腸道缺血再灌注對小鼠體內(nèi)脂肪細(xì)胞因子chemerin表達(dá)的影響

朱乾坤，何桂珍，李海龍

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院腸外腸內(nèi)營養(yǎng)科，北京100730

腸道缺血再灌注對小鼠體內(nèi)脂肪細(xì)胞因子chemerin表達(dá)的影響

朱乾坤，何桂珍，李海龍

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院腸外腸內(nèi)營養(yǎng)科，北京100730

目的 探討小鼠腸道缺血再灌注損傷對體內(nèi)組織器官脂肪細(xì)胞因子chemerin的影響。方法 無特定病原體級C57BL/6J小鼠16只，體質(zhì)量(25±2)g，適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后，按照隨機(jī)數(shù)字表尾數(shù)法分為腸道缺血再灌注組和假手術(shù)組，每組8只。腸道缺血再灌注組夾閉小鼠腸系膜上動脈60 min，然后再灌注60 min造成腸道損傷，假手術(shù)組只開腹不夾閉120 min。實驗結(jié)束后，處死動物取材檢測。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實驗方法測定各組織器官chemerin的濃度變化，用Western blot方法檢測chemerin蛋白表達(dá)。結(jié)果 酶聯(lián)免疫吸附實驗結(jié)果顯示腸道缺血再灌注損傷后小鼠體內(nèi)各組織器官chemerin濃度顯著增加(P＜0．05)，Western blot結(jié)果顯示chemerin蛋白表達(dá)顯著增加(P＜0．05)。結(jié)論 腸道缺血再灌注損傷時小鼠各器官組織的脂肪細(xì)胞因子chemerin濃度和蛋白表達(dá)顯著增加。

腸道缺血再灌注;chemerin;脂肪因子;炎癥;氧化損傷

Acta Acad Med Sin，2015，37(4):440-445

chemerin是近幾年新發(fā)現(xiàn)的脂肪細(xì)胞因子，主要由脂肪細(xì)胞分泌，表達(dá)于白色脂肪組織、肝臟和肺臟等多種器官和組織［1］。chemerin基因定位于7q36．1，蛋白的相對分子質(zhì)量為16 000［2］。chemerin以前體-chemerin的形式分泌，被絲氨酸蛋白酶激活后，成為具有生物活性的chemerin［3］。chemerin參與多種病理生理過程。最近研究表明chemerin與炎癥反應(yīng)［4］和氧化損傷［5］密切相關(guān)。腸道缺血再灌注(ischemiareperfusion，I/R)損傷是指當(dāng)腸道缺血一段時間，血流重新恢復(fù)后，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞和功能代謝障礙反而較缺血時進(jìn)一步加重，器官功能進(jìn)一步惡化的臨床綜合征［6］。缺血再灌注過程中，內(nèi)皮細(xì)胞被激活，導(dǎo)致活性氧簇增加，激活的補(bǔ)體系統(tǒng)和相關(guān)危險信號分子能引發(fā)無菌性炎癥，循環(huán)中各種炎性介質(zhì)增多，損傷細(xì)胞和組織［7］。由于無菌性炎癥和氧化損傷可以加重I/R，且chemerin與炎癥反應(yīng)和氧化損傷相關(guān)，因此，筆者推測I/R可能影響體內(nèi)chemerin的表達(dá)。但是目前缺乏關(guān)于chemerin和腸道缺血再灌注的相關(guān)研究，因此，本研究應(yīng)用小鼠腸道缺血再灌注模型探討腸道損傷時體內(nèi)各臟器chemerin的變化。

材料和方法

材料 C57BL/6J小鼠購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司;酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司;chemerin多克隆抗體(ab103153)、β-actin抗體(ab179467)和IgG二抗(ab97160)均購自美國 Abcam公司;聚偏氟乙稀(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜購自Amersham Biosciences公司。

腸道缺血再灌注 健康雄性無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級C57BL/6J小鼠16只，體質(zhì)量(25±2)g，飼養(yǎng)于北京協(xié)和醫(yī)院動物中心，自由進(jìn)食和飲水，12 h光/黑循環(huán)，適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后，小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表尾數(shù)法分為腸道I/R組和假手術(shù)組，每組8只。具體過程如下:所有小鼠術(shù)前12 h禁食，4 h禁飲，手術(shù)當(dāng)天，小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉溶液(60 mg/kg)麻醉后，將小鼠固定于操作臺，用碘伏和70%酒精消毒兩遍，沿著腹腔正中線做一長約2 cm的直線切口，依次剪開皮膚和肌肉各層，沿腹主動脈前壁找到腸系膜上動脈，鈍性分離腸系膜上動脈，用小血管夾鉗閉動脈，造成腸道缺血。夾閉后，觀察到腸系膜根部血管搏動消失，腸壁蒼白，腸道蠕動減弱，管壁塌陷，證明缺血造模成功。缺血60 min后，松解小血管夾，再灌注60 min。整個手術(shù)過程中每隔15 min對腹腔內(nèi)滴注0．1 ml 0．9%生理鹽水維持濕潤。假手術(shù)組除了不夾閉外，其他實驗過程與腸道I/R組相同。所有手術(shù)過程均在無菌條件下進(jìn)行。所有小鼠實驗結(jié)束后自心臟穿刺取血，3000×g離心10 min后取上層血清，液氮冷凍，轉(zhuǎn)移至-80℃保存。小鼠被處死后，其他組織包括腦、心、肺、肝、回腸、空腸、腎臟和內(nèi)臟脂肪，分別存貯于-80℃冰箱。

酶聯(lián)免疫吸附實驗法檢測chemerin濃度 取適量組織塊，于預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)(0．01 mol/L，pH 7．0～7．2)中清洗去除血液后，移入玻璃勻漿器，加入5～10 ml預(yù)冷PBS充分研磨，研磨過程在冰上進(jìn)行。勻漿液研磨充分后于5000×g離心5 min，留取上清液。分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔、空白孔。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔7孔，依次加入100 μl不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品。空白孔加100 μl，余孔加待測樣品100 μl或者血清20 μl，酶標(biāo)板加上覆膜，37℃溫育2 h。棄去液體，甩干。每孔加檢測溶液A工作液100 μl，酶標(biāo)板加上覆膜，37℃溫育1 h。棄去孔內(nèi)液體，每孔用350 μl的洗滌液洗滌，浸泡1～2 min，吸去酶標(biāo)板內(nèi)的液體，在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下，輕拍將孔內(nèi)液體拍干，重復(fù)洗板3次。最后一次洗滌后，把孔內(nèi)的洗滌液完全甩干。每孔加檢測溶液B工作液100 μl，加上覆膜，37℃溫育30 min。棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每孔加底物溶液90 μl，酶標(biāo)板加上覆膜，37℃避光顯色，每孔加終止溶液50 μl，終止反應(yīng)，確保酶標(biāo)板底無水滴及孔內(nèi)無氣泡，立即用酶標(biāo)儀在450 nm波長測量各孔的光密度(optical density，OD)值。各標(biāo)準(zhǔn)品及樣本OD值扣除空白孔OD值后作圖，復(fù)孔取其平均值計算。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)，OD值為橫坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品OD值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù)，算出樣品的實際濃度。

Western blot法檢測chemerin的表達(dá) 將組織置于1～2 ml勻漿器中，用剪刀將組織盡量剪碎。加入100 μl裂解液于勻漿器中，裂解30 min后，將裂解液移至1．5 ml離心管中，在4℃ 10 800×g離心5 min。取上清液。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合后放入沸水浴中10 min。配置上層濃縮膠和下層分離膠。將配好的凝膠取出，放入電泳槽，加入10×電泳液。按照一定順序?qū)⒔M織樣品加入凝膠孔中。每個孔上樣50 μg。電壓 80 V，恒壓模式電泳 15 min，待到標(biāo)記物(marker)濃縮成一條均勻直線后，將電壓調(diào)到恒壓140 V，觀察標(biāo)記物(marker)，直至條帶電泳到分離膠底部。取出凝膠，將上層濃縮膠切去扔掉，留下下層分離膠。將PVDF膜裁成合適大小進(jìn)行轉(zhuǎn)膜后，取出PVDF膜，做好正反標(biāo)記，找到標(biāo)記物(marker)所在位置，根據(jù)目標(biāo)蛋白相對分子質(zhì)量大小，剪下目標(biāo)蛋白附近的膜。用Tris-鹽酸緩沖鹽溶液洗膜3次，放在5%脫脂牛奶中封閉膜。1∶1000的一抗孵育過夜，然后Tris-鹽酸緩沖鹽溶液洗3次，每次5 min。孵育二抗，40 min，室溫?fù)u床，然后Tris-鹽酸緩沖鹽溶液洗3次，每次5 min。曝光:配置反應(yīng)液，均勻滴在整個PVDF膜上，覆蓋到全部膜，放入曝光機(jī)，電腦操作，曝光。

統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19．0統(tǒng)計軟件分析，連續(xù)性變量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述。對于符合正態(tài)分布且方差齊性的計量資料，采用獨立樣本t檢驗。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

正常小鼠各臟器chemerin的表達(dá) 在各個器官表達(dá)分布中，內(nèi)臟脂肪、腎臟和肝臟表達(dá)相對較高，回腸和空腸表達(dá)較低(圖1)。

腸道I/R對各臟器chemerin蛋白表達(dá)的影響 腸道I/R損傷后，各組織器官chemerin濃度與假手術(shù)組比較，均顯著增高(P＜0．05)(圖2)。Western blot檢測I/R和假手術(shù)組之間chemerin的蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，I/R后肺臟、肝臟、腎臟、回腸、空腸、內(nèi)臟脂肪的chemerin表達(dá)較對照組顯著升高(P＜0．05)(圖3)。

圖1 chemerin在正常小鼠各臟器的表達(dá)分布Fig 1 Expression of chemerin in normal mice

圖2 酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測I/R對各臟器chemerin濃度的影響Fig 2 Changes of chemerin in various tissues and serum after intestinal I/R，which were determined by enzyme-linked immunosorbent assay

圖3 Western blot檢測各臟器chemerin蛋白表達(dá)Fig 3 Changes of chemerin expression in different tissues after I/R，protein expression was measured by Western blot

討論

chemerin是新發(fā)現(xiàn)的脂肪細(xì)胞因子，其生理作用主要通過與趨化因子樣受體1(chemeokine like receptor 1，CMKLR1)結(jié)合而實現(xiàn)［8］。chemerin與CMKLR1結(jié)合后，通過趨化Gi/o亞型G蛋白，抑制環(huán)腺苷酸和絲裂原活化蛋白激酶細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1信號通路，激活鈣通道，鈣離子內(nèi)流增加［9］。有研究表明chemerin在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的患者中，chemerin水平高于正常［10］。在牛皮癬、動脈粥樣硬化、多發(fā)性硬化等慢性疾病中，血清或炎癥病灶中的chemerin和其受體水平也升高［11-13］，表明 chemerin具有致炎作用。chemerin致炎作用的機(jī)制可能與 chemerin趨化chemR23受體的抗原提成細(xì)胞(樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)向炎癥部位遷移有關(guān)［14］。然而，另有研究表明chemerin可能具有抗炎作用。Cash等［14］在小鼠腹腔內(nèi)注射重組chemerin，發(fā)現(xiàn)注射后由酵母聚糖誘發(fā)的腹膜炎減輕，中性粒細(xì)胞聚集增加70%，提示chemerin對于腹膜炎具有保護(hù)作用。Luangsay等［15］的研究表明，chemerin可以減少由脂多糖誘導(dǎo)產(chǎn)生的炎性介質(zhì)腫瘤壞死因子-α、白介素-6的數(shù)量，炎癥部位的嗜中性粒細(xì)胞浸潤減少，提示 chemerin的抗炎作用。chemerin在炎癥反應(yīng)中的雙向作用可能是因為酶切位置的不同［16］，巨噬細(xì)胞分泌的半胱氨酸蛋白酶產(chǎn)生的chemerin具有抗炎作用，中性粒細(xì)胞分泌的絲氨酸蛋白酶產(chǎn)生的chemerin具有致炎作用。除了與炎癥密切相關(guān)外，chemerin還與氧化損傷有關(guān)。Fulop等［5］的研究表明，非糖尿病肥胖患者的血清中chemerin與氧化性低密度脂蛋白呈正相關(guān)，chemerin與抗氧化物質(zhì)對氧磷酶1-芳基酯酶呈負(fù)相關(guān)，表明chemerin參與介導(dǎo)氧化損傷。Shen等［17］用chemerin干預(yù)人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞，結(jié)果細(xì)胞內(nèi)線粒體活性氧簇增加，同時用短發(fā)夾核糖核酸沉默chemerin受體后，線粒體活性氧簇減少，表明 chemerin增加細(xì)胞內(nèi)氧化性物質(zhì)產(chǎn)生。Chemerin在炎癥中的雙向作用目前已成為臨床研究者關(guān)注的熱點。

本研究應(yīng)用小鼠腸道I/R模型，觀察腸道I/R損傷對chemerin的影響。目前認(rèn)為，I/R損傷的機(jī)制為無菌性炎癥反應(yīng)和氧化損傷。本研究結(jié)果顯示，chemerin在正常小鼠體內(nèi)各組織中均有表達(dá)，其中內(nèi)臟脂肪、腎臟、肝臟等組織器官表達(dá)較高，在空腸和回腸中表達(dá)相對較低，表明chemerin的組織器官特異性。在腸道I/R以后，小鼠體內(nèi)各組織器官chemerin的濃度均顯著升高，表明chemerin在腸道I/R時具有促進(jìn)炎癥的作用，而不是抗炎作用。其中在腸道I/R組的chemerin均值與假手術(shù)組的chemerin均值的差值中，空腸組織的差值是最大的，這可能是由于腸道I/R阻斷的是腸系膜上動脈的血流，而腸系膜上動脈主要供應(yīng)空腸和回腸的血流，因此空腸和回腸部分的炎癥反應(yīng)和氧化損傷最強(qiáng)烈，而其他器官的炎癥反應(yīng)和氧化損傷是繼發(fā)于腸道的。由于ELISA敏感性較高，特異性沒有Western blot強(qiáng)，本研究部分組織的Western blot結(jié)果顯示chemerin的表達(dá)結(jié)果與ELISA趨勢一致，即I/R組的chemerin表達(dá)較假手術(shù)組顯著升高。將各器官的I/R組與假手術(shù)組的chemerin平均值做差值，發(fā)現(xiàn)空腸組織的差值最大，這也進(jìn)一步驗證了ELISA的結(jié)果。脂肪組織Western blot條帶顏色整體最深，原因是chemerin在脂肪組織高表達(dá)。

綜上，本研究結(jié)果顯示，腸道I/R損傷時小鼠各組織器官的chemerin水平升高。一方面可能是腸道I/R時激活體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，使chemerin增加，趨化巨噬細(xì)胞等向炎癥灶遷移;另一方面可能是由于腸道I/R引發(fā)的氧化損傷需要通過chemerin來介導(dǎo)。其具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

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Effect of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury on the Expression of Chemerin in Mice

ZHU Qian-kun，HE Gui-zhen，LI Hai-long

Department of Parenteral and Enteral Nutrition，PUMC Hospital，CAMS and PUMC，Beijing 100730，China

Objective To investigate the effect of intestinal ischemia-reperfusion on the protein expression of chemerin in C57BL/6J mice．Methods A total of 16 mice(C57BL/6J，specific pathogen free level)were randomly assigned into two groups(n=8 each):the intestinal ischemia-reperfusion group and the sham group．The intestinal ischemia-reperfusion state was achieved by blocking the super-mesenteric artery．After 60 minutes of ischemia followed by 60 minutes of reperfusion，we determined the protein level of chemerin in various organs and tissues by enzyme-linked immunosorbent assay and Western blot．The sham group underwent the same operation process except for the blocking of the super-mesenteric artery．Result The protein level of chemerin was significantly elevated in distinctive organs and tissues in the state of intestinal ischemia-reperfusion(P＜0．05)．Conclusion The intestinal ischemia-reperfusion can remarkably increase the protein expression of chemerin in some organs and tissues．

intestinal ischemia-reperfusion;chemerin;adipocytokine;inflammation;oxidative damage

HE Gui-zhen Tel:010-69154096，E-mail:hgzpumc@126．com

R656．7

A

1000-503X(2015)04-0440-06

10．3881/j．issn．1000-503X．2015．04．013

2015-02-09)

何桂珍 電話:010-69154096，電子郵件:hgzpumc@126．com

國家自然科學(xué)基金(30940069)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China(30940069)