比色法測定木通屬植物總皂苷含量的研究

高 偉 ，李 遵 ，段偉華 ，幸偉年 ，占志勇 ，孫 穎 ，龔 春 ，彭以元

（1.江西師范大學(xué)，江西 南昌 330022；2. 江西省林業(yè)科學(xué)院，江西 南昌 330013；3.江西省林業(yè)科技實驗中心，江西 信豐 341616）

比色法測定木通屬植物總皂苷含量的研究

高 偉1，2，李 遵3，段偉華2，幸偉年2，占志勇2，孫 穎2，龔 春2，彭以元1

（1.江西師范大學(xué)，江西 南昌 330022；2. 江西省林業(yè)科學(xué)院，江西 南昌 330013；3.江西省林業(yè)科技實驗中心，江西 信豐 341616）

以江西、湖南、湖北、四川，安徽五省的40份木通植物為試材，采用比色法建立木通屬植物總皂苷含量的測定方法，并測定其木通藤莖中總皂苷的含量。結(jié)果表明：（1）采用甲醇超聲波提取，再用大孔吸附樹脂吸附，最后用水飽和的正丁醇萃取來制備樣品，可以完整提取木通總皂苷；以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)物進行木通皂苷的定量測定方法適合于大量木通試樣的分析。（2）分析結(jié)果表明白木通總皂苷含量最大，江西地區(qū)適合進行選育高含量木通皂苷的木通品種。

木通皂苷；白木通；江西

木通藤是雙子葉植物的木通科植物白木通或三葉木通、木通（五葉木通）的木質(zhì)莖。作為藥用品種的主要是木通、三葉木通及其變種白木通[1]。中醫(yī)藥理論認(rèn)為，木通味苦，性寒，具有清熱利尿，活血通脈，抗菌消炎之功效，主治小便短赤，淋濁，水腫，風(fēng)濕痹痛，乳汁不通，痛經(jīng)等癥[2]。有文獻報道鴨芹的鈣含量為212.25 mg/100g[3]，而三葉木通鈣含量比之更高，是補鈣良藥。近來研究發(fā)現(xiàn)，木通的這些藥用價值可能與其所含的皂苷密切相關(guān)。目前對木通皂苷的研究主要集中在皂苷的藥理作用及其結(jié)構(gòu)的鑒定[4-9]，也有研究植物內(nèi)基因表達對皂苷含量的影響[10-11]，而對木通中總皂苷進行定量測定鮮見報道。在測量植物總皂苷含量時，采用香草醛－硫酸為顯色劑，一般會存在穩(wěn)定性差、顯色不完全的問題，而香草醛——高氯酸顯色體系能夠顯色完全，不受糖類干擾。所以本文以香草醛——冰醋酸——高氯酸為顯色體系，測定木通總皂苷含量[12]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

紫外分光光度計（島津 UV2550 ）；電熱恒溫水浴鍋（國華電器有限公司 HH-6）；電子分析天平（賽多利斯 ME5）；電熱恒溫水槽；粉碎機；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠 RE-52A）；大孔樹脂柱(內(nèi)徑0.8 cm，長20 cm)。

齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院 批號110709-201206 含量＞98%）；大孔樹脂DM-301；無水甲醇、無水乙醇、正丁醇、冰醋酸、高氯酸和香草醛等均為分析純。木通屬植物材料40份，分別采自江西、安徽、湖南、湖北和四川。

1.2 實驗方法

1.2.1 對照品溶液制備

稱取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院 批號110709-201206 含量＞98%）13.95 mg于10 mL容量瓶中，甲醇溶解定容，制成溶液A（濃度為1.395 mg/mL）；取溶液A 5 mL于25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度線，制成溶液B（濃度為0.279 mg/mL）。

1.2.2 樣品溶液制備

1）新鮮木通藤莖清洗晾干表面水后貯于通風(fēng)干燥處，至含水量6 %時，制成粉末。用4號篩（篩孔內(nèi)徑：250 μm±9.9 μm ，65 目）取粉末 0.4 g，置于100 mL錐形瓶中，稱重。

2）用50 mL甲醇萃取，超聲波輔助提取1 h，過濾，精確取濾液25 mL于蒸發(fā)皿中，水浴蒸干。

3）水溶解殘留物所得溶液經(jīng)大孔吸附樹脂柱(徑高比1：5)洗脫：先以水沖洗大孔樹脂，棄去沖洗水；再以95 %乙醇洗脫，水浴蒸干乙醇洗脫液。

4）25 mL 水分5次將殘留物溶解并轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，以20 mL水飽和的正丁醇萃取4次，收集合并正丁醇層，減壓蒸干。用70 %甲醇將殘留物溶解轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，定容，搖勻，即得樣品液。

1.2.3 測定方法與測定波長

本實驗采用比色法，顯色條件為5%香草醛-冰醋酸（香草醛5克，加冰醋酸溶解成100 mL，即得，臨用新配，下同，稱溶液C）0.3 mL、高氯酸（溶液D）用量0.7 mL、顯色時間25 min、顯色溫度50 ℃，以5 mL冰醋酸終止反應(yīng)。

本實驗采用的測定波長為560 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)樣選擇

研究指出，木通屬植物皂苷的主要化學(xué)成分為齊墩果烷型的五環(huán)三萜皂苷。木通皂苷的結(jié)構(gòu)單元苷元主要是從齊墩果酸的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上氧化為去甲常春藤皂苷元、常春藤皂苷元、去甲阿江欖仁酸、阿江欖仁酸等4種皂苷元[13]。中國藥典已經(jīng)有用液相法測定木通中的齊墩果酸含量的標(biāo)準(zhǔn)，證明木通藤含有一定量的齊墩果酸，而齊墩果酸也是皂苷類成分，用它作對照品就更具代表性。因此本實驗選擇齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)物進行含量測定。

2.2 顯色條件與測定波長

甾體皂苷分子與濃硫酸、高氯酸等強氧化酸反應(yīng)后，因分子內(nèi)發(fā)生脫羧、氧化、脫水、及形成碳正離子等原因，使皂苷分子在200～600 nm范圍內(nèi)出現(xiàn)一定強度的吸收,常運用這一反應(yīng)來定量皂苷的含量[14-15]。本實驗利用甾體皂苷結(jié)構(gòu)單元之一的齊墩果酸與顯色劑發(fā)生顯色反應(yīng)，通過分光光度計測定木通屬植物的總皂苷含量。其中，反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度及顯色劑用量是影響顯色的關(guān)鍵。在預(yù)實驗過程，采用單因素實驗設(shè)計對反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、顯色劑用量進行優(yōu)化，最終確定5%香草醛-冰醋酸0.3 mL、高氯酸用量0.7 mL、顯色時間25 min、顯色溫度50 ℃為本實驗的最佳顯色條件。

本實驗中以齊墩果酸對照品溶液A的稀釋液為樣品在400～700 nm 波長范圍內(nèi)進行掃描，發(fā)現(xiàn)560 nm處有最大吸光度。同樣，發(fā)現(xiàn)供試品溶液也在560 nm波長處吸光度最大（圖1），故確定測定波長為560 nm。

圖1 齊墩果酸對照品溶液掃描圖Fig.1 The sscannogram of Oleanolic acid reference substance solution

2.3 皂苷提取方法確定

索氏抽提法為皂苷含量的常用方法，但對皂苷不能抽提完全且操作繁瑣、過程費時，難以滿足大批量樣品的統(tǒng)一測定。

本實驗中以甲醇超聲波后的樣品殘渣為對象，進行皂苷含量檢測，結(jié)果表明甲醇超聲波1 h后的樣品殘渣中未檢出皂苷含量（表1）。表明以甲醇超聲波提取1小時后，再通過大孔吸附樹脂吸附，進而用水飽和正丁醇萃取的方法能完全將木通中的皂苷提取出來。

表1 甲醇超聲波處理樣品后吸光度檢測數(shù)據(jù)Table 1 Absorbance detection data after ultrasonic processing sample with methanol

2.4 線性關(guān)系考查

于5支10 mL具塞試管中精確取置齊墩果酸對照品溶液A各0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，水浴蒸干，加溶液C 0.3 mL，溶液D 0.7 mL，于50℃水浴顯色25 min后，冰浴冷卻15 min。冰醋酸5 mL以終止反應(yīng)。以溶液C 0.3 mL，溶液D 0.7 mL及5 mL冰醋酸混合溶液為空白，每個樣品測定吸光度3次，取其平均值。

表2 回歸曲線數(shù)據(jù)Table 2 The regression curve data

以試管中皂苷的質(zhì)量濃度為自變量，測定的吸光度為因變量，標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程分別為：y= 1.430 1x+0.012 8，R2=0.998 5，表明該方程適合木通總皂苷含量的測定。

2.5 精密度、穩(wěn)定性及加樣回收實驗

1）精密度實驗

新鮮木通藤莖清洗晾干表面水后貯于通風(fēng)干燥處，按照1.2.2方法平行制定5份樣品溶液，每份樣品吸取2.0 mL，按照1.2.3所述測定方法，進行顯色反應(yīng)測定吸光度。通過精密度實驗，對平行制定的5份樣品溶液進行測量（數(shù)據(jù)見表3），各結(jié)果之間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于1%，表明儀器精密度良好。

表3 精密度實驗數(shù)據(jù)Table 3 The precision of the experimental data

2）穩(wěn)定性實驗

取齊墩果酸對照品溶液B6份，每份2.0 mL，分別靜置1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h后，按照1.2.3所述測定方法，進行吸光度測定。6份對照品在靜置不同時間段后，各份樣品之間的吸光度（數(shù)據(jù)見表4）相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于0.5%，表明對照品溶液在10 h之內(nèi)穩(wěn)定。

表4 穩(wěn)定性實驗數(shù)據(jù)Table 4 Stability of the experimental data

3）加樣回收實驗

精確稱取已知含量木通粉末0.4 g，9份，隨機分3組，按照供試品溶液制備方法制備樣品液。各于3組樣品液5 mL中分別加入0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL對照溶液B，進行吸光度測定，并計算回收率。

加樣回收實驗的結(jié)果如表5所示。計算出齊墩果酸對照品的平均回收率分別為99.56 %，RSD為1.77 %。說明本法回收率好，方法可行。

表5 齊墩果酸對照品溶液加樣回收實驗結(jié)果Table 5 Oleanolic acid reference substance solution with sample recovery experiment results

2.6 木通樣品含量測定

本實驗提供40批木通藤粉末，分別稱重0.4 g（M）。按供試品溶液制備方法制備樣品溶液，精密取樣品溶液2 mL，置具塞試管中，水浴蒸干，加入溶液C 0.3 mL，溶液D 0.7 mL，50℃水浴顯色25 min后，冰浴冷卻15 min，加冰醋酸5 mL，以猝滅反應(yīng)，搖勻，測定吸收度A值，計算含量，結(jié)果見表6。

表6 各地區(qū)不同品種木通總皂苷含量Table 6 The total saponin content of different varieties among regions

3 結(jié)論與討論

總皂苷測定方法有很多種，各種測定方法各有特點，沉淀法會導(dǎo)致皂苷變質(zhì)，還會有雜質(zhì)存在；層析法誤差大，成本高；溶血指數(shù)法只適用于具有溶血作用的皂苷，雖然此方法簡單，快速；本實驗采用比色法測定木通屬植物總皂苷含量，該方法簡便，快捷，準(zhǔn)確，便于對木通藥材進行質(zhì)量控制。

皂苷因親水性較強，用氯仿、乙醚等提取率低，需要用微波輔助提取[16]，水飽和后正丁醇液極性增大，有利于提出皂苷類成分。由于水與正丁醇互溶度較大，將正丁醇加入水中進行提取操作時，兩相體積將發(fā)生變化，而正丁醇用水飽和后，兩相體積恒定，萃取操作兩相體積將不會變化，可準(zhǔn)確控制。而索氏抽提法為皂苷含量的常用方法，但對皂苷不能抽提完全且操作繁瑣、過程費時，難以滿足大批量樣品的統(tǒng)一測定。

木通皂苷的結(jié)構(gòu)單元苷元主要是從齊墩果酸的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上氧化為去甲常春藤皂苷元、常春藤皂苷元、去甲阿江欖仁酸、阿江欖仁酸等4種皂苷元[13]。通過實驗確定在560 nm處齊墩果酸對照品及供試品均具有最大吸光度，并且用齊墩果酸作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行總皂苷的測定，其回歸方程為：y= 1.430 1x+0.012 8，R2=0.998 5。

從表6可知：各地區(qū)白木通平均皂苷含量為1.23%，變異系數(shù)為0.70；三葉木通平均皂苷含量為0.98%，變異系數(shù)為0.22；五葉木通平均皂苷含量為1.11%，變異系數(shù)為0.20。由此可知白木通總皂苷含量最大，從各個地區(qū)的角度分析：江西地區(qū)木通總皂苷含量平均為1.27%，安徽為0.86%，湖南為0.75%，湖北為1.07%，以及四川的1.19%。江西地區(qū)及四川地區(qū)木通總皂苷相對較高。從結(jié)果可知，江西地區(qū)適合選育高含量木通皂苷的木通品種。

由此可知對40批次木通總皂苷含量測定測定結(jié)果表明，各批次之間含量接近，變異系數(shù)均不大，說明本實驗建立的分離提純方法是穩(wěn)定的。

試驗結(jié)果表明：該方法精密度、穩(wěn)定性較好，平均回收率為99.56%，回收率極差范圍為4.88%，可以用于木通藥材及木通制劑的質(zhì)量控制，適用于大批量木通藥材樣品中總皂苷含量的統(tǒng)一測定。

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Akebia plants total saponin content colorimetric determination method of research

GAOWei1,2, LI Zun3, DUAN Wei-hua2, XING Wei-nian2, ZHAN Zhi-yong2, SUN Ying2, GONG Chun2, PENG Yi-yuan1
(1. Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, Jiangxi, China; 2. Jiangxi Academy of Forestry, Nanchang 330013, Jiangxi, China;3. Jiangxi Forestry Science and Technology Experiment Center, Xinfeng 341616, Jiangxi, China)

Use colorimetric method to determine the content of total saponins in Akebia plants, and the determination of the jiangxi,hunan, hubei, sichuan, anhui 40 copies of akebia stem in the five provinces of total saponins content in the stem had been researched.The results are showed that： (1) Using methanol ultrasonic extraction, again with macroporous adsorption resin adsorption, the water saturation of n-butyl alcohol extraction to the preparation of samples, could complete extraction total saponins. With oleanolic acid as the standard content of akebia stem saponins quantitative determination method was suitable for a large number of akebia stem analysis of samples. (2) The analysis results showed that the maximum total saponin content was akebia trifoliata varaustralis, jiangxi area was suitable for breeding high content of akebia stem saponins of akebia stem varieties.

Akebia saponin, akebia trifoliata varaustralis, Jiangxi province

S781.41

A

1673-923X(2015)10-0134-04

10.14067/j.cnki.1673-923x.2015.10.023

2014-12-04

國家林業(yè)局2013年林業(yè)公益性行業(yè)科研專項“木通科特色蓇葖果良種選育及高效栽培技術(shù)研究”（201304802）

高 偉，碩士，助理研究員；E-mail：284256805@qq.com

高 偉，李 遵，段偉華，等. 比色法測定木通屬植物總皂苷含量的研究[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報，2015, 35(10)： 134-137, 146.

[本文編校：吳 彬]