補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)大鼠急性脊髓損傷后血清中MBP蛋白含量的影響

李俊杰 梁舒涵 趙 鵬 彭 奇 林 斌 饒耀劍

（1湖南中醫(yī)藥大學(xué)2009級(jí)中醫(yī)七年制骨傷，長(zhǎng)沙410007；2福建中醫(yī)藥大學(xué)骨傷學(xué)院碩士研究生2012級(jí)，福州350122；3湖南中醫(yī)藥大學(xué)2008級(jí)中醫(yī)七年制骨傷，長(zhǎng)沙410007；4河南省洛陽(yáng)正骨醫(yī)院河南省骨科醫(yī)院脊柱外三科，洛陽(yáng)471002）

補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)大鼠急性脊髓損傷后血清中MBP蛋白含量的影響

李俊杰1梁舒涵1趙 鵬2彭 奇3林 斌3饒耀劍4*

（1湖南中醫(yī)藥大學(xué)2009級(jí)中醫(yī)七年制骨傷，長(zhǎng)沙410007；2福建中醫(yī)藥大學(xué)骨傷學(xué)院碩士研究生2012級(jí)，福州350122；3湖南中醫(yī)藥大學(xué)2008級(jí)中醫(yī)七年制骨傷，長(zhǎng)沙410007；4河南省洛陽(yáng)正骨醫(yī)院河南省骨科醫(yī)院脊柱外三科，洛陽(yáng)471002）

目的探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)大鼠脊髓損傷（SCI）后血清中髓鞘堿性蛋白（MBP）含量的影響。方法將45只大鼠隨機(jī)分為模型組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯（BYHWT）組、假手術(shù)組（n=15）；假手術(shù)組單純咬除T10椎板，不損傷脊髓，模型組及BYHWT組均采用Allen’s垂直打擊法來(lái)制備T10節(jié)段SCI大鼠模型，術(shù)后第1天，BYHWT組開(kāi)始給予BYHWT濃縮液灌胃，于造模后3d、7d、14d行大鼠后下肢BBB評(píng)分并用腹主動(dòng)脈采血法取血提取大鼠血清，通過(guò)E lisa法檢測(cè)各組血清中MBP蛋白含量情況。結(jié)果BYHWT治療后，血清中MBP含量較模型組明顯下降，BBB評(píng)分較模型組模型升高。結(jié)論BYHWT能減少SCI后MBP釋放，減少SCI血清中MBP蛋白含量，從而減輕髓鞘組織的退變促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。

脊髓損傷；髓鞘堿性蛋白；補(bǔ)陽(yáng)還五湯；實(shí)驗(yàn)研究；痹證

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是指直接或間接暴力導(dǎo)致脊髓灰質(zhì)和白質(zhì)受損，神經(jīng)傳導(dǎo)通路中斷，從而出現(xiàn)相應(yīng)節(jié)段的感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)和括約肌功能障礙，肌張力異常及病理反射等的改變［1］。髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）是膜蛋白成分，只存在于神經(jīng)系統(tǒng)中，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)由少突膠質(zhì)細(xì)胞合成，在周圍神經(jīng)由雪旺氏細(xì)胞合成。MBP是髓鞘中心的主要成分，在髓鞘外周存在較少。有研究顯示［2］脊髓損傷后損傷部位的缺血及炎癥和免疫反應(yīng)可導(dǎo)致血脊髓屏障的破壞，使MBP可以進(jìn)入血液循環(huán)。近年來(lái)，在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)及臨床方面，關(guān)于補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療脊髓損傷的研究報(bào)道逐漸增多，其療效也令人滿意，但其對(duì)MBP的影響研究鮮見(jiàn)報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用中醫(yī)藥與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)結(jié)合的思維并遵循整體治療原則，來(lái)探究補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)大鼠SCI后血清中MBP蛋白含量的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑4月齡清潔級(jí)SD大鼠45只，體重在220～300g之間，不拘雌雄（合格證號(hào)：SCXK（豫）2010-0002），購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。大鼠MBP酶聯(lián)免疫分析盒（武漢博士德生物有限公司）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及脊髓損傷動(dòng)物模型的建立45只大鼠，隨機(jī)分成補(bǔ)陽(yáng)還五湯（BYHWT）組、模型組、假手術(shù)組，每組各15只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1w后準(zhǔn)備造模。3%戊巴比妥鈉（30mg/kg）麻醉后，用Allen’s垂直打擊法［3］制造大鼠SCI模型，打擊高度5cm，重量10g，直徑2mm，打擊成功可見(jiàn)大鼠尾巴出現(xiàn)痙攣性擺動(dòng)，雙下肢軀體回縮樣撲動(dòng)，呈遲緩性癱瘓。假手術(shù)組只行T9-11椎板咬處，不予以打擊。

1.3 術(shù)后護(hù)理及給藥造模后大鼠分籠單籠飼養(yǎng)；造模后每天給予每只SD大鼠肌肉注射青霉素約8萬(wàn)U一次，連續(xù)3d；造模后每日3次定時(shí)人工排尿。BYHWT組大鼠于術(shù)后次日分別在每日早9時(shí)、下午4時(shí)用BYHWT濃縮液（BYHWT原方水煎至95ml制成相當(dāng)于含生藥1.5g/ml的水煎劑）灌胃，每次灌胃劑量按“人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比率表”計(jì)算臨床等效劑量，按60kg體重人每天l劑換算，200g大鼠等效用藥劑量約為4.34g（分兩次灌胃），連續(xù)灌胃14d。模型組及假手術(shù)組不予灌胃處理。

1.4 BBB評(píng)分造模前每只大白鼠BBB功能評(píng)分均為21分，造模后再予BBB功能評(píng)分，分別在術(shù)后3d、7d、14d行BBB功能評(píng)分。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)分3組實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行，取平均值［4］。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法（Elisa）各組動(dòng)物于損傷后3d、7d、14d隨機(jī)選取5只大鼠經(jīng)腹主動(dòng)脈取血致死，置于4℃冰箱2h，待其凝固后放入離心機(jī)經(jīng)1500r/min15min，分離出血清置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。Elisa法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析造模后死亡大鼠及時(shí)補(bǔ)充，制取標(biāo)本時(shí)必須保證每組樣本量為15。用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，完全隨機(jī)設(shè)計(jì)多個(gè)樣本均數(shù)間的比較若符合正態(tài)分布及方差齊性，則采用單因素方差分析進(jìn)行分析；若不符合正態(tài)分布則采用秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 BBB評(píng)分比較（1）3組大鼠SCI前BBB評(píng)分比較無(wú)差異（P＞0.05）；（2）BYHWT組和模型組大鼠SCI前后BBB評(píng)分比較有顯著性差異（P＜0.05）；（3）7d、14d，BYHWT組與模型組相比，BBB評(píng)分有顯著性差異（P＜0.05）。（見(jiàn)表1）

表1 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)的B B B功能評(píng)分（±s）

表1 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)的B B B功能評(píng)分（±s）

術(shù)前術(shù)后3d術(shù)后7d術(shù)后14d B Y H W T組21．00±0．001．32±0．313．46±0．567．57±0．48模型組21．00±0．001．15±0．351．56±0．363．31±0．32假手術(shù)組21．00±0．0018．56±0．4118．32±0．3219．31±0．38

2.2 血清中M B P蛋白含量比較（1）BYHWT組及模型組大鼠造模后3d、7d、14d各時(shí)間點(diǎn)血清中MBP蛋白含量與假手術(shù)組比較有顯著性差異（P＜0.05）；（2）BYHWT組大鼠造模后3d、7d、14d各時(shí)間點(diǎn)血清中MBP蛋白含量與模型組比較有顯著性差異（P＜0.05）。（見(jiàn)表2）

表2 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)血清中M B P蛋白含量（μg/l，±s）

表2 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)血清中M B P蛋白含量（μg/l，±s）

術(shù)后3d術(shù)后7d術(shù)后14d B Y H W T組4．32±1．415．96±1．466．57±1．48模型組5．65±1．357．16±1．368．31±1．32假手術(shù)組1．56±1．411．87±1．321．67±1．38

3 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central Nervous System，CNS）髓鞘的蛋白質(zhì)主要由MBP組成，約占髓鞘蛋白質(zhì)總量的30%。其位于髓鞘多層膜結(jié)構(gòu)的漿面，與髓鞘脂質(zhì)緊密結(jié)合，維持CNS髓鞘結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定。由于血腦屏障的作用，髓鞘堿性蛋白較易釋放到腦脊液，僅小量釋放入血液。研究表明［5］當(dāng)CNS出現(xiàn)實(shí)質(zhì)性損害，特別是出現(xiàn)髓鞘脫失時(shí)，構(gòu)成髓鞘主要蛋白質(zhì)的髓鞘堿性蛋白也與其結(jié)合的脂質(zhì)分離，并通過(guò)破壞的脊髓血腦屏障入血。腦脊液（Cerebro-Spinal Fluid，CSF）和血液中MBP此時(shí)可急劇升高［6］。楊喜明等［7］研究指出了在脊髓損傷及腦損傷后血清及腦脊液中MBP濃度的平行性及中樞神經(jīng)損傷嚴(yán)重程度的正相關(guān)。Buss［8］等在通過(guò)對(duì)SCI大鼠脊髓組織進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，觀察到在SCI組織中許多神經(jīng)細(xì)胞體皺縮并且組織呈海綿狀水腫表現(xiàn)，其內(nèi)存在一個(gè)膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白免疫應(yīng)答的顯著增加和MBP染色的明顯減少。

補(bǔ)陽(yáng)還五湯是補(bǔ)氣活血通絡(luò)的代表方。補(bǔ)陽(yáng)還五湯方源自清·王清任《醫(yī)林改錯(cuò)》，由生黃芪、當(dāng)歸尾、赤芍、地龍、川芎、桃仁、紅花組成，具有補(bǔ)氣活血化瘀之效，主治“半身不遂……遺尿不禁”。方中生黃芪為君藥，大補(bǔ)脾胃之元?dú)?，使氣旺血行，瘀祛絡(luò)通；臣藥當(dāng)歸尾，長(zhǎng)于活血，兼能養(yǎng)血，因而有化瘀而不傷血之妙；佐藥赤芍、川芎、桃仁、紅花，有助于當(dāng)歸尾活血祛瘀，地龍通經(jīng)活絡(luò)。本方運(yùn)用大量補(bǔ)氣藥與少量活血藥相配，氣行則血行，活血而不傷正，共奏補(bǔ)氣活血通絡(luò)之功。已有較多實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)SCI改善癥狀、脊髓功能恢復(fù)有積極治療作用，其機(jī)制可能為：（1）抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)；（2）促進(jìn)軸突再生作用；（3）抑制細(xì)胞死亡，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞；（4）降低血小板活化因子含量，抑制水通道蛋白-4的表達(dá)，改善損傷后組織的缺血和炎癥反應(yīng)。

本研究通過(guò)用BYHWT對(duì)大鼠SCI模型進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)BYHWT能減少M(fèi)BP入血，從而降低SCI大鼠血清中MBP蛋白含量，進(jìn)而提高大鼠BBB評(píng)分，促進(jìn)其神經(jīng)功能恢復(fù)。但是目前對(duì)MBP的研究尚處于起步階段及BYHWT對(duì)SCI中MBP的影響研究也處于起步階段，其具體作用機(jī)制尚不明確，今后我們會(huì)進(jìn)一步深化研究，為其廣泛應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。

［1］胥少汀，葛寶豐，徐印坎．實(shí)用骨科學(xué)［M］．4版．北京：人民軍醫(yī)出版社，2012：645-646．

［2］劉暉，尹慶水，夏虹，等．甲強(qiáng)龍對(duì)兔急性脊髓損傷后血、組織髓鞘堿性蛋白表達(dá)的影響［J］．中國(guó)骨與關(guān)節(jié)損傷雜志，2006，21（3）：191-193．

［3］Allen AR．Surgery for experimental lesions of spinal cord equivalent to cr-ushinjury of fracture dislocation of spinal column：a preliminary report［J］．JAMA，1911，57（4）：878-880．

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［5］賀玉君，秦新民，黃明，等．髓鞘堿性蛋白的研究及進(jìn)展［J］．廣西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，7（2）：75-79．

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LI Junjie1， LIANG Shuhan1， ZHAO Peng2， peng Qi3， LIN Bin3， RAO Yaojian4
（1. Grade2009Graduate of Seven-Year-System， Hunan University of Traditional Chinese Medicine， Changsha410007， China；2. Grade2012Graduate， Orthopedics College， Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou350122， China；3. Grade2008， Hunan university of traditional Chinese medicine， Hunan，Changsha，410007；4. Spinal Surgical Department， Luoyang Orthopedic-traumatological Hospital， Henan Province， Luoyang471002， China）

Objective To investigate the effect of Buying Huanwu decoction（BYHWT）on MBP protein content in serum of rats after acute spinal cord injury.Methods45rats were randomly divided into model group，BYHWT group，the sham group（n=15）.The sham group was bit T10laminectomy，without spinal cord injury.The model group and BYHWT groups were prepared T10segment SCI rats by Allen's vertical combat.On the first day after the operation，BYHWT group was diven gavage with BYHWT.Upon modeling3d，7d and14d，Rats' behavior were scored by BBB score，the serum of rats were taken by abdominal aortic blood，the content of MBP in serum were detect by Elisa.Results After BYHWT treatment，the serum MBP content was significantly lower than that of the model group，and the BBB score was higher than that of the model group.Conclusion BYHWT can reduce the release of MBP after SCI and the content of MBP in serum，thereby reduce the degeneration of myelin tissue and promote the recovery of nerve function.

spinal cord injury；MBP；Buying Huanwu decoction；experimental study；bi syndrome

10.3969/j.issn.1672-2779.2015.17.074

1672-2779（2015）-17-0142-02

：張文娟本文校對(duì)：趙鵬

2015-07-07）

*通訊作者：670570572@qq.com