柱前衍生-反相高效液相色譜法檢測富硒米曲霉中有機(jī)硒形態(tài)

李紅衛(wèi)，王開萍，吳 娛，唐正江，湯 飛，劉國慶,2,*

（1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.安徽省皖江禽產(chǎn)業(yè)研究院，安徽 宣城 242000）

柱前衍生-反相高效液相色譜法檢測富硒米曲霉中有機(jī)硒形態(tài)

李紅衛(wèi)1，王開萍1，吳 娛1，唐正江1，湯 飛1，劉國慶1,2,*

（1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.安徽省皖江禽產(chǎn)業(yè)研究院，安徽 宣城 242000）

建立高效液相色譜法測定富硒米曲霉中有機(jī)硒形態(tài)的分析方法。采用6 mol/L HCl溶液，50 ℃水解富硒米曲霉48 h，提取樣品中的有機(jī)硒，4-氯-3,5-二硝基三氟甲苯柱前衍生，C18反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）分離，以乙腈-水（1∶1，V/V）和pH 6.8乙酸-乙酸鈉緩沖液為流動相進(jìn)行梯度洗脫，紫外檢測波長：240 nm，測得富硒米曲霉中有機(jī)硒化合物主要是硒代胱氨酸，檢出限（RSN=3）為0.680 mg/L，定量限（RSN=10）為2.244 mg/L，線性范圍為5.0～100 mg/L，加標(biāo)回收率為94.8%～105.8%，硒代胱氨酸的含量為1.25 mg/g。本方法簡單、靈敏、重復(fù)性好，可適用于富硒米曲霉及相關(guān)產(chǎn)品中有機(jī)硒形態(tài)的檢測分析。

富硒米曲霉；有機(jī)硒；硒代氨基酸；柱前衍生-反相高效液相色譜法

硒是人和許多生物體必需的微量元素，對生物體的健康具有重大意義。市面上出現(xiàn)了許多富硒產(chǎn)品，如酵母硒、植物硒以及一些富硒食用菌等，其品質(zhì)的高低不僅取決于硒的含量，還與硒的形態(tài)有著密切關(guān)聯(lián)。研究[1-2]表明：無機(jī)硒生物活性、利用率較低，不易被腸道吸收，還具有一定毒性，攝入過量會導(dǎo)致急性、慢性中毒；與無機(jī)硒相比，有機(jī)硒是經(jīng)生物轉(zhuǎn)換而得，具有毒性小、生物利用度高的特點(diǎn)，并且硒的所有生物學(xué)功能均是通過硒蛋白來調(diào)控和實(shí)現(xiàn)的，因此有機(jī)硒相較于無機(jī)硒對生物體來說，更為重要。

米曲霉是一類產(chǎn)復(fù)合酶的菌株，除產(chǎn)蛋白酶外，還可產(chǎn)淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、植酸酶等，被廣泛應(yīng)用于食品、飼料、生產(chǎn)曲酸、釀酒等發(fā)酵工業(yè)，并已被安全地應(yīng)用1 000多年。潘艷[3]利用米曲霉作為富硒載體，在其培養(yǎng)基中加入無機(jī)硒，利用生物轉(zhuǎn)化將難吸收的無機(jī)硒源轉(zhuǎn)化為易吸收的有機(jī)硒源[4]，發(fā)酵生產(chǎn)富硒米曲霉，測得搖瓶發(fā)酵的富硒量達(dá)2.512 mg/g，分批發(fā)酵的富硒量更是高達(dá)3.3 mg/g，遠(yuǎn)高于富硒酵母的1.0～2.0 mg/g硒含量?，F(xiàn)階段關(guān)于富硒酵母、植物硒和一些其他富硒產(chǎn)品中硒形態(tài)[5-7]的研究已經(jīng)較為完善，但富硒米曲霉中硒形態(tài)的研究這一領(lǐng)域仍然比較缺乏，因此建立一種分析富硒米曲霉中硒形態(tài)及含量的方法，不僅可以為該領(lǐng)域的研究提供一定的理論依據(jù)，也對評價其營養(yǎng)價值具有重要意義。與此同時，還能夠?qū)﹂_發(fā)高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的富硒米曲霉保健品起促進(jìn)作用。

近些年來，國內(nèi)很多研究者對富硒樣品中硒的形態(tài)做了大量研究。陳尚衛(wèi)等[8]采用酶解提取法提取，氯甲酸乙酯衍生，氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（gas chromatographytandem mass spectrometry，GC-MS-MS）聯(lián)用法選擇離子模式對富硒酵母中的硒代蛋氨酸進(jìn)行檢測；劉揚(yáng)等[9]采用蛋白酶提取富硒酵母中的有機(jī)硒，高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜（high performance liquid chromatographyinductively coupled plasma mass spectrometry，HPLC-ΙCPMS）聯(lián)用法檢測其有機(jī)硒的形態(tài)；Deng Biyang等[10]采用稀酸提取，毛細(xì)管電泳-電化學(xué)發(fā)光（capillary electrophoresis coupled with electrochemiluminescence，CE-ECL）法檢測富硒酵母中硒代蛋氨酸；仲娜[11]采用微波消解法提取市場上出售的富硒大米、富硒茶葉、富硒螺旋藻、富硒大蔥、富硒雞蛋中的有機(jī)硒，HPLC-ΙCPMS測其硒形態(tài)。以上這些方法，HPLC-ΙCP-MS聯(lián)用儀器昂貴，普及度不高，樣品預(yù)處理繁瑣，分析成本較高；CE-ECL方法中電泳的重現(xiàn)性不高，影響定性定量結(jié)果。考慮到以上這些因素，并且目前關(guān)于富硒米曲霉中硒形態(tài)的研究也較少，本實(shí)驗(yàn)針對其硒形態(tài)的分析建立一種方法，采用酸水解法進(jìn)行樣品提取，并用4-氯-3,5-二硝基三氟甲苯（4-chlorine-3,5-dinitrobenzotrifl uoride，CNBF）對樣品提取液進(jìn)行衍生，衍生過后直接運(yùn)用反相高效液相色譜法對樣品中的有機(jī)硒化合物形態(tài)和含量進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

富硒米曲霉（硒含量2.325 mg/g） 實(shí)驗(yàn)室自制。

標(biāo)準(zhǔn)樣品：硒代甲硫氨酸（SeMet，98%，CAS：3211-76-5）、硒代胱氨酸（SeCys2，97%，CAS：29621-88-3） 美國Sigma公司；衍生劑：CNBF 美國阿拉丁公司；超純水、pH 7.0磷酸緩沖液、pH 9.0硼砂-硼酸緩沖液、pH 6.8乙酸-乙酸鈉（0.05 mol/L）緩沖液、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、0.08 mol/L NaOH、 6 mol/L HCl溶液。

1.2 儀器與設(shè)備

2695高效液相色譜儀配紫外檢測器 美國Waters公司；超微電子天平 德國Sartorius公司；SE812氮吹儀北京帥恩科技有限公司；DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；恒溫水浴鍋國華電器有限公司；HC-3518型高速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C型精度酸度計 上海大普儀器有限公司；WH-861型渦旋振蕩器 太倉市科教儀器廠；超聲波清洗器 昆山超聲波儀器有限公司。1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的配制

分別稱取適量的SeMet和SeCys2標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水制0.1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，溶液置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，保存期限一個月。

1.3.2 樣品預(yù)處理

準(zhǔn)確稱取0.3g經(jīng)液氮研磨的富硒米曲霉粉末4 份置于10 mL的離心管中，加入5 mL 6 mol/L HCl溶液，用氮?dú)獯?0 min后封口。一份在110℃條件下水解24 h，另外3 份在50℃條件下分別水解24、48、72 h。離心15 min后取上清液，用超純水定容至100 mL備用。

1.3.3 樣品的衍生

取3 mL樣品溶液，加入2 mL pH 9.0硼砂-硼酸緩沖液和100 μmol/mL的CBNF衍生劑2 mL，封口，在65 ℃水浴條件下衍生40 min，反應(yīng)結(jié)束后取出冷卻，放置至室溫，振蕩，用pH 7.0磷酸緩沖液定容至10 mL后振蕩30 s，再靜置10 min。用0.22 μm有機(jī)過濾器過濾至上機(jī)小瓶，待用。

分別取0.1 mL的SeMet和SeCys2標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液按照如上方法進(jìn)行衍生。其反應(yīng)機(jī)理[12]見圖1。

圖1 SeMet與CNBF（a）、SeCys2與CNBF（b）和CNBF自身水解（c）反應(yīng)機(jī)理圖Fig.1 (a) Reaction scheme of CNBF with amine groups on SeMet; (b) Reaction scheme of CNBF with amine groups in SeCys2; and (c) hydrolysis of CNBF reagent

1.3.4 色譜條件

色譜柱：We l c h U l t i m a t e C18反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A：乙腈-水（1∶1，V/V）；流動相B：0.05 mol/L，pH 6.8乙酸-乙酸鈉緩沖液；柱溫：31 ℃；檢測波長：240 nm；流速1.2 mL/min；梯度洗脫：0～25 min，65% A、35% B；25～30 min，75% A、25% B；30～34 min，90% A、10% B；34～40 min，100% A、0% B。

2 結(jié)果與分析

2.1 硒代氨基酸提取方法的選擇

富硒米曲霉中硒代氨基酸是有機(jī)硒的主要形式，而有機(jī)硒主要存在于蛋白中，故采用水解蛋白的方式提取富硒米曲霉中的硒代氨基酸。目前蛋白水解的方式主要以酸水解法為主，但是普通的酸水解條件為110 ℃條件下水解24 h，在該方法中甲硫氨酸、胱氨酸/半胱氨酸常常會遭到破壞，易造成損失[13]。郝素娥等[14]采用6 mol/L的HCl溶液，50℃水解50 h的方法提取富硒酵母中的硒化合物，有機(jī)硒提取率達(dá)到61.3%；唐瑩瑩等[15]用6 mol/L的HCl溶液提取富硒大米中的硒化合物，提取時間分別為24、48 h，相對應(yīng)的提取溫度為110 ℃和50 ℃。結(jié)果顯示50 ℃條件下提取48 h所得的硒化合物含量高于110 ℃條件下提取24 h的量。因此本實(shí)驗(yàn)預(yù)建立一種條件溫和且操作簡單的前處理水解法，即降低水解溫度對富硒米曲霉中的硒代氨基酸進(jìn)行提取，并且比較了不同水解時間條件下，有機(jī)硒的提取量，其結(jié)果見表1。

表1 富硒米曲霉中硒化合物的測定Table1 The contents of selenium compounds in selenium-enriched Aspergillus oryyzzaaee

由表1可知，4 種水解方法相比較而言，50 ℃、24 h的水解條件下，提取的SeCys2的量最低，僅為1.12 mg/g，推測可能是由于蛋白未水解徹底導(dǎo)致；50 ℃、72 h條件下的最高，為1.27 mg/g，比110 ℃水解24 h的1.18 mg/g高7.6%，并且略高于50℃、48 h條件下的1.25 mg/g，SeMet均未檢出。綜合考慮實(shí)驗(yàn)條件與實(shí)驗(yàn)時間，選取反應(yīng)條件較溫和，反應(yīng)時間較短的50℃、48 h為本實(shí)驗(yàn)的水解條件。

2.2 衍生條件的優(yōu)化

2.2.1 衍生劑的選擇

SeMet、SeCys2及大部分氨基酸本身并不能產(chǎn)生紫外吸收，必須經(jīng)過衍生化反應(yīng)，產(chǎn)生具有紫外吸收的衍生物才能被檢測。目前國內(nèi)外應(yīng)用較廣泛的衍生劑有鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）[16-17]、異硫氰酸苯酯（phenyl isothiocyanate，PΙTC）[18]、2,4-二硝基氟苯（dinitrofluorobenzene，DNFB）[19]、丹酰氯（Dansyl-Cl）[20]、6-氨基喹啉基-N-羥基-琥珀酰亞胺基甲酸酯（6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate，AQC）[21-22]、9-芴甲基氯甲酸酯[23-24]和CNBF等。

雖然衍生劑的種類很多，但沒有哪一種衍生劑能夠完全適合所有氨基酸的分析[25-27]。例如，OPA衍生法具有衍生步驟簡單、反應(yīng)速度快、剩余試劑不干擾測定等優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是只能與一級氨基酸反應(yīng)，二級氨基酸不能與其直接反；Dansyl-Cl法可同時檢測包括亞氨基酸在內(nèi)的所有氨基酸，缺點(diǎn)是流動相中的雜質(zhì)和衍生副產(chǎn)物對測定有干擾；DNFB法的優(yōu)點(diǎn)有衍生產(chǎn)物穩(wěn)定、操作簡便、成本低等，衍生產(chǎn)物由于硝基苯環(huán)的引入，有較強(qiáng)的紫外吸收，因此具有較高的靈敏度，缺點(diǎn)是衍生過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物干擾測定，限制了DNFB在氨基酸分析中的應(yīng)用；PΙTC法可同時測定伯氨酸和仲氨酸，衍生產(chǎn)物單一、穩(wěn)定，缺點(diǎn)是PΙTC毒性大，且極易損耗色譜柱壽命。CNBF衍生條件為65 ℃條件下衍生40 min，與以上衍生劑相比具有反應(yīng)條件溫和、衍生時間短、成本低等優(yōu)勢，因此本實(shí)驗(yàn)采用CNBF做衍生劑進(jìn)行硒代氨基酸的檢測。

2.2.2 衍生劑用量對衍生效率的影響

為使衍生反應(yīng)完全，一般需要加入過量的衍生劑。實(shí)驗(yàn)了不同用量衍生劑對衍生效率的影響，當(dāng)反應(yīng)溫度65 ℃、反應(yīng)時間40 min時，隨著衍生劑用量的增大，色譜峰面積增大，一般當(dāng)衍生劑用量大于20 倍理論量時，峰面積不在變化，衍生反應(yīng)接近完全。本法選擇3.0 mL樣品溶液加入2 mL 100 mmol/L的CNBF衍生劑進(jìn)行衍生反應(yīng)，約相當(dāng)于硒代氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品量為0.1 mg/mL時的40 倍（考慮到CNBF自身的水解反應(yīng)）理論量。

2.2.3 衍生化反應(yīng)時間的選擇

在保持衍生反應(yīng)緩沖液pH值和衍生劑用量不變的情況下，于65 ℃水浴中分別衍生反應(yīng)不同時間（30～60 min），觀察反應(yīng)時間對色譜峰面積的影響。結(jié)果表明，隨著反應(yīng)時間的延長，色譜峰面積呈上升趨勢，反應(yīng)40 min后，硒代氨基酸的色譜峰面積已趨于最大。故本法選用40 min作為反應(yīng)時間。

2.2.4 衍生反應(yīng)緩沖液pH值的選擇

選用硼砂-硼酸緩沖液，比較不同pH值條件下（pH 8.6～11.0）進(jìn)行衍生反應(yīng)對硒代氨基酸峰面積的影響。結(jié)果表明，在pH 9.0時硒代氨基酸的峰面積最大。故將衍生介質(zhì)的pH值定為9.0。

2.3 色譜條件的優(yōu)化

SeMet和SeCys2與CNBF發(fā)生衍生化反應(yīng)，衍生物在240 nm處產(chǎn)生紫外吸收。考慮到富硒米曲霉中含有其他氨基酸對硒代氨基酸的測定產(chǎn)生一定的干擾，采用乙腈-水（1∶1，V/V）和0.05 mol/L，pH 6.8乙酸-乙酸鈉緩沖液為流動相，根據(jù)米曲霉的特性對梯度洗脫的方法進(jìn)行優(yōu)化，最終在1.3.4節(jié)色譜條件下，使富硒米曲霉中的硒代氨基酸得到良好的分離。圖2為SeMet和SeCys2標(biāo)準(zhǔn)品的衍生色譜圖。

圖2 SeMet與SeCys衍生物的液相色譜圖Fig.2 Liquid chromatogram of the CNBF-SeMet and SeCys2derivatives

2.4 富硒米曲霉樣品的衍生色譜分析

圖3 富硒米曲霉水解色譜圖Fig.3 Chromatogram of hydrolysate of selenium-enriched Aspergillus oryzae

富硒米曲霉在6 mol/L HCl溶液，50 ℃水解48 h后得到的產(chǎn)物進(jìn)行衍生反應(yīng)后的色譜分析如圖3所示。SeCys2得到了有效分離，但SeMet未出現(xiàn)明顯的色譜峰，可能是由于富硒米曲霉中含量過低或者是此提取方法對于SeMet的提取具有一定的局限性，具體原理有待進(jìn)一步研究。圖中其余未標(biāo)色譜峰可能是其他物質(zhì)，由于缺少明確的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，暫時無法確定。

2.5 方法的線性范圍與方法檢測限

取硒代氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品儲備液逐級稀釋成5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、100 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，按上述試驗(yàn)方法衍生后上機(jī)測定，以硒代氨基酸濃度為橫坐標(biāo)，吸收峰面積為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，其檢測限及線性范圍見表2。

表2 硒代氨基酸的檢測限及線性范圍Table2 Linear calibration ranges, regression equations, R2, LOD anndd LOQ of CNFB-selenoamino acids derivatives

由表2可知，SeMet標(biāo)準(zhǔn)曲線y=12 059x-63.538，R2=0.997 5，測定質(zhì)量濃度在5.0～100 mg/L內(nèi)線性關(guān)系良好；SeCys2標(biāo)準(zhǔn)曲線y=17 432x-87.428，R2=0.992 8，測定質(zhì)量濃度在5.0～100 mg/L也具有良好的線性關(guān)系，均可用于樣品的檢測分析。SeMet最低檢測限為0.41 mg/L，定量限為1.35 mg/L，其檢測靈敏度高于SeCys2的0.680 mg/L，高出39.7%，定量限也高于SeCys2的2.244 mg/L，高出66.2%。

2.6 方法的重復(fù)性及加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

取同一份富硒米曲霉樣品5 份，按照上述方法測定硒代氨基酸含量，5 次結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%，表明該方法重復(fù)性良好。

取富硒米曲霉樣品4 份，加入不同量SeCys2標(biāo)準(zhǔn)液，按照實(shí)驗(yàn)方法測定，計算加標(biāo)回收率。由表3可見，SeCys2有較高的加標(biāo)回收率，為94.8%～105.8%，使得有機(jī)硒的測定真實(shí)可信，滿足富硒米曲霉測定的需要。

表3 富硒米曲霉中SeCCyyss2的加標(biāo)回收率Table3 Spiked Recovery of SeCys2in selenium-enriched Aspergillus oryyzzaaee

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)研究確立CNBF柱前衍生-反相高效液相色譜法檢測富硒米曲霉中有機(jī)硒形態(tài)的分析方法。重點(diǎn)對樣品的提取方法和衍生方法進(jìn)行了研究。1）樣品的提取方法研究：比較不同溫度、不同時間對提取富硒米曲霉中硒代氨基酸的影響，并綜合考慮實(shí)驗(yàn)條件的選取與實(shí)驗(yàn)時間的消耗，采用一種溫和的實(shí)驗(yàn)條件-6 mol/L HCl溶液，50 ℃水解48 h的方法，提取樣品中的硒化合物，在確保實(shí)驗(yàn)定性定量結(jié)果的同時，提高了富硒米曲霉中硒代氨基酸的提取效率。2）硒代氨基酸衍生及分離研究：選擇CNBF柱前衍生，并對衍生劑用量、衍生時間以及衍生反應(yīng)緩沖液的pH值進(jìn)行了優(yōu)化，采用乙腈-水（1∶1，V/V）和pH 6.8乙酸-乙酸鈉緩沖液為流動相進(jìn)行梯度洗脫，使SeMet和SeCys2得到有效分離。該實(shí)驗(yàn)方法的檢測限低、精密度高，線性相關(guān)性良好，加標(biāo)回收率在94.8%～105.8%之間。與現(xiàn)在較為先進(jìn)的HPLC-MS聯(lián)用分析硒代氨基酸的方法相比，具有普及性強(qiáng)，樣品處理簡單，對實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求低，同時兼顧準(zhǔn)確性與經(jīng)濟(jì)性的優(yōu)勢，基本可以滿足硒形態(tài)分析的要求，能夠用于硒形態(tài)分析研究。

但同時實(shí)驗(yàn)尚有不足，有待改進(jìn)的地方。從色譜圖可以看出，目標(biāo)物的出峰時間太晚，耽誤檢測效率，是否可以通過某些手段，使目標(biāo)物的出峰時間提前，縮短檢測時間，提高實(shí)驗(yàn)效率等，本課題組還將會對此領(lǐng)域的研究做進(jìn)一步的探索。

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Determination of Organic Selenium Compounds in Selenium-Enriched Aspergillus oryzae by Pre-Column Derivatization-RP-HPLC Method

LI Hongwei1, WANG Kaiping1, WU Yu1, TANG Zhengjiang1, TANG Fei1, LIU Guoqing1,2,*
(1. School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China; 2. Anhui Wan Jiang Poultry Industry Research Institute, Xuancheng 242000, China)

A reversed phase-high performance liquid chromatography (RP-HPLC) method for the determination of organic selenium compounds in selenium-enriched Aspergillus oryzae was established. The extraction of organic selenium compounds from samples was performed through hydrolysis with 6 mol/L HCl solution for 48 h at 50 ℃. After pre-column derivatization with 4-chlorine-3,5-dinitrobenzotrifl uoride (CNBF), the derivatives were separated on a C18reversed-phase column through gradient elution with acetonitrile-water and pH 6.8 acetic acid-sodium acetate buffer solution. UV detection was carried out at 240 nm. The organic selenium compound in selenium-enriched A. oryzae was mainly selenocystine (SeCys2). The limit of detection (LOD) (RSN= 3) was 0.680 mg/L and the limit of quantitation (LOQ) (RSN= 10) was 2.244 mg/L. The linear range was 5.0-100 mg/L. The recoveries were in the range of 94.8%-105.8% and selenium-enriched A. oryzae contained 1.25 mg/g selenocystine. This method is simple, sensitive and accurate, and could be used to determine organic selenium compounds in selenium-enriched A. oryzae and related products.

selenium-enriched Aspergillus oryzae; organic selenium; selenoamino acids; pre-column derivatization-RP-HPLC

Q517

A

1002-6630（2015）22-0137-05

10.7506/spkx1002-6630-201522025

2015-01-07

安徽省科技攻關(guān)項(xiàng)目（1401032006）

李紅衛(wèi)（1988—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。E-mail：li3017545@163.com

*通信作者：劉國慶（1963—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)。E-mail：liugq_168@163.com