電針曲池、足三里穴對缺血再灌注損傷大鼠線粒體Caspase-3途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響

上官豪，柳維林，陳文列，鄭薏，王鮮，林云嬌，王露露，陳立典，陶靜

電針曲池、足三里穴對缺血再灌注損傷大鼠線粒體Caspase-3途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響

上官豪1，柳維林1，陳文列2，鄭薏1，王鮮1，林云嬌1，王露露1，陳立典1，陶靜1

目的 觀察電針曲池、足三里穴對腦缺血再灌注損傷大鼠缺血周圍區(qū)皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響。方法 36只雄性Sprague-Daw ley大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組及電針組，每組12只。采用Longa線栓法制作左側(cè)大腦中動脈缺血再灌注損傷模型。電針偏癱側(cè)曲池、足三里穴30m in。治療前后分別進行神經(jīng)行為學(xué)評分，采用透射電鏡觀察神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，Western blotting法檢測caspase-3、Bcl-2及Bax的表達(dá)。結(jié)果 電針治療后，電針組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分較模型組降低(P＜0.05)；電鏡下電針組較模型組核染色質(zhì)均勻，線粒體數(shù)量增加；電針組Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯高于模型組(P＜0.01)，caspase-3、Bax蛋白表達(dá)低于模型組(P＜0.05)。結(jié)論 電針曲池、足三里穴可通過線粒體-caspase-3途徑抑制缺血周圍區(qū)皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

腦缺血再灌注；電針；線粒體；caspase-3；凋亡；大鼠

[本文著錄格式] 上官豪，柳維林，陳文列，等.電針曲池、足三里穴對缺血再灌注損傷大鼠線粒體Caspase-3途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響[J].中國康復(fù)理論與實踐,2015,21(8):900-904.

CITED AS:Shangguan H,Liu WL,Chen WL,et al.Effects of electroacupuncture at Quchi(LI11)and Zusanli(ST36)on neuronalapoptosis induced bym itochondria-caspase-3 pathway in ratswith cerebral ischem ia-reperfusion injury[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(8):900-904.

缺血性腦卒中是臨床的常見病、多發(fā)病，具有高死亡率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率等特點[1]。缺血性腦卒中涉及復(fù)雜的病理生理變化，呈現(xiàn)一個時間、空間改變的動態(tài)過程，與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。目前研究已經(jīng)表明，細(xì)胞凋亡與線粒體功能密切相關(guān)，而線粒體是細(xì)胞凋亡調(diào)控中心。線粒體膜電位消失，通透性改變，釋放細(xì)胞色素C(cytochrome C,CytC)，激活caspase-9/caspase-3等分子誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[2]。Bcl-2蛋白家族中，抗凋亡蛋白Bcl-2阻礙CytC的釋放，抑制凋亡；而另一部分如Bax等促進凋亡。Bcl-2與Bax相互作用共同參與程序性細(xì)胞凋亡過程[3-4]。Bcl-2家族基因與Caspase家族共同參與了細(xì)胞凋亡中由線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑?？沟蛲鯞cl-2家族成員下調(diào)或促凋亡成員在線粒體膜上過度表達(dá)和移位，導(dǎo)致線粒體通透性增加，激活caspase家族，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[5]。caspase-3是多種凋亡途徑最主要的下游效應(yīng)因子之一，是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶。在腦缺血后程序性細(xì)胞死亡過程中，激活的caspase-3通過對DNA修復(fù)蛋白、細(xì)胞骨架蛋白及其他caspase相關(guān)底物蛋白產(chǎn)生裂解的作用，直接參與細(xì)胞凋亡的發(fā)生，導(dǎo)致腦缺血再灌注損傷。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在缺血性神經(jīng)損傷過程中，抑制caspase-3活性可產(chǎn)生明顯的神經(jīng)保護作用[6]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)電針曲池和足三里3 d能激活PI3k/Akt信號通路，抑制細(xì)胞凋亡來發(fā)揮對腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護功能[7]。本研究擬進一步觀察電針曲池、足三里穴是否通過線粒體-caspase-3途徑治療腦缺血再灌注損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

雄性Sprague-Daw ley大鼠36只，體質(zhì)量200～250 g，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供，許可證號：SCXK(滬2012-0002)。動物飼養(yǎng)于SPF級動物實驗室，模擬標(biāo)準(zhǔn)日夜系統(tǒng)，予以自由飲食及飲水。

將大鼠進行編號，采用隨機數(shù)字表法將其分為假手術(shù)組、模型組及電針組，每組12只。模型組與電針組采用Longa[8]法制備左側(cè)大腦中動脈梗死(m iddle cerebralanery occlusion,MCAO)模型，2 h后進行神經(jīng)行為學(xué)評分[8]。

1.2 主要試劑

Bcl-2、Bax、caspase-3、β-actin一抗及辣根過氧化物酶二抗(Cell Signaling,Beverly,MA,USA)、10%水合氯醛、3%戊二醛-1.5%多聚甲醛、1%鋨酸-1.5%亞鐵氰化鉀。

1.3 制備左側(cè)MCAO模型

術(shù)前大鼠禁食，大鼠經(jīng)10%水合氯醛3m l/kg腹腔注射麻醉，仰臥固定大鼠，頸部皮膚消毒備皮后，沿前正中線切開頸部皮膚，充分暴露左側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈，用結(jié)扎線依次結(jié)扎頸總動脈近心端、頸外動脈遠(yuǎn)心端，用顯微血管夾夾閉頸內(nèi)動脈，在距頸總動脈分叉處約1.0 cm處用顯微剪刀剪一切口，將直徑為0.2mm的魚線從切口處緩慢進入頸內(nèi)動脈，松開血管夾，當(dāng)魚線頭端到達(dá)大腦中動脈起始端處(從頸外動脈與頸內(nèi)動脈分叉處起計算插入約18～22mm)即可。固定線栓，縫合切口。手術(shù)結(jié)束后，動物放置于室溫環(huán)境下蘇醒。2 h后緩慢退出魚線至分叉處。試驗過程和動物蘇醒期間注意保溫。動物蘇醒后觀察其體態(tài)及行為，以判斷MCAO模型是否成功。手術(shù)后大鼠正常喂食，飲水。

假手術(shù)組只分離左側(cè)頸總、頸內(nèi)、頸外動脈，不予以插線栓。

1.4 電針干預(yù)

電針組大鼠在造模后2 h開始進行電針干預(yù)。根據(jù)《實驗針灸學(xué)》[9]取大鼠右側(cè)曲池、足三里穴。局部消毒后，用0.5寸毫針(華佗牌30號)，直刺2～3 mm，接電針儀(G6805型)，電壓峰值為6 V，疏密波，頻率1～20Hz，以大鼠肢體輕微抖動為度，治療時間為30m in/次，1次/d，療程1 d。假手術(shù)組及模型組大鼠同一時間以同樣方法固定30m in，但不予電針刺激。

1.5 神經(jīng)行為學(xué)評分

所有大鼠在缺血再灌注后2 h及24 h后，進行兩次Longa神經(jīng)功能缺損評分。神經(jīng)行為學(xué)評估方法：無神經(jīng)功能缺損，0分；提尾時右前肢內(nèi)收，不能完全伸展，1分；自發(fā)行走時向右側(cè)轉(zhuǎn)圈，2分；行走時身體向右側(cè)傾倒，3分；不能自發(fā)行走，有意識喪失，4分。0分及4分者予以剔除。

該評估均由一名對本研究不知情的觀察者完成。

1.6 透射電鏡觀察

各組大鼠分別于電針干預(yù)1 d后，用10%水合氯醛3m l/kg腹腔麻醉成功后，用4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌流固定，灌流完畢后快速斷頭取腦，取左側(cè)半球缺血周圍區(qū)皮質(zhì)，大小約1×1×1mm，迅速置入預(yù)冷的3%戊二醛-1.5%多聚甲醛前固定3 d(4℃)，1%鋨酸-1.5%亞鐵氰化鉀后固定2 h，PBS漂洗；酒精-丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂618包埋劑包埋。超薄切片80 nm，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色；在H7650型透射電鏡80 KV下觀察線粒體及細(xì)胞核的形態(tài)結(jié)構(gòu)，并用SIS 400萬像素電鏡CCD相機攝影。

1.7 Western blotting檢測

取缺血周圍區(qū)皮質(zhì)樣本約100mg放入勻漿器，加入RIPA裂解液1 m l，于冰上充分研磨后，4℃，12000 r/m in離心5m in，小心吸取上清液。采用BCA法測定各樣本蛋白濃度。100℃加熱5m in，使蛋白充分變性后，取50μg樣品蛋白經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl-polyacrylgradientgelelectrophoresis,SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)移到聚偏二乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜后，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別加入抗caspase-3(1∶1000)、抗Bcl-2(1∶1000)、抗 Bax(1∶1000)及抗β-actin(1∶1000)一抗，4℃孵育過夜，經(jīng)TBST洗膜后，用辣根過氧化物標(biāo)記的二抗(1∶5000)室溫孵育60m in。將PVDF膜放圖像掃描儀上，避光配置顯色液并覆蓋PVDF膜，反應(yīng)1m in，成像；應(yīng)用Image lab軟件計算蛋白條帶光密度并進行分析處理。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件SPSS 18.0處理，計量資料均以(±s)表示，多組間的比較采用One-Way ANOVA，方差齊時用LSD方法，不齊時用Games-Howell方法。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)行為學(xué)評分

腦缺血再灌注后2 h，與假手術(shù)組大鼠相比，模型組及電針組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分均明顯升高(P＜0.01)，但模型組與電針組之間無顯著性差異(P＞0.05)，說明造模成功。缺血再灌注后24 h，電針組神經(jīng)行為學(xué)評分低于模型組(P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分

2.2 皮質(zhì)線粒體結(jié)構(gòu)

假手術(shù)組大鼠皮層中神經(jīng)元細(xì)胞核呈多種形態(tài)，多數(shù)扁圓形；核仁清晰可見；線粒體結(jié)構(gòu)、線粒體嵴清晰可見。缺血再灌注后24 h，模型組缺血周圍區(qū)部分神經(jīng)元細(xì)胞核破裂，大部分神經(jīng)元核染色質(zhì)出現(xiàn)邊聚，線粒體嵴紊亂，其數(shù)量減少；而電針組較模型組核染色質(zhì)均勻，線粒體數(shù)量增加。見圖1。

圖1 缺血周圍區(qū)皮層神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)(透射電鏡，25000×)

2.3 皮質(zhì)caspase-3、Bcl-2、Bax表達(dá)

模型組大鼠Bcl-2蛋白表達(dá)低于假手術(shù)組(P＜0.05)，而caspase-3、Bax蛋白的表達(dá)明顯高于假手術(shù)組(P＜0.01)。電針組Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯高于模型組(P＜0.01)，caspase-3、Bax蛋白表達(dá)低于模型組(P＜0.05)。見圖2、表2。

圖2 缺血周圍區(qū)皮質(zhì)caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)情況

表2 各組大鼠缺血周圍區(qū)皮質(zhì)caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較(/β-actin)

3 討論

缺血性腦卒中在祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中歸屬于 “中風(fēng)”范疇，而對中風(fēng)的記載可追溯至《內(nèi)經(jīng)》。中風(fēng)的基本病機屬陰陽失調(diào)，氣血逆亂。在治療中風(fēng)的方法上，《內(nèi)經(jīng)》明確指出應(yīng)以針灸為主。曲池是手陽明大腸經(jīng)的合穴，足三里是足陽明胃經(jīng)的合穴，陽明經(jīng)具有多氣多血的特點，針刺曲池、足三里具有調(diào)節(jié)全身氣血的作用。大量臨床研究表明，電針曲池、足三里穴能夠促進腦卒中后癱瘓肢體功能的恢復(fù)，改善其運動功能[10-11]。另有學(xué)者對針刺治療腦卒中的相關(guān)文獻取穴規(guī)律進行研究，發(fā)現(xiàn)陽明經(jīng)穴出現(xiàn)頻率較高，其中曲池、足三里穴較為常用[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)電針曲池、足三里穴能有效緩解腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)功能缺損。

目前大量基礎(chǔ)研究表明，腦缺血再灌注損傷與細(xì)胞凋亡途徑有密切聯(lián)系[14-17]。神經(jīng)細(xì)胞凋亡是腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)元死亡的重要方式之一[18-19]。具體表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮，出現(xiàn)凋亡小體；核濃縮，染色質(zhì)凝集。線粒體是腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的重要途徑之一，在各種促細(xì)胞凋亡信號作用下，線粒體的形態(tài)發(fā)生變化，線粒體通透性改變，線粒體基質(zhì)滲透壓升高，內(nèi)膜腫脹，釋放CytC和凋亡誘導(dǎo)因子等，通過激活下游的caspase信號通路最終引起細(xì)胞凋亡[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組缺血周圍區(qū)部分神經(jīng)元細(xì)胞核破裂，大部分神經(jīng)元核染色質(zhì)出現(xiàn)邊聚，線粒體嵴紊亂，其數(shù)量減少；而電針組核染色質(zhì)較均勻，線粒體數(shù)量較模型組增加。提示線粒體凋亡參與腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)元凋亡的調(diào)控，給予電針干預(yù)后，通過穩(wěn)定線粒體膜，減少線粒體內(nèi)部嵴斷裂，保護線粒體的形態(tài)功能，增加線粒體數(shù)量，促進核染色質(zhì)均勻分布，從而減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生，在線粒體水平上發(fā)揮腦保護作用。表明電針作用能減少線粒體損傷，神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

此外，線粒體途徑誘導(dǎo)caspase-3和Bcl-2家族引起細(xì)胞凋亡的作用受到越來越多的重視。研究表明，Bax可從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)移到線粒體，增加線粒體膜的通透性，釋放Cyt C入細(xì)胞漿，激活Caspase-3，引起細(xì)胞凋亡[22-24]。有研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注損傷大鼠缺血周圍區(qū)皮質(zhì)Bcl-2的水平降低，Bax呈高水平表達(dá)，活化型caspase-3免疫陽性細(xì)胞的數(shù)量明顯多，電針干預(yù)后促進Bcl-2表達(dá)，抑制Bax表達(dá)，減少活化型caspase-3免疫陽性細(xì)胞的數(shù)量[25]。本研究從蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，電針上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平，下調(diào)促凋亡蛋白Bax及caspase-3的表達(dá)水平，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，研究結(jié)果與其一致。

綜上所述，本研究證實電針刺激曲池、足三里穴可改善缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)行為缺損，產(chǎn)生神經(jīng)保護作用。其機制可能通過改善線粒體結(jié)構(gòu)，抑制caspase-3的表達(dá)，調(diào)控Bcl-2、Bax的表達(dá)，抑制缺血周圍區(qū)皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，從而緩解腦缺血再灌注損傷。但效應(yīng)機制還有待于進一步的深入研究。

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Effects of Electroacupuncture at Quchi(LI11)and Zusanli(ST36)on Neuronal Apoptosis Induced by M itochondria-caspase-3Pathway in Ratswith Cerebral Ischem ia-reperfusion Injury

SHANGGUAN Hao1,LIUWei-lin1,CHENWen-lie2,ZHENG Yi1,WANG Xian1,LIN Yun-jiao1,WANG Lu-lu1,CHEN Li-dian1,TAO Jing1
1.College of Rehabilitation Medicine,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou,Fujian 350122, China;2.Academy of IntegrativeMedicine,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou,Fujian 350122, China

Objective To investigate the effects of electroacupuncture(EA)at Quchi(LI11)and Zusanli(ST36)acupoints on the ultrastructural structure of cortical neurons in peripheral area and the protein expression of caspase-3,Bcl-2,Bax in rats with cerebral ischem ia-reperfusion injury.Methods 36male adult Sprague-Daw ley ratswere random ly divided into sham operation group,model group,and electroacupuncture group,with 12 rats in each group.Themodelgroup and electroacupuncture group were performed with leftmiddle cerebralartery occlusion(MCAO)according to themodified Longa'methods.The electroacupuncture group received electroacupuncture atQuchi(LI11)and Zusanli(ST36)on the paralyzed limb,for 30m inute.The neurobehavioral scoreswere recorded before and after treatment. The ultrastructural structure of corticalneuronswas observed with transmission electronmicroscope(TEM).The protein expression of caspase-3,Bcl-2 and Bax were detected byWestern blotting technique.Results The neurobehavioral scorewas lower in the electroacupuncture group than in the controlgroup(P＜0.05).Compared with themodelgroup,the chromatin of neuronswas even relatively,and the number of mitochondria increased.The expression of Bcl-2 was higher and the expression of caspase-3 and Bax was lower in the electroacupuncture group than in themodelgroup(P＜0.05).Conclusion Electroacupuncture atQuchi(LI11)and Zusanli(ST36)acupoints can inhibit the neuronsapoptosis in peripheralarea throughm itochondria-caspase-3 pathway.

cerebral ischemia-reperfusion;electroacupuncture;mitochondria;caspase-3;apoptosis;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.08.006

R743.3

A

1006-9771(2015)08-0900-05

2015-07-07

2015-07-22)

國家自然科學(xué)基金項目(No.81273835;No.81373778)。

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，福建福州市350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州市350122。作者簡介：上官豪(1990-)，男，漢族，福建清流縣人，碩士研究生，主要研究方向：腦血管病的臨床與康復(fù)。通訊作者：陶靜(1977-)，女，漢族，江蘇淮安市人，醫(yī)學(xué)博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：腦血管病的臨床與康復(fù)。E-mail:taojing01@163.com。