離素和金屬蛋白起著調(diào)控作用。而卵子上的整合素很有可能與精子OPN發(fā)生結(jié)合[10]，從而介導(dǎo)精卵融合(圖1)。但具體的精卵融合機(jī)理目前還沒有研究透徹。

圖1 骨橋蛋白OPN在受精過程中的作用

精卵融合受精是哺乳動物發(fā)育的基礎(chǔ)，有活力的精子是受精的先決條件。在精子的運(yùn)動、獲能、受精、與卵子的融合、以及后期的胚胎發(fā)育等過程中，精子上的蛋白質(zhì)起著至關(guān)重要的作用。如果精子上的某些蛋白缺失可造成人類生育能力下降甚至是不育[11]。根據(jù)已有的數(shù)據(jù)顯示OPN蛋白與精子的活力、畸形率等息息相關(guān)。Killian等人通過抗牛OPN抗體進(jìn)行對牛的體外受精實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，被抗牛OPN抗體作用以后的精子與卵子，體外受精能力顯著下降，這說明了OPN可能介導(dǎo)了牛精子和卵子的融合過程[12]。此外OPN在減少多精入卵上也發(fā)揮著重要的作用，Erikson等人[13]通過體外受精實(shí)驗(yàn)，在受精體系中加入OPN抗體后發(fā)現(xiàn)，精子受精率明顯降低，但多精入卵率則顯著升高。這點(diǎn)和Hao等人[14]的研究結(jié)果一致。

2 OPN在雌性哺乳動物生殖上的作用

2.1 輸卵管中的OPN

輸卵管內(nèi)連子宮，外接卵巢。眾所周知輸卵管在精子獲能、卵子受精、受精卵輸送及早期胚胎發(fā)育中發(fā)揮著不可替代的作用。哺乳動物受精時，精子和卵子分別從相反的方向進(jìn)入輸卵管壺腹部，并在此完成受精過程，而在此過程中輸卵管為受精過程提供適宜的環(huán)境。受精卵繼續(xù)停留在輸卵管內(nèi)發(fā)育分裂，直至子宮內(nèi)膜及子宮肌層已成熟而變得宜于受精卵著床之時，始由輸卵管進(jìn)入子宮腔[15]。

輸卵管上皮細(xì)胞分泌物、輸卵管血管滲透液、少許的腹腔液和子宮液等等構(gòu)成了輸卵管管液的主要成分。輸卵管管液促進(jìn)精子和卵子的進(jìn)一步成熟、卵子受精、受精卵的早期發(fā)育與運(yùn)輸?shù)冗^程。根據(jù)現(xiàn)有的資料顯示，輸卵管管液中存在著OPN蛋白[16]。Luedtke等人[4]2002年報道稱OPN蛋白在不影響精子活力及存活率的前提下，參與調(diào)節(jié)精子獲能過程及頂體反應(yīng)， 從而保證了精子在與卵子接觸前具有正常的受精能力。研究發(fā)現(xiàn)一定濃度的OPN蛋白促進(jìn)精子獲能、卵子受精及早期受精卵的卵裂[17，18]。但到目前為止，仍沒有其他文獻(xiàn)報道，OPN在精子獲能、卵子受精等生理過程中的具體機(jī)制。

2.2 OPN參與子宮內(nèi)膜容受性的建立

子宮內(nèi)膜容受性是指內(nèi)膜對胚胎的接受能力。在哺乳動物生殖中，只有處在一定發(fā)育階段的胚泡與特定功能狀態(tài)的子宮內(nèi)膜接觸才能植入，而這兩特定的同步階段稱為內(nèi)膜種植窗。根據(jù)生殖醫(yī)學(xué)資料，內(nèi)膜種植窗是受精卵定位、黏附和著床的必要條件[19，20]。通過免疫組化法研究發(fā)現(xiàn)整合素αvβ3 特異性地表達(dá)于內(nèi)膜 的種植窗， 是目前公認(rèn)的內(nèi)膜容受性的標(biāo)志蛋白。而整合素αvβ3正是OPN蛋白的一種受體。此外子宮內(nèi)膜基因表達(dá)的檢測結(jié)果也顯示，子宮內(nèi)膜植入窗期OPN蛋白的表達(dá)量顯著增加[21]。這似乎預(yù)示著，OPN蛋白參與了子宮內(nèi)膜容受性建立的過程。

在人和綿羊體內(nèi)，OPN是子宮上皮腺分泌物，黏附于上皮細(xì)胞表面及孕體滋養(yǎng)層。并且是圍種植入期維持妊娠的關(guān)鍵因素。在整個妊娠期，OPN蛋白對于胚胎與胎盤之間的細(xì)胞間的黏附、信號傳導(dǎo)、遷移移動具有非常重要的作用。Greg等人[22]研究發(fā)現(xiàn)，在綿羊妊娠25～120 d這段時間OPN及其mRNA在綿羊子宮內(nèi)的表達(dá)量發(fā)生顯著變化。而在妊娠40～80 d，來源于子宮腺上皮的OPN在子宮內(nèi)膜上的表達(dá)量增長了30倍。此外研究發(fā)現(xiàn)，在整個妊娠過程中僅分子質(zhì)量為45kD的OPN連續(xù)大量表達(dá)于內(nèi)膜腺上皮、孕體滋養(yǎng)層以及子宮-胎盤的接觸面上。據(jù)目前的研究顯示，45kD OPN在誘導(dǎo)細(xì)胞之間相互黏附和細(xì)胞遷移上要較其他分子量的OPN作用更強(qiáng)。

2.3 OPN對胚胎著床的作用

妊娠是一個十分復(fù)雜的過程，大致可以分為胚胎的著床與胚胎的發(fā)育。胚胎的著床過程中，OPN不僅作為細(xì)胞因子，還充當(dāng)黏附因子的作用，對胚胎著床起著至關(guān)重要的作用。OPN主要是通過RGD序列與整合素等多種受體結(jié)合，參與細(xì)胞的黏附和遷移。OPN在哺乳動物的母-胚胎界面持續(xù)表達(dá)，充當(dāng)類似于母體胎盤間的介質(zhì)。雖然具體分子機(jī)制目前暫未清楚，但普遍學(xué)者認(rèn)為，OPN在調(diào)節(jié)胚胎著床等方面的作用不可置否，極可能是胚胎-子宮微環(huán)境的重要組成部分，且參與了胎盤的形成過程，而且對于胚胎的發(fā)育成熟起著促進(jìn)作用[23]。另外，在子宮內(nèi)膜和胚胎上，OPN主要與它的受體αvβ3結(jié)合，造成了細(xì)胞黏附和遷移行為的開啟。OPN基因及蛋白在早孕小鼠子宮內(nèi)膜的動態(tài)表達(dá)規(guī)律及在子宮內(nèi)膜的分布變化暗示了OPN參與胚泡著床的黏附過程。有OPN在妊娠中后期小鼠胎盤的表達(dá)和分布提示，OPN可能是影響子宮-胚胎微環(huán)境的重要組成部分，參與了胎盤形成，促進(jìn)了胚胎發(fā)育成熟[24]。

總之，OPN在哺乳動物妊娠過程中主要存在以下3方面的作用：首先，在整個孕期，是影響子宮－胚胎界面細(xì)胞黏附和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的組織營養(yǎng)物質(zhì)的成分；其次是子宮內(nèi)膜和滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)的產(chǎn)物，引起與胚胎侵襲相關(guān)的蛻膜化改變；最后是OPN蛋白長期在子宮和胚胎免疫細(xì)胞表達(dá)，且調(diào)控與其相關(guān)功能的細(xì)胞因子，促進(jìn)小鼠胚胎的正常發(fā)育，維持妊娠過程[25]。

3 OPN在生豬生產(chǎn)中應(yīng)用的展望

綜上可知，OPN蛋白無論是在雄性哺乳動物還是雌性哺乳動物的生殖系統(tǒng)中都是普遍存在的，且廣泛參與了整個生殖過程。雖然目前已經(jīng)有了大量的證據(jù)證明這一點(diǎn)，但是其中的大部分的分子機(jī)制到目前還不是很清楚。研究OPN蛋白與哺乳動物生殖的關(guān)系，在人類醫(yī)學(xué)方面有助于理解人類受精過程， 有助于提高輔助生殖技術(shù)的受精率和妊娠率， 減少并發(fā)癥 ( 如多胎妊娠) 發(fā)生。

在畜牧學(xué)方面，目前有學(xué)者認(rèn)為，高繁殖力公畜與低繁殖力公畜的精液里OPN蛋白含量存在顯著性差異，但目前還沒有直接的證據(jù)證明，本實(shí)驗(yàn)室目前正在研究OPN蛋白與公豬繁殖力的相關(guān)聯(lián)系及其中的具體的分子機(jī)制。眾所周知，目前生豬生產(chǎn)中普遍采用人工授精的方式，人工授精這種技術(shù)的應(yīng)用就決定了公豬精液品質(zhì)對整個生豬生產(chǎn)中起到至關(guān)重要作用，它在很大程度上影響了豬場的生產(chǎn)成績。目前在人工授精前，一般豬場會采用肉眼觀察結(jié)合顯微鏡下觀察的方式綜合評定精液品質(zhì)，具體指標(biāo)有精液的顏色、氣味，以及精子活力，畸形率等。但是即使在這些指標(biāo)都正常的情況下，各個公豬的生產(chǎn)成績也是參差不齊。目前的資料顯示OPN等蛋白對精卵融合，受精過程中產(chǎn)生至關(guān)重要的影響。如果通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，公豬精液中OPN蛋白的含量和公豬的繁殖力有直接的相關(guān)性，我們就可以做成一種簡易檢測試劑盒，在豬場人工授精前，通過這種試劑盒檢測精液中OPN蛋白的含量高低，繼而得出該精液品質(zhì)的好壞。通過這樣的方式，將會極大地提高豬場的生產(chǎn)成績，給生豬生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益。

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2015-06-11）

國家杰出青年科學(xué)基金。通訊作者：張守全。