BolSDG8 RNA干擾載體構(gòu)建和擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化

常 誠，姜 玲，阮 穎 (湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙 410128)

開花是植物生長發(fā)育的重要環(huán)節(jié)，植物的花期對于植物維持正常的生命周期具有重要意義。研究表明，植物開花至少受到5條主要途徑調(diào)控:光周期途徑、春化作用途徑、GA途徑、自主途徑和表觀遺傳調(diào)控途徑。組蛋白甲基化修飾作為重要的表觀遺傳調(diào)控方式，積極參與到植物開花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中。擬南芥SDG8(SET DOMAIN GROUP 8)編碼的組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶是酵母SET2的同源物［1－2］，包含約1 806個(gè)氨基酸序列，其中含一個(gè)CW(cysteine and tryptophan conserved)結(jié)構(gòu)域、一個(gè)AWS(Associated With SET)結(jié)構(gòu)域、一個(gè)SET結(jié)構(gòu)域和一個(gè)Post SET結(jié)構(gòu)域［3］，能特異性地催化組蛋白H3第36位賴氨酸(H3K36)發(fā)生雙、三甲基化修飾。功能缺失的擬南芥sdg8突變體，其植株表現(xiàn)為弱小、早花，而究其早花原因，是由于其H3K36的雙、三甲基化水平顯著降低，開花關(guān)鍵基因FLC轉(zhuǎn)錄受到抑制，進(jìn)而使植株表現(xiàn)為早花。因此，擬南芥SDG8介導(dǎo)的H3K36甲基化在抑制植物早花過程中起著重要作用。

甘藍(lán)BolSDG8是擬南芥SDG8的同源基因。生物信息學(xué)分析表明，BolSDG8全長cDNA為5 088 bp，編碼1 696個(gè)氨基酸，與擬南芥SDG8氨基酸序列的同源性達(dá)到87%，也包含一個(gè)CW結(jié)構(gòu)域、一個(gè)AWS結(jié)構(gòu)域、一個(gè)SET結(jié)構(gòu)域和一個(gè)Post SET結(jié)構(gòu)域。因此，筆者通過構(gòu)建BolSDG8 RNA干擾載體和浸花法轉(zhuǎn)化至野生型擬南芥(Col-0)，檢測來自甘藍(lán)BolSDG8基因的片段能否有效沉默擬南芥SDG8的功能［4］，進(jìn)而研究甘藍(lán)BolSDG8與擬南芥SDG8在調(diào)控植物開花上是否具有相似的生物學(xué)功能，為深入研究BolSDG8的功能奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為培育適當(dāng)早花早熟的甘藍(lán)型油菜品種［5］提供理論參考。

1 材料與方法

1．1 材料 擬南芥哥倫比亞生態(tài)型Col-0和突變體sdg8-2;大腸桿菌(E．coli)DH5α;根癌農(nóng)桿菌GV3101;載體pMD-19 T vector和pFGC5941，均由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物發(fā)育與表觀遺傳調(diào)控實(shí)驗(yàn)室提供。

1．2 方法

1．2．1 甘藍(lán)BolSDG8-RNAi的克隆。通過比對擬南芥SDG8與甘藍(lán)BolSDG8cDNA序列，選擇一段約359 bp的保守序列，命名為BolSDG8-RNAi，設(shè)計(jì)引物序列:BolSDG8-RNAi F:5'-GGCGCGCCGGATCCAAGATTCCTTCCCCACTTTCGTCAT-3'(AscI/BamHI)BolSDG8-RNAi R，5'-CCATGGTCTAGATTCATGACACTGAATGGGAATGAGG-3'(NcoI/XbaI)。

采用高保真酶PCR擴(kuò)增后，獲得目的片段。對其回收并連接至pMDl9-T載體，命名為pMDl9-T-BolSDG8-RNAi，經(jīng)熱激法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，挑選陽性單菌落送至公司測序。

1．2．2 RNAi干擾載體的構(gòu)建。首先使用BamH I和Xba I雙酶切載體pMDl9-T-BolSDG8-RNAi和pFGC5941(圖1)，將BolSDG8-RNAi反向插至查爾酮內(nèi)含子與終止子之間，獲得載體p-BolSDG8-RNAi;然后使用Asc I和Nco I雙酶切載體pMDl9-T-BolSDG8-l和p-BolSDG8-RNAi，將目的片段正向插至35 S啟動子與查爾酮內(nèi)含子之間，獲得干擾載體pFGC5941-BolSDG8-RNAi。

1．2．3 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化。將pFGC5941-BolSDG8-RNAi轉(zhuǎn)至農(nóng)桿菌GV3101中，挑選陽性克隆用于擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化。采用浸花法［3］將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)至野生型擬南芥(Col-0)，采用濃度30 mg/ml PPT噴施擬南芥幼苗進(jìn)行篩選，對獲得的抗性苗使用如下引物進(jìn)行PCR檢測，確認(rèn)是否為轉(zhuǎn)基因植株。

35S825 F:5'-ATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTT-3';Intron825 R:5'-TGACTCCATCTTATTCCCTCCGTTTC-3'。

1．2．4 轉(zhuǎn)基因植株的表型觀察與生物學(xué)統(tǒng)計(jì)。對生長于長日照條件下(16h/8h)的野生型擬南芥Col-0、突變體sdg8-2和轉(zhuǎn)基因植株分別進(jìn)行開花天數(shù)和抽薹時(shí)蓮座葉數(shù)目的統(tǒng)計(jì)，并拍照。

2 結(jié)果與分析

2．1 BolSDG8-RNAi的克隆 通過比對，選擇一段359 bp的保守序列作為RNAi干擾片段(圖2)，克隆到BolSDG8-RNAi目的片段，并將其連接至pMDl9-T載體上，經(jīng)熱激法轉(zhuǎn)至大腸桿菌DH5α中，挑選陽性單菌落送至公司測序，經(jīng)比對，目的片段與預(yù)期片段大小完全一致(圖3)。

2．2 BolSDG8干擾載體構(gòu)建 根據(jù)圖1所示，將BolSDG8-RNAi正反插至pFGC5941載體上，經(jīng)酶切驗(yàn)證，BolSDG8干擾載體pFGC5941-BolSDG8-RNAi構(gòu)建成功，酶切后的片段大小與預(yù)期相符(圖4)。

2．3 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化 通過浸花法和PPT抗性篩選［6］，獲得抗性苗(圖5)。通過改良的CTAB法提取抗性苗總DNA，并進(jìn)行分子檢測，結(jié)果顯示，抗性苗為轉(zhuǎn)基因植株(圖6)。轉(zhuǎn)化共計(jì)42株，分株收取種子。經(jīng)檢測共計(jì)3株完成轉(zhuǎn)化，將轉(zhuǎn)化苗命名為BolSDG8RNAi。

2．4 BolSDG8RNAi轉(zhuǎn)基因植株表型 在長日照條件下，觀察生長35 d的T3代BolSDG8RNAi轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，與Col-0相比，BolSDG8RNAi轉(zhuǎn)基因植株長勢弱小，明顯早花，其整體生物學(xué)表型與sdg8-2突變體相似(圖7)。由圖8可知，無論是蓮座葉數(shù)目還是開花天數(shù)，BolSDG8RNAi轉(zhuǎn)基因植株明顯少于 Col-0，接近于 sdg8-2，這進(jìn)一步證實(shí)了 BolSDG8RNAi轉(zhuǎn)基因植株具有與擬南芥sdg8-2突變體相似的早花表型。

3 討論

組蛋白賴氨酸甲基化修飾是一種重要的表觀遺傳學(xué)標(biāo)記［7］，也是參與開花調(diào)控的重要途徑之一［8］。其主要通過改 變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)來影響基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，使其在植物生長發(fā)育過程中起到了重要作用［9］。組蛋白賴氨酸甲基化修飾是通過特異的組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶催化實(shí)現(xiàn)的［10］。組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(histonelysine methyltransferase，HLMT)是一類含有SET結(jié)構(gòu)域的蛋白［11］，進(jìn)化上保守的SET結(jié)構(gòu)域包含約130個(gè)氨基酸序列，形成一個(gè)結(jié)狀結(jié)構(gòu)的酶催化中心。AtSDG8是在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，能特異性地催化組蛋白H3K36發(fā)生雙、三甲基化，導(dǎo)致開花關(guān)鍵基因FLC表達(dá)水平下降，從而使植物早花［12］。

AtSDG8以130多個(gè)堿基對形成一個(gè)節(jié)狀的酶催化中心［13］，即組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶，該轉(zhuǎn)移酶通過催化組蛋白的甲基化來影響整個(gè)組蛋白結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到調(diào)控基因表達(dá)的目的［14］。

在開花天數(shù)上，sdg8相對于野生型Col開花時(shí)期更早，BolSDG8RNAi相對sdg8較晚，但明顯早于Col，兩者相對于Col都有明顯的早花現(xiàn)象。在蓮座葉數(shù)目上，BolSDG8RNAi更接近于sdg8，兩者相對于Col在蓮座葉數(shù)目上都較少。該試驗(yàn)結(jié)果基本符合試驗(yàn)預(yù)期，證明Bolsdg8與sdg8不但具有高度相似的序列和結(jié)構(gòu)，在調(diào)控開花的生理功能上也十分類似。

甘藍(lán)型油菜是甘藍(lán)與白菜雜交后自然加倍而成的異源四倍體，具有來源于甘藍(lán)的一對染色體，通過甘藍(lán)早花基因BolSDG8的研究，將為進(jìn)一步研究甘藍(lán)型油菜開花機(jī)制，以及為選育適當(dāng)早花早熟的甘藍(lán)型油菜新品種來適應(yīng)“稻稻油”耕作制度提供理論參考。

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