姜黃素對阿爾茨海默病細胞模型miRNA106a的影響

喬娜娜 王運良

1）濰坊醫(yī)學院2011級神經(jīng)病學研究生 濰坊 261053 2）解放軍第148中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 淄博 255300

姜黃素對阿爾茨海默病細胞模型miRNA106a的影響

喬娜娜1）王運良2）

1）濰坊醫(yī)學院2011級神經(jīng)病學研究生 濰坊 261053 2）解放軍第148中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 淄博 255300

目的 探討阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）中姜黃素與miR-106a的關(guān)系。方法 將PC12細胞隨機分為5組：正常對照組（PC12細胞組），模型組（PC12細胞與濃度為4μg／mL的Aβ1-42共培養(yǎng)24h），anti-miR-106a組（造模成功后轉(zhuǎn)染anti-miR-106a），姜黃素組（造模成功后加姜黃素，終濃度為20μmol／L）、共同作用組（anti-miR-106a加入姜黃素）。RT-PCR檢測miR-106a的含量；Western blotting檢測APP的含量。結(jié)果 RT-PCR結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組和anti-miR-106a組miR-106a含量均明顯降低（P＜0.05），而姜黃素組明顯升高（P＜0.05）。Western blotting結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組（P＜0.05）和anti-miR-106a組（P＜0.01）APP明顯增加，姜黃素組APP比模型組明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論 姜黃素可通過正性調(diào)節(jié)miR-106a而參與AD的治療。

姜黃素；miR-106a；anti-miR-106a；阿爾茨海默病

阿爾茨海默?。ˋD）是一種老年性神經(jīng)變性疾病，病情進行性加重，主要表現(xiàn)病理為細胞外淀粉樣沉積、神經(jīng)纖維纏結(jié)和神經(jīng)元缺失。Aβ（β-amyloid protein，Aβ）沉積被認為是AD的始發(fā)因素［1］。Aβ是經(jīng)APP轉(zhuǎn)化而來，APP是一種廣泛存在于全身組織細胞、具有膜受體蛋白樣的跨膜糖蛋白，表達增加會加重AD的發(fā)生。近年來微小RNA（microRNA，miRNA）對AD的作用引起人們的廣泛關(guān)注而成為研究的熱點。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA106a［2］在AD患者含量降低約50％，且能夠上調(diào)APP mRNA的表達，增加APP的產(chǎn)生，利于AD的發(fā)生。如果能減少轉(zhuǎn)化為Aβ的APP的產(chǎn)生，在某些程度能夠減少Aβ的產(chǎn)生和沉積，從而減緩AD的發(fā)生。

在AD治療的過程中，發(fā)現(xiàn)酚性色素姜黃素可能對AD的治療有幫助。姜黃素最初作為一種食物廣泛用于印度等亞洲國家人們的生活中，流行病學研究發(fā)現(xiàn)在70～79歲的印度老年人AD的發(fā)病率較同齡歐美人低4.4倍。根據(jù)國內(nèi)外報道，迄今為止臨床及實驗室應用姜黃素尚未發(fā)現(xiàn)明顯的不良反應，因而與非甾體抗炎藥和其他抗氧化藥物相比，姜黃素有可能成為治療AD的安全、有效的新舉措之一。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能抑制Aβ的產(chǎn)生，但這種抑制作用是否與miRNA106a降低相關(guān)還不清楚?；谝陨显?，我們對姜黃素與miRNA106a的關(guān)系進行探討，目的是探索姜黃素對AD的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞 PC12細胞（腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞），由軍事醫(yī)學科學院惠贈。細胞在含5％胎牛血清、10％馬血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，放在5％進行CO2、37℃的培養(yǎng)箱，隔天半量換液，當細胞融合度＞80％時接種傳代。按2×105個／mL的密度接種在96孔板中，按5×104個／mL的密度接種在24孔板中，貼壁生長12h后觀察細胞生長狀態(tài)，以細胞圓形、貼壁較好，顯微鏡下細胞透亮度可的細胞為正常細胞，可以用于實驗，隨機（按隨機數(shù)字表法）分為正常對照組、模型組、anti-miR-106a組、姜黃素組和共同作用組，每組6個復孔。

1.2 實驗藥物與試劑 Aβ1-42、姜黃素、DMSO溶液、2.5％胰酶、4％多聚甲醛、Lipofectamine 2000（Sigma公司）、DMEM、胎牛血清、馬血清（GIBCO公司）、DAB顯色液（北京索萊寶科技有限公司）、PCR試劑盒、CCK-8試劑（Invitrogen公司）、anti-miRNA106a（南京金思特科技有限公司）、APP抗體（北京中杉金橋）。

1.3 主要儀器 細胞培養(yǎng)箱（HSX-150，上海）、倒置顯微鏡（尼康Ti-E／U／S，日本）、多功能酶標儀（Berthold，德國）、離心機（CHRIST，德國）、凝膠成像系統(tǒng)（analytikjena，德國）、熒光定量PCR儀（Eppendorf公司，德國）。

1.4 細胞模型的建立 首先用無菌蒸餾水將粉末狀的Aβ1-42溶解，配成5mg／mL，密封后-20℃保存。使用前用1×PBS稀釋成1mg／mL，于37℃培養(yǎng)箱中孵育24h，使其變?yōu)榫奂癄顟B(tài)的Aβ1-42。然后用微量加樣器加入Aβ1-42（終濃度為4μg／mL），繼續(xù)培養(yǎng)24h。

1.5 分組及處理 正常對照組：PC12細胞正常培養(yǎng)；B模型組：加入Aβ1-42使終濃度為4μg／mL培養(yǎng)24h；anti-miR-106a組：Aβ1-42培養(yǎng)24h后按照Lipofectamine 2000說明書進行瞬時轉(zhuǎn)染miRNA106a；姜黃素組：Aβ1-42培養(yǎng)24h后加入姜黃素（終濃度為20μmol／L）培養(yǎng)48h；共同作用組：姜黃素和anti-miR-106a同時作用與模型組。

1.6 觀察指標

1.6.1 觀察細胞生長狀態(tài)：觀察96孔板中PC12細胞，培養(yǎng)結(jié)束后放于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、數(shù)量。

1.6.2 RT-PCR檢測miR-106a水平：檢測24孔板中PC12細胞，培養(yǎng)結(jié)束后吸出培養(yǎng)基，利用RNA提取試劑盒一步法提取總RNA，建立熒光定量PCR反應體系，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄、擴增后檢測使用凝膠分析系統(tǒng)軟件掃描，以各條帶的灰度值／內(nèi)參照灰度值的比值進mRNA表達的半定量分析。其中miR-106a上游引物序列CGGCAAAGTGCTAAC AGT，下游引物序列GTGCAGG GTCCGAGGT；U6內(nèi)參上游引物序列ATTGGAACGATACAGAGAAG ATT，下游引物序列GGAACGCTTCA CGAATTTG。反應條件：95℃30min，92℃12s，62℃55s，40個循環(huán)，熒光定量RQ＝2-△△CT計算。1.6.3 Western blot方法檢測APP水平：抽提PC12細胞，用RIPA裂解液（50mM Tris-HCl（pH 7.4），150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS）在冰上裂解，離心取上清液即蛋白質(zhì)，按照Western blot說明書進行，其中一抗為兔抗鼠APP，二抗為山羊抗兔IgG辣根過氧化物酶抗體，應用LAS-4000型熒光／化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)進行顯像，通過計算APP與β-actin光密度的比值反映各組中APP的表達變化。

1.7 統(tǒng)計分析 計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，組間比較用方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。圖表繪制由Excel2003統(tǒng)計軟件完成。

2 結(jié)果

2.1 PC12細胞觀察及活性檢測 培養(yǎng)PC12細胞，接種12h后細胞貼壁良好，細胞圓形飽滿，透光度好。加入已孵育好的終濃度為4μg／mL的Aβ1-42處理24h后，可見細胞數(shù)量減少、體積變小、貼壁性減弱，懸浮細胞較多；anti-miR-106a 組PC12細胞基本同模型組；姜黃素組中PC12細胞數(shù)量明顯增加，形態(tài)飽滿；共同作用組細胞數(shù)量介于姜黃素組合模型素組之間，部分細胞細胞膜出現(xiàn)皺縮。詳見圖1。

圖1 各組中PC12細胞顯微鏡下觀察

A（正常對照組）中細胞數(shù)量較多，貼壁較好，形態(tài)飽滿；B（模型組）中細胞數(shù)量減少，體積減小，細胞膜出現(xiàn)皺縮；C（anti-miR-106a組）中細胞與模型組中差別不大；D（姜黃素組）中細胞數(shù)量較正常對照組稍多，形態(tài)相似；E（共同作用組）中細胞數(shù)量介于圖片B、E中細胞數(shù)量之間，部分細胞出現(xiàn)細胞膜皺縮

2.2 各組PC12細胞miR-106a檢測RT-PCR檢測 各組中miR-106a，與正常對照組miR-106a相比，模型組和anti-miR-106a組均明顯降低（P＜0.05），而姜黃素組明顯升高（P＜0.01），共同作用組無明顯差異（P＞0.05）。見圖2。

圖2 各組PC12細胞中miR-106a相對值

2.3 細胞APP水平檢測 與正常對照組APP相比，模型組（P＜0.05）和anti-miR-106a組明顯增加（P＜0.01），姜黃素組APP與模型組相比明顯降低（P＜0.01），共同作用組與模型組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 各組PC12細胞中APP相對值

3 討論

阿爾茨海默病是老年癡呆發(fā)病率最高的疾病，預計2050年以后，全球阿爾茨海默病的患病率是目前的4倍，嚴重危害老年人身心健康，也給家庭和社會帶來沉重負擔。在對AD患者的研究中，發(fā)現(xiàn)許多miRNAs參與了APP和淀粉樣前體蛋白裂解酶1（BACE1）表達的調(diào)節(jié)，在AD患者腦中含量降低。尸檢分析顯示，AD大腦中BACE1表達上調(diào)是在蛋白質(zhì)水平，而不是在mRNA水平［3］。轉(zhuǎn)基因小鼠過表達miR-29c可減少BACE1蛋白的水平［4］。這些發(fā)現(xiàn)對miRNA的表達與AD發(fā)病因果關(guān)系提供了支持，不難想象特異性miRNA的缺失可導致散發(fā)性AD患者腦組織BACE1和Aβ表達增加，直接通過毒性Aβ的形成，參與AD的發(fā)病機制。由此可見，AD的發(fā)病與異常表達的miRNA密切相關(guān)。如果某種藥物能夠有效調(diào)節(jié)正常人中miRNA的表達，或是調(diào)節(jié)AD患者miRNA的表達趨于正常，將對AD領(lǐng)域的預防或治療產(chǎn)生不可估量的影響。

本實驗著重于對姜黃素作用的研究，實驗室前期已完成姜黃素干預AD動物模型的實驗［5］，發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠調(diào)節(jié)海馬內(nèi)小膠質(zhì)細胞標記物、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）以及調(diào)控凋亡相關(guān)基因Bax和Bcl-2，塌陷反應介導蛋白-2（CRMP-2）、P-CRMP-2及軸突蛋白的表達。Ahmed等［6］在實驗中也同樣發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠明顯降低海馬中膠質(zhì)纖維酸性蛋白、caspase-3的水平，說明姜黃素在炎癥和凋亡層面上參與AD的治療。本實驗研究結(jié)果顯示，miR-106a表達與APP呈負相關(guān)，姜黃素能夠調(diào)節(jié)miR-106a含量增加，減少APP產(chǎn)生，而在anti-miR-106a存在的情況下，姜黃素的這種作用幾乎完全喪失，說明姜黃素對APP的調(diào)節(jié)是通過調(diào)節(jié)miR-106a來實現(xiàn)的。

我們的實驗也存在某些局限，首先姜黃素的低水溶性對實驗有一定程度的限制，可以采用姜黃素類似物解決溶解度問題；其次是設(shè)立的姜黃素濃度組較少，對姜黃素的最佳濃度缺乏進一步研究；最后，如果有miR-106a促進劑的加入，能夠促進姜黃素的作用，將更能表明姜黃素在AD中對miR-106a的調(diào)節(jié)作用，增強姜黃素治療AD的說服力。

［1］Hardy J，Selkoe DJ.The amyloid hypothesis of Alzheimer＇s disease：progress and problems on the road to therapeutics［J］.Science，2002，297（5 580）：353-356.

［2］Patel N，Hoang D，Miller N，et al.MicroRNAs can regulate human APP levels［J］.Mol Neurodegener，2008，3（1）：1 016.

［3］Hébert SS，HorréK，Nicola L，et al.MicroRNA regulation of Alzheimer＇s Amyloid precursor protein expression［J］.Neurobiol Dis，2009，33（3）：422-428.

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［5］Wang Y，Yin H，Wang L，et al.Curcumin as a potential treatment for Alzheimer＇s disease：a study of the effects of curcumin on hippocampal expression of glial fibrillary acidic protein［J］.Am J Chin Med，2013，41（1）：59-70.

［6］Ahmed T，Gilani AH.A comparative study of curcuminoids to measure their effect on inflammatory and apoptotic gene expression in an Aβplus ibotenic acid-infused rat model of Alzheimer＇s disease［J］.Brain Res，2011，11（1 400）：1-18.

（收稿2014-05-12）

Effects of curcumin on miRNA106a in the cell model of Alzheimer＇s disease

Qiao Nana*，Wang Yunliang
*The Class of2011 Neurology Graduate Student of Weifang Medical School，Weifang201053，China

Objective To investigate the relationship between curcumin and miR-106ain Alzheimer's disease.Methods PC12cells were randomly divided into 5groups，namely，normal control group，model group（cultured with 4μg／mL Abeta1-42for 24hours），anti-miR-106agroup（transfected with anti-miR-106a），curcumin group（adding 20μmol／L curcumin）and coaction group（adding curcumin and anti-miR-106a）.The miR-106acontent of each group was detected by RT-PCR and APP content was detected by Western blotting.Results RT-PCR showed that the concentration of miR-106adecreased significantly in model group and anti-miR-106agroup but increased markedly in curcumin group compared with normal control group.Western-blotting showed that the APP content increased significantly in APP model group and anti-miR-106agroup but decreased markedly in curcumin group compared with normal control group.Conclusion Curcumin maybe positively regulate miR-106ain alzheimer's disease.

Curcumin；miR-106a；Anti-miR-106a；Alzheimer's disease

R749.1+6

A

1673-5110（2015）02-0041-03