基于內(nèi)參的大腸埃希氏菌O157∶H7實時熒光定量PCR快速檢測方法的建立

王建昌，王金鳳，段永生，李 靜，陳志敏，陳瑞春*

（河北出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，河北 石家莊 050051）

基于內(nèi)參的大腸埃希氏菌O157∶H7實時熒光定量PCR快速檢測方法的建立

王建昌，王金鳳，段永生，李 靜，陳志敏，陳瑞春*

（河北出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，河北 石家莊 050051）

針對大腸埃希氏菌O157∶H7 rfbE和Flic靶基因保守序列，設(shè)計特異性引物和探針，優(yōu)化反應(yīng)體系，并加入內(nèi)參（internal amplification control，IAC），建立能夠?qū)崟r監(jiān)控反應(yīng)過程的熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymease chain reaction，PCR）檢測方法。結(jié)果表明，該方法對E. coli O157∶H7基因組DNA的最低檢測限為1 pg/μL；對含有靶基因質(zhì)粒的最低檢測限為103copies/μL；對細(xì)菌的最低檢測限為5×103CFM/mL；Ct值與模板拷貝數(shù)均呈良好的線性關(guān)系（R2=0.999）。人工污染實驗結(jié)果表明，在初始菌量為7 CFM/25 g時，采用水洗加試劑盒法提取DNA，E. coli O157∶H7在增菌6 h后即可檢出；而采用水煮法提取DNA，則在增菌10 h后方可檢出。建立的E. coli O157∶H7實時熒光定量PCR方法，既能有效檢測食品中O157∶H7，又能實時監(jiān)測PCR反應(yīng)過程，有效防止“假陰性”的發(fā)生。

大腸埃希氏菌O157∶H7；rfbE；Flic；實時熒光定量PCR；內(nèi)參

大腸埃希氏菌O157∶H7（Escherichia coli O157∶H7，E. coli O157∶H7）是腸出血型大腸埃希氏菌的一種主要血清型，可引起人出血性結(jié)腸炎、溶血性尿毒綜合征以及血栓形成性血小板減少性紫癜等[1]，是一種危害嚴(yán)重的食源性病原微生物。E. coli O157∶H7廣泛分布于自然界，嚴(yán)重威脅公眾健康[2]。該菌在豬、牛糞便及豬肉、牛肉[3]中分離率極高，其引起的疾病也與食用未烘烤的餅干面團(tuán)[4]、生菜[5]等有關(guān)。E. coli O157∶H7多暴發(fā)于發(fā)達(dá)國家，在美國和加拿大監(jiān)測的腸道致病菌中，該菌分別排在第2位和第3位。自1987年我國權(quán)太叔[6]首次分離出該菌之后，相繼有安徽、江蘇、河南、湖北等十多個省份報道了該菌的感染情況[7-8]。河北省疾病預(yù)防控制中心對隨機(jī)抽取的530 份熟肉制品、生肉、蔬菜海產(chǎn)品的檢測表明，E. coli O157∶H7均從生肉中檢出，陽性檢測率為0.9%[9]，說明食用生肉仍是其感染的主要途徑。江蘇省徐州市2006—2009年對E. coli O157∶H7的檢出率為1.21%[10]。E. coli O157∶H7時刻威脅著人們的健康，因而快速特異的檢測方法有效控制該菌是十分必要的。

E. coli O157∶H7傳統(tǒng)的分離鑒定法的操作步驟一般包括樣品增菌、選擇性增菌、生化特征鑒定與血清分型，操作復(fù)雜，一般需要5～6 d。胡慧[11]、蔣彥君[12]等分別建立了E. coli O157∶H7的熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymease chain reaction，PCR）和PCR檢測方法，上述PCR方法多數(shù)對該菌純培養(yǎng)物進(jìn)行了靈敏性、檢測限的分析，但未對增菌時間和增菌后樣品核酸提取進(jìn)行研究評估。而在PCR檢測方法的實際應(yīng)用中，大部分樣品基質(zhì)復(fù)雜，必定存在大量未知的復(fù)雜成分，可能會存在影響PCR擴(kuò)增的物質(zhì)，同時核酸提取過程中殘留的物質(zhì)也可能導(dǎo)致PCR擴(kuò)增的抑制，從而出現(xiàn)“假陰性”結(jié)果或定量值較低。

本研究所建立的E. coli O157∶H7檢測方法是一種基于內(nèi)參的實時熒光定量PCR方法，在反應(yīng)體系中添加IAC以對整個反應(yīng)過程進(jìn)行實時監(jiān)測，從而有效地防止“假陰性”結(jié)果的產(chǎn)生，并通過水煮法和商業(yè)化試劑盒法對增菌后樣品提取核酸進(jìn)行靶基因檢測，均取得了良好的檢測結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

本實驗所用菌株見表1。

1.2 試劑與儀器

大腸埃希氏菌O157顯色平板 鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司；改良EC肉湯 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、2×Taq PCR Master Mix 北京天根生化科技有限公司；pMD?19-T SimpleVector、Premix Ex Taq 大連寶生物公司；BioPhotometer Plus核酸蛋白分析儀 德國Eppendorf公司；Tprofessional PCR儀 德國Biometra公司；7500型實時熒光定量PCR儀 美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 引物和探針的設(shè)計

通過查找相關(guān)文獻(xiàn)[13-15]，選擇rfbE和Flic作為O157∶H7檢測靶基因。從GenBank中下載rfbE和Flic靶序列，應(yīng)用DNAstar軟件對下載的多個靶序列進(jìn)行比對，查找保守序列。用Primer Express 3.0軟件設(shè)計引物和探針，用BLAST工具進(jìn)行比對，分析其特異性。所有引物、探針均由大連TaKaRa公司合成。引物和探針序列詳見表2。

表2 實驗中所用引物探針序列信息Table2 Information about the primers and probes

1.3.2 擴(kuò)增內(nèi)參的構(gòu)建

采用復(fù)合引物法[16]構(gòu)建IAC，選擇乳倉鼠腎細(xì)胞（BHK-21）的Nmi基因作為內(nèi)參基因，使用Primer Express 3.0軟件設(shè)計擴(kuò)增內(nèi)參引物和探針（序列見表2），將內(nèi)參探針標(biāo)記CY5熒光基團(tuán)，在內(nèi)參引物5’末端分別連接上rfbE檢測引物，形成一對內(nèi)參引物和目標(biāo)引物的長引物，經(jīng)長引物擴(kuò)增后得到擴(kuò)增內(nèi)參。內(nèi)參片段連接載體pMD19-T，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，測序驗證；提取質(zhì)粒，測定濃度，－20 ℃保存?zhèn)溆?，菌液于甘油中?0 ℃保存。

1.3.3 E. coli O157∶H7基因組DNA的提取

本研究中E. coli O157∶H7基因組DNA的提取分別采用以下2 種方法進(jìn)行。

1.3.3.1 水煮法

將1 mL菌液轉(zhuǎn)入1.5 mL Eppendorf離心管中5 000～8 000 r/min離心5 min，棄上清液收集菌體。加入200 μL無菌去離子水，振蕩混勻，100 ℃水浴10 min后，12 000 r/min離心10 min，上清液作為DNA模板－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.2 水洗法加天根提取試劑盒法

取增菌液樣品1 mL，放入1.5 mL離心管中，800 r/min離心5 min或靜置5～10 min，沉淀培養(yǎng)物中的食品殘渣。取上清液，在8 000 r/min離心5 min，收集菌體。倒去上清液后，用無菌雙蒸水重懸浮菌體，離心洗滌3 次，然后將沉淀用試劑盒進(jìn)行DNA提取。

1.3.4 基于內(nèi)參的E. coli O157∶H7實時熒光定量PCR反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化

以E. coli O157∶H7基因組DNA作為模板，取不同濃度的引物和探針組合，以能給出最低Ct值和最高熒光強(qiáng)度的組合為最佳組合。反應(yīng)體系為25 μL：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，上下游引物終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8 μmol/L，rfbE、Flic探針終濃度為0.12、0.16、0.18、0.2 μmol/L，IAC探針終濃度為0.12、0.14、0.16、0.18 μmol/L，IAC添加量分別為102、103、104、105、106copies，ROX Ⅱ0.5 μL，模板DNA 50～100 ng，用ddH2O補足體系。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃延伸35 s，35 個循環(huán)。60 ℃時收集熒光。

1.3.5 基于內(nèi)參的E. coli O157∶H7實時熒光定量PCR方法的特異性實驗

根據(jù)1.3.4節(jié)中確立的最佳反應(yīng)條件，水作為空白對照，提取表1中E. coli O157∶H7和其他病原菌的基因組DNA進(jìn)行實時熒光PCR擴(kuò)增，通過觀察擴(kuò)增曲線驗證所建立的實時熒光定量PCR方法的特異性。

1.3.6 基于內(nèi)參的E. coli O157∶H7實時熒光定量PCR方法的靈敏性和定量范圍

1.3.6.1 靈敏性檢測

將已知濃度的E. coli O157∶H7基因組DNA做10 倍梯度稀釋，質(zhì)量濃度范圍為102～10－4ng/μL，每個稀釋度各取1 μL為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能得到擴(kuò)增曲線的最低質(zhì)量濃度即為該反應(yīng)體系檢測的最高靈敏度。

1.3.6.2 定量范圍檢測

將E. coli O157∶H7經(jīng)過夜純培養(yǎng)后，用滅菌PBS作10 倍梯度稀釋，并選擇105、106、1073個稀釋度進(jìn)行平板計數(shù)，以此計算原始菌落數(shù)。在5×107～5×100CFM/mL范圍內(nèi)每個稀釋度各取1 mL菌液，用水煮法提取基因組DNA，用50 μL滅菌水溶解DNA，取1 μL為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.3.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建

以E. coli O157∶H7基因組DNA為模板，擴(kuò)增rfbE、Flic靶基因，凝膠回收，連接到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，將菌液送上海生工測序進(jìn)行鑒定。

將鑒定正確的菌液提取質(zhì)粒，并測定濃度，計算對應(yīng)的拷貝數(shù)，做10 倍列稀釋，最終至1 copy/μL，制成標(biāo)準(zhǔn)模板溶液，分別取1 μL作為模板進(jìn)行rfbE、Flic實時熒光定量PCR反應(yīng)，通過不同Ct值和濃度，分別建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終得到線性方程。

1.3.8 重復(fù)性和穩(wěn)定性實驗

將E. coli O157∶H7純培養(yǎng)物按10 倍梯度稀釋，取4 個稀釋度的樣本分別作3 個重復(fù)，用以上建立的方法在ABI7500進(jìn)行擴(kuò)增檢測，計算Ct值的變異系數(shù)，評價實驗結(jié)果的重復(fù)性。同時對本研究建立的方法，將試劑配制成試劑盒，考察試劑盒在－20 ℃條件下儲存6 個月后的穩(wěn)定性。

1.3.9 對人工模擬污染樣本的檢測實驗

將E. coli O157∶H7經(jīng)過夜純培養(yǎng)后，用滅菌PBS做10 倍系列稀釋，選取105、106、107稀釋度作平板計數(shù)，計算純培養(yǎng)的初濃度。經(jīng)稀釋后，選取5～50 CFM的初始菌量分別添加到25 g生豬肉、生牛肉和生羊肉樣品（已按GB 4789.36—2008《食品衛(wèi)生微生物檢驗大腸埃希氏菌O157∶H7/NM檢驗》[17]檢測為E. coli O157∶H7陰性）中，再添加到225 mL增菌肉湯中，同時做空白對照（加1 mL生理鹽水）。將上述人工污染樣品進(jìn)行37 ℃，150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)。前增菌后6、8、10 h，分別取培養(yǎng)液1 mL，采用2 種方法進(jìn)行細(xì)菌基因組DNA提取，取3 μL作為模板進(jìn)行檢測。本實驗進(jìn)行3 次重復(fù)，同時與GB 4789.36—2008方法進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于內(nèi)參的E. coli O157∶H7實時熒光定量PCR反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化

選擇熒光信號最強(qiáng)，且曲線出現(xiàn)最早的引物探針組合為最佳引物探針濃度。當(dāng)引物為0.6 μmol/L，靶基因探針為0.18 μmol/L，IAC探針濃度為0.18 μmol/L時，熒光信號最強(qiáng)，出現(xiàn)曲線最早，確定為最佳工作濃度。當(dāng)IAC的添加量為104copies時，既能出現(xiàn)明顯的CY5信號（Ct值小于25），又不會對rfbE和Flic的檢測有明顯影響。

2.2 基于內(nèi)參的E. coli O157∶H7實時熒光定量PCR的特異性

對E. coli O157∶H7和其他細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行檢測，結(jié)果rfbE和Flic引物探針僅對E. coli O157∶H7基因組DNA為陽性擴(kuò)增，呈現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，對其他菌株均無擴(kuò)增曲線，顯示較好的特異性。同時所有反應(yīng)中IAC均擴(kuò)增良好。結(jié)果說明在反應(yīng)體系中添加104copies IAC對rfbE和Flic靶基因擴(kuò)增的特異性以及整個反應(yīng)體系均沒有任何影響，IAC可以有效地指示假陰性，同時保證結(jié)果的可靠性。結(jié)果如圖1所示。

圖1 E. coli O157 H7實時熒光定量PCR的特異性Fig.1 Specifi city of the real-time qPCR

2.3 E. coli O157∶H7實時熒光定量PCR的靈敏性

圖2 E. coli O157 H7實時熒光定量PCR的靈敏性Fig.2 Sensitivity of the real-time qPCR

以10 倍梯度稀釋的E. coli O157∶H7基因組DNA為模板進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測，在102～10－3ng范圍內(nèi)均出現(xiàn)特異性擴(kuò)增，說明對基因組DNA的檢測靈敏度為10－3ng，即1 pg，結(jié)果如圖2A所示。

以水煮法提取不同濃度細(xì)菌的基因組DNA為模板進(jìn)行檢測，在5×107～5×103CFM/mL范圍內(nèi)均出現(xiàn)特異性擴(kuò)增，表明該方法對于水煮法提取的DNA均可檢測，對E. coli O157∶H7的檢測限為5×103CFM/mL。結(jié)果如圖2B所示。

2.4 質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

rfbE實時熒光定量PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=－3.193 lgX＋37.435，反應(yīng)效率為1.056，R2為0.999，接近1；Flic實時熒光定量PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=－3.270 lgX＋42.133，反應(yīng)效率為 1.022，R2為0.999，接近1；結(jié)果表明不同濃度模板拷貝數(shù)的對數(shù)與Ct值均呈良好的線性關(guān)系，最低檢測極限可以達(dá)到103copies/μL。

2.5 重復(fù)性和穩(wěn)定性

重復(fù)性實驗結(jié)果表明，重復(fù)實驗Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差均小于1，Ct值變異系數(shù)小于5.0%，說明檢測結(jié)果重復(fù)性好。穩(wěn)定性實驗結(jié)果顯示，本方法配制的檢測試劑在－20 ℃保存6 個月后，靈敏性和定量范圍不變，穩(wěn)定性良好。

2.6 對E. coli O157∶H7人工污染樣品的檢測結(jié)果

圖3 對人工污染生肉樣品中E. coli O157 H7的檢測Fig.3 Amplifi cation curves for E. coli O157∶H7 in artifi cially contaminated meat samples

檢測結(jié)果表明，采用水煮法提取人工污染樣品中E. coli O157∶H7 DNA時，當(dāng)樣本中接菌量為7 CFM/25 g，增菌時間為10 h時，反應(yīng)體系IAC擴(kuò)增均為陽性，細(xì)菌可檢出。采取水洗加試劑盒法提取人工污染樣品中E. coliO157∶H7 DNA時，當(dāng)樣本中接菌量為7 CFM/25 g，增菌時間為6 h時，反應(yīng)體系中IAC擴(kuò)增均為陽性，細(xì)菌可檢出。傳統(tǒng)培養(yǎng)方法結(jié)果表明，3 次重復(fù)實驗的人工污染樣品均檢出E. coli O157∶H7，表明本研究建立的實時熒光定量PCR方法與傳統(tǒng)方法檢測結(jié)果相一致，結(jié)果如圖3所示。

本研究建立的O157∶H7實時熒光定量PCR方法，采取水洗加試劑盒法提取DNA，在樣品經(jīng)6 h增菌后，即可從起始菌量為0.28 CFM/g生肉中檢測到E. coli O157∶H7。而采用水煮法提取DNA時，則需要至少10 h增菌才能從起始菌量為0.28 CFM/g生肉中檢測到E. coli O157∶H7。在樣品6～10 h增菌后，不同DNA提取方法的檢測結(jié)果見表3，Ct值均為3 次實驗的平均值。

表3 對人工污染生肉樣品中E. coli O157 H7的檢測結(jié)果Table3 Detection results of E. coli O157 H7 in artififi cially contaminated meat samples

33 討 論

熒光定量PCR技術(shù)具有靈敏度高、重復(fù)性好、反應(yīng)高效、準(zhǔn)確性高、檢測周期短等優(yōu)點[18]，已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域[19]。本研究選取E. coli O157∶H7特異性靶基因rfbE和Flic設(shè)計探針和引物，通過在反應(yīng)體系中添加IAC，利用靶基因和IAC的同時擴(kuò)增來防止假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。IAC在反應(yīng)體系中可以監(jiān)控PCR抑制、實驗操作的錯誤等。如果實際樣品檢測過程中出現(xiàn)靶基因檢測為陰性，而IAC也沒有擴(kuò)增信號，說明整個實驗不成立，PCR反應(yīng)是無效的，存在PCR反應(yīng)抑制物[20]等，需要查找原因重新進(jìn)行檢測，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。同時為滿足出入境口岸“檢得出、檢得快、檢得準(zhǔn)”的迫切需求，本研究設(shè)置35 個循環(huán)，以達(dá)到快速檢測大批量樣品的目的，彌補傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的不足。

E. coli O157∶H7實時熒光定量PCR的R2與擴(kuò)增效率決定熒光定量的檢測能力[21]。本實驗建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct值與拷貝數(shù)的對數(shù)呈良好的線性關(guān)系。反應(yīng)的靈敏性和定量范圍的結(jié)果顯示，無論反應(yīng)中是否加入104copies IAC，模板濃度與Ct值均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，靈敏度和定量均不受影響。模擬污染樣品檢測結(jié)果顯示，采取水洗加試劑盒法提取E. coli O157∶H7 DNA時，對于初始菌量為0.28 CFM/g的生肉樣品，前增菌6 h后均能檢測到靶基因。采取水煮法提取DNA時，對于初始菌量為0.28 CFM/g的生肉樣品，前增菌10 h后才能檢測到靶基因。對于兩種細(xì)菌DNA提取方法，不同增菌時間、不同初始添加量時的檢測反應(yīng)中，IAC內(nèi)參均出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線。在實際樣品檢測時，如果采用水煮法提取E. coli O157∶H7 DNA，建議前增菌時間大于10 h。

本研究對兩種細(xì)菌DNA提取方法對實時熒光PCR檢出限的影響分析表明，對于不同初始菌量的樣品，采用試劑盒方法提取DNA時，前增菌6 h后均能檢出；而采用水煮法提取DNA時，則至少需要前增菌10 h才能檢出。兩種DNA提取方法的最低檢出限均為0.28 CFM/g，同時所有反應(yīng)體系中IAC均出現(xiàn)典型擴(kuò)增，表明兩種方法提取細(xì)菌DNA作為模板均可采用。水煮法花費時間稍長，費用低，而水洗加試劑盒方法提取的核酸純度較水煮法高，雜質(zhì)少，經(jīng)多次實驗證明該方法對于肉制品中其他致病菌DNA的提取同樣適用，尤其是比較復(fù)雜的基質(zhì)樣品，方法可靠，可以進(jìn)行推廣和應(yīng)用。因而在實際樣品檢測中，建議根據(jù)針對不同基質(zhì)樣品和食品檢測需求選擇提取方法[22]。

研究[23-25]表明，一個可靠、有效的食源性致病菌檢測方法必須包含有可以指示假陰性結(jié)果的擴(kuò)增內(nèi)參，從而確保結(jié)果的可靠性。本實驗所建立的E. coli O157∶H7實時熒光定量方法，既能有效檢測食品中E. coli O157∶H7，又能實時監(jiān)測PCR反應(yīng)過程，有效防止“假陰性”的發(fā)生。同時對兩種不同樣品DNA提取方法的比較有效推動了E. coli O157∶H7實時熒光定量PCR檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)化。

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Development of Real-Time Quantitative PCR Assay for the Detection of E. coli O157:H7 Based on Internal Amplifi cation Reference

WANG Jianchang, WANG Jinfeng, DUAN Yongsheng, LI Jing, CHEN Zhimin, CHEN Ruichun*
(Technology Center of Hebei Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shijiazhuang 050051, China)

Based on the rfbE and Flic genes of Escherichia coli O157:H7, the specifi c primers and probes were designed, and a real-time fluorescence quantitative PCR (RT-qPCR) was developed. An internal amplification control (IAC) was added to the reaction system to monitor the performance of reaction system. The assay could be used reliably to detect E. coli O157:H7 genomic DNA with a sensitivity of 1 pg/μL. For the plasmid with rfbE and Flic, the limit of detection (LOD) reached 103copies/μL. The LOD for E. coli O157:H7 was 5 × 103CFM/mL using the DNA extracted by water boiling as the template. Through the standard curves of rfbE and Flic, the quantifi cation was linear between Ct values and the copy number of template (R2= 0.999). For artifi cially contaminated meat samples with an initial bacterial concentration of 7 CFΜ/25 g, the E. coli O157:H7 could be detected after 6 hours of culture using the DNA extracted by a commercial kit. Using the DNA extracted through water boiling, the E. coli O157:H7 could be detected after 10 hours of culture. The fl uorescence quantitative PCR assay could be applied to detect E. coli O157:H7 in food samples and monitor the PCR reaction process without false negative results. Furthermore, the comparison results of two different DNA extraction methods were helpful to standardize the RT-qPCR method for E. coli O157:H7.

E.coli O157:H7; rfbE; Flic; real-time quantitative PCR; internal amplifi cation control (IAC)

R155.5

A

1002-6630（2015）20-0226-06

10.7506/spkx1002-6630-201520044

2014-12-25

質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項（201210128；201310126）

王建昌（1981—），男，獸醫(yī)師，博士，研究方向為食源性微生物、動物疫病病原的分子生物學(xué)檢測。

E-mail：18630135980@163.com

*通信作者：陳瑞春（1963—），男，研究員，學(xué)士，研究方向為食品安全項目。E-mail：crcde@163.com