固定化豬味蕾組織制備苦味生物傳感器

喬立新，劉婷婷，龐廣昌*

（天津商業(yè)大學生物技術(shù)與食品科學學院，天津市食品與生物技術(shù)重點實驗室，天津 300134）

固定化豬味蕾組織制備苦味生物傳感器

喬立新，劉婷婷，龐廣昌*

（天津商業(yè)大學生物技術(shù)與食品科學學院，天津市食品與生物技術(shù)重點實驗室，天津 300134）

用海藻酸鈉-淀粉凝膠作固定劑，將豬的味蕾組織固定到兩片核微孔膜中間制成“三明治”式味覺傳感膜，然后將其固定到玻碳電極上制成味覺生物傳感電極，通過電化學工作站測定出蔗糖八乙酸酯、苯甲地那銨和槲皮素刺激其相應(yīng)受體后的響應(yīng)電流，結(jié)果表明：該傳感器對蔗糖八乙酸酯、苯甲地那銨和槲皮素的最低檢測限分別為1×10-14、1×10-13mol/L和1×10-14mol/L，在濃度分別為1×10-8、1×10-6mol/L和1×10-9mol/L時其電流變化率都相應(yīng)的達到最大值，說明此時它們的受體已經(jīng)被飽和。蔗糖八乙酸酯在其濃度為1×10-14～1×10-11mol/L有較好的對數(shù)關(guān)系（R2=0.957 3），苯甲地那銨在其濃度為1×10-13～1×10-7mol/L有很好的對數(shù)關(guān)系（R2=0.987 3），而槲皮素在其濃度為1×10-14～1×10-9mol/L時對數(shù)關(guān)系比較好（R2=0.996 4）。該傳感器不僅可以定量化地測定味覺受體與苦味物質(zhì)的作用，而且將為以后研究配體受體作用規(guī)律提供新的方法。

味覺傳感器；蔗糖八乙酸酯；苯甲地那銨；槲皮素

“苦”作為五味之一，最顯著的特點就是閾值極低，苦在醫(yī)學上的功能被總結(jié)為苦能泄、能燥、能堅陰。而且許多苦味物質(zhì)不僅可以賦予食品苦味，還有降血壓、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等功能[1]。生活中苦味也是不可或缺的，當它與其他味感調(diào)節(jié)得當時，能起到改善食品風味的作用。膳食中的苦味成分特別是植物性多酚、黃酮類化合物，都有抗氧化、降低心血管疾病和腫瘤發(fā)病率的作用，所以常常被稱作“植物性營養(yǎng)素”，而且隨著大家對苦味物質(zhì)的認識，苦味食品也開始受到大家的關(guān)注[1-2]。傳統(tǒng)上評定苦味的方法是通過人群口感實驗，雖然有一定的成效，且在國內(nèi)也已形成一定的規(guī)模，但是實驗者的身體狀況及描述準確性等因素都會影響品評結(jié)果[3]。目前國內(nèi)外最常用于測定味覺的儀器是電子舌，這些電子舌按構(gòu)建方式主要分為：1）離子選擇電極：它是一種對特定的離子具有選擇性的指示電極，可通過電極間膜電勢的大小來反映樣品離子的濃度信息[4]，其優(yōu)點是分析時間短、操作方便、易于實現(xiàn)自動檢測，但是容易被某些相關(guān)的離子干擾；2）多通道類脂膜傳感器：它是國外研究掩味最常用的系統(tǒng)，當類脂膜與苦味物質(zhì)反應(yīng)時，膜表面附近的離子分布改變或類脂聚合物表面的電荷密度改變，會在傳感器上得到響應(yīng)值，再經(jīng)過放大作用后，用統(tǒng)計學和化學計量學進行數(shù)據(jù)分析[5-6]，由于該傳感器膜的成分和電勢起伏現(xiàn)象的影響，經(jīng)常會出現(xiàn)長期漂移現(xiàn)象；3）伏安法式電子舌：這種電子舌線性范圍廣、靈敏度高，可用于醫(yī)藥、食品、環(huán)境方面的監(jiān)測[7-9]；4）Astree電子舌：該電子舌可用于分析有毒樣品或成分，還可用來建立校準曲線，擬合人工評分和儀器評分，測試新樣品的苦度值[10-11]，但是由于便攜性差、價格昂貴等缺點使得其推廣受到了一定的限制。而且雖然它們都可以對不同濃度的味覺物質(zhì)做出響應(yīng)，但是都只能通過物理信號的變化分辨不同的味覺感受，并不能真正反映味蕾組織對味覺的感受。

現(xiàn)在對苦味物質(zhì)傳導信號的途徑已經(jīng)比較明確，目前證實依賴a-gustducin傳導的通路有兩條：一條是苦味物質(zhì)刺激T2Rs/TRBs受體后，激活a-gustducin及效應(yīng)酶（磷酸二酯酶）使細胞內(nèi)第二信使環(huán)核甘酸的濃度降低，進而使胞膜上的鈣通道被打開，胞外Ca2＋內(nèi)流，細胞內(nèi)鈣濃度升高，細胞膜去極化，釋放神經(jīng)遞質(zhì)[12-13]。另一條a-gustducin介導的苦味傳導通路是G蛋白偶聯(lián)受體激活a-gustducin-Gβ1-Gγ13三聚體，進而活化附著在細胞膜上的磷脂酶C，而活化的磷脂酶C會提高三磷酸肌醇水平。三磷酸肌醇是一種水溶性小分子物質(zhì)，當它與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的特異Ca2＋通道結(jié)合后，會使儲存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2＋釋放到胞漿中，胞內(nèi)Ca2＋濃度的升高會激活Ca2＋依賴的K＋和Cl-電流，進而引起細胞膜的超極化[14-16]。第三條途徑不依賴 GPCR/G蛋白機制，一些苦味化合物通過直接作用于味覺受體的離子通道而產(chǎn)生信號轉(zhuǎn)導，比如，三乙醇胺和奎寧使K＋通道關(guān)閉，從而導致味覺受體細胞極化[17-18]。

因為在味覺感受系統(tǒng)中，剝離的味覺上皮黏膜組織能夠很好地保持味覺感受單元-味蕾中固有的味覺受體細胞群落及其生物微環(huán)境，并能有效被味覺物質(zhì)激活，所以本研究通過模擬味覺的神經(jīng)傳導機制，研制出以豬的味蕾組織為敏感元件，即味蕾組織固定到兩片核微孔膜間制成味覺測定膜，然后與玻碳電極相連接（玻碳電極與電腦連接）的味覺生物傳感器，當味覺物質(zhì)與味蕾組織接觸后，會引起味覺細胞超極化產(chǎn)生生物電流，然后通過電化學工作站可以檢測到[19]。該傳感器不僅能夠真實地反映出豬味蕾感受味覺物質(zhì)的過程，而且還可以模擬味覺神經(jīng)信號傳導作用，所以更準確地模擬味覺形成的整個過程。味覺細胞傳感器的特異性辨識響應(yīng)不僅可以使人體避免有毒有害物質(zhì)的毒害作用，還可以解決感官品評過程中品評人員的味覺疲勞，因此，味覺細胞傳感器特別適用于單一味覺化學成分的綠色、實時和快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

可溶性淀粉 天津市贏達稀貴化學試劑廠；海藻酸鈉 天津市光復精細化工研究所；戊二醛 天津博迪化工股份有限公司；核微孔膜 英國Whatman公司；CaCl2、CollagenaseⅡ、DispaseⅡ、蔗糖八乙酸酯、苯甲地那銨、槲皮素 美國Sigma公司；所有試劑均為分析純；水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

分析天平 上海精密科學儀器有限公司；Millipore Milli-Q純水 上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司；KQ 3200B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；LRH-70生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；CHI600E電化學工作站、三電極系統(tǒng)（玻碳電極（GCE Φ=3 mm）、參比電極-Ag/AgCl電極、對電極-鉑絲電極） 上海辰華儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 味蕾組織的剝離

將用于分離豬舌上皮的混合酶液（CollagenaseⅡ（1 mg/mL）、DispaseⅡ（3 mg/mL））放入37 ℃培養(yǎng)箱中預熱15 min，以便使酶的活性達到最高。然后將豬舌剪至葉狀乳頭邊緣處，并用解剖液清洗舌頭表面的血跡，用注射器取0.3～0.5 mL提前預熱的混合酶液注入豬的舌上皮與肌肉層之間，將注射器的針頭從舌根一直伸至舌尖部位，注射時將注射器要慢慢向后抽出，盡量保證勻速，注射完成后放入解剖液中，并在室溫條件下孵育6～8 min。然后用眼科鑷將舌上皮層與肌肉層輕輕剝離，并立即放入冰浴的解剖液中備用[20]。

1.3.2 味覺組織傳感器的制備

將可溶性淀粉溶解于1 g/100 mL的戊二醛溶液中，80 ℃水浴加熱并攪拌30 min，配成一定質(zhì)量濃度的淀粉溶液室溫條件下放置過夜，使淀粉與戊二醛得到充分的交聯(lián)獲到醛基化淀粉膠溶液。醛基化淀粉膠溶液再與一定質(zhì)量濃度的海藻酸鈉溶液以1∶1混合[21-23]。取上述溶液10 μL均勻涂抹于2 張直徑為25 mm、孔徑為0.22 μm的聚碳酸酯微孔膜上，將準備好的9 mm2的味蕾上皮組織放置于一張微孔膜的圓心上，然后將另一張覆蓋上制成三明治結(jié)構(gòu)的味覺測定膜。

將制成的味蕾組織膜浸入5 g/100 mL的CaCl2溶液中10 s后取出，使海藻酸鈉與CaCl2發(fā)生離子交換反應(yīng)形成穩(wěn)定的螯合物，使海藻酸鈉溶液凝膠化成良好的固定劑[24-26]。然后用生理鹽水沖洗（去除膜上存留的Cl-、Ca2＋等）味覺測定膜。最后，用皮套將膜固定在玻碳電極頭的表面使得味蕾組織與表征完的電極芯重合，則苦味生物傳感器便已制成。該傳感器的制作原理就是當苦味物質(zhì)與其受體結(jié)合之后，會引發(fā)味覺細胞去極化和Ca2＋釋放并產(chǎn)生動作電位，生物自身通過神經(jīng)傳導將電信號傳到大腦的味覺中樞系統(tǒng)產(chǎn)生味覺，而苦味生物傳感器則是模擬生物體通過電極將電信號傳到電腦中，來顯示苦味配體與受體的作用規(guī)律。

1.3.3 苦味生物傳感器對苦味物質(zhì)的測定方法

采用三電極系統(tǒng)，將固定好味覺測定膜的玻碳電極作為工作電極，Ag/AgCl電極作為參比電極，鉑絲電極作為對電極，以生理鹽水為測試底液，在一定的電壓下通過電流-時間測定法測定不同濃度的蔗糖八乙酸酯、苯甲地那銨和槲皮素的響應(yīng)電流，以響應(yīng)電流的變化率作為檢測指標，當測試底液的響應(yīng)電流值與被測溶液的響應(yīng)電流值之差接近于零時，此時的被測物質(zhì)濃度為它的最低檢測限，計算響應(yīng)電流的變化率（ΔI）見公式（1）。

式中：I1及I2分別為苦味物質(zhì)被測定前后（即空白和響應(yīng)）同一時間點的穩(wěn)態(tài)電流值。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦味生物傳感器的穩(wěn)定性及重復性

圖1 穩(wěn)定性檢驗Fig.1 Storage stability test

將制成的味覺組織傳感器在同一濃度的蔗糖八乙酸酯溶液中連續(xù)測定10次，結(jié)果相對標準偏差為 5.34%，表明該味覺組織傳感器穩(wěn)定性能良好，將該味覺傳感器保存在4 ℃生理鹽水中，每天對同一濃度的蔗糖八乙酸酯溶液進行測定，前2 d該傳感器響應(yīng)電流變化率基本恒定，第3天其電流變化率是初始電流變化率的95.1%，第4天其電流變化率僅為初始電流變化率的75.9%。表明該味覺組織傳感器至少可穩(wěn)定保存3 d，如圖1所示。

取不同批次制備的電化學型組織傳感器5 支，對同一濃度的蔗糖八乙酸酯溶液進行檢測，電流響應(yīng)結(jié)果如表1所示，響應(yīng)電流的相對標準偏差為6.143%，表明該味覺組織傳感器重復性能良好。

表1 傳感器重復性實驗結(jié)果Table1 Repeatability of the sensors

2.2 電流-時間測定法的電位優(yōu)化

制備好的傳感器在不同電位條件下（測試底液為生理鹽水）用電流-時間法進行測定，以加入10-5mol/L的蔗糖八乙酸酯前后穩(wěn)態(tài)電流差來衡量不同電位對傳感器電化學響應(yīng)效果的影響，結(jié)果表明在-0.38 V條件下電流的變化值最大，如圖2所示，故選定-0.38 V為恒電位進行苦味生物傳感器對蔗糖八乙酸酯、苯甲地那銨和槲皮素響應(yīng)特性的研究。

圖2 電位對該微生物傳感器響應(yīng)效果的影響Fig.2 Effect of response potential on the microorganism sensors

2.3 蔗糖八乙酸酯與其受體的作用規(guī)律

用1.3.2節(jié)的方式組裝電極并進行測定，因為蔗糖八乙酸酯的檢測濃度范圍很寬，不易作圖，所以將其濃度重新定義，見公式（2）。

式中：pCa為重新定義后的蔗糖八乙酸酯濃度；C為定義前的濃度。此式表示當pCa=1時，蔗糖八乙酸酯的檢測濃度最小為1×10-14mol/L。以蔗糖八乙酸酯濃度的對數(shù)值為橫坐標，其響應(yīng)電流的電流變化率為縱坐標作圖如圖3所示，當其濃度為1×10-8mol/L時電流變化率達到最大值，說明此時受體已經(jīng)被配體飽和，當濃度再增大時電流變化率明顯下降，說明味覺組織受到反饋抑制。在蔗糖八乙酸酯濃度為10-14～10-11mol/L的范圍內(nèi)，對其進行對數(shù)曲線擬合，如圖4所示，y=15.209 lnx＋28.472，R2=0.957 3，證明其在此范圍內(nèi)有較好的對數(shù)關(guān)系。

圖3 對蔗糖八乙酸酯的檢測范圍Fig.3 The detection range of sucrose octaacetate

圖4 蔗糖八乙酸酯在濃度為1×1100－1144～11×1100－1111mol/L的對數(shù)關(guān)系Fig.4 Logarithmic relationship between sucrose octaacetate and its receptor in the range of 1 × 10-14-1 × 10-11mol/L

2.4 苯甲地那銨與其受體的作用規(guī)律

圖5 對苯甲地那銨的檢測范圍Fig.5 The detection range of denatonium

圖6 苯甲地那銨在濃度為1×1100－1133～11×1100－77mol/L的對數(shù)關(guān)系Fig. 6 Logarithmic relationship between denatonium and its receptor in the range of 1 × 10-13-1 × 10-7mol/L

依照1.3.2節(jié)的方法組裝電極并進行測定，同樣將苯甲地那銨的濃度重新定義。令

式中：pCb為重新定義后的苯甲地那銨濃度；C為定義前的濃度。此式表示當pCb=1時，苯甲地那銨的濃度為1×10-13mol/L。以苯甲地那銨為橫坐標，其響應(yīng)電流的電流變化率為縱坐標作圖，由圖5可知，在其濃度為1×10-6mol/L時電流變化率達到最大值，說明此時其受體已經(jīng)被飽和。在10-13～10-7mol/L的濃度范圍內(nèi)對其進行對數(shù)曲線性擬合如圖6所示，y=22.988 lnx＋10.702，R2=0.987 3，說明在此范圍內(nèi)有較好的對數(shù)關(guān)系。

2.5 槲皮素與其受體的作用規(guī)律

依照1.3.2節(jié)的方法組裝電極并進行測定，同樣將槲皮素的濃度重新定義，見公式（4）。

式中：pCc為重新定義后的槲皮素濃度；C為定義前的濃度。此式表示當pCc=1時，槲皮素的檢測濃度最小為1×10-14mol/L。以槲皮素為橫坐標，它的響應(yīng)電流的電流變化率為縱坐標作圖，由圖7可知，在1×10-9mol/L濃度時槲皮素的電流變化率達到最大值，說明此時槲皮素的受體已經(jīng)被飽和。在10-14～10-9mol/L的濃度范圍內(nèi)對其進行對數(shù)曲線性擬合如圖8所示，y=25.296 lnx＋25.37，R2=0.996 4，說明在此范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的對數(shù)關(guān)系。

圖7 對槲皮素的檢測范圍Fig.7 The detection range of quercetin

圖8 槲皮素在濃度為1×1100－1144～11×1100－99mol/L的對數(shù)關(guān)系Fig.8 Logarithmic relationship between quercetin and its receptor in the range of 1 × 10-14-1 × 10-9mol/L

3 結(jié) 論

通過固定化豬味蕾組織制備的苦味生物傳感器定量化測定了味覺受體與蔗糖八乙酸酯、苯甲地那銨和槲皮素的作用規(guī)律，其檢測限分別為1×10-14、1×10-13mol/L和1×10-14mol/L，說明豬對蔗糖八乙酸酯和槲皮素更敏感。

該傳感器通過固定化豬味蕾組織，模擬味蕾組織的神經(jīng)生理傳導過程，成功地實現(xiàn)了蔗糖八乙酸酯、苯甲地那銨和槲皮素的定量化測定以及分辨出了豬對這些苦味物質(zhì)的味覺感受，探討了它們與其受體的相互作用規(guī)律，為味覺傳感器的研究與開發(fā)，特別是為受體與配體（配基）的作用規(guī)律研究提供了一條新的思路。但是，味蕾組織的固定化是否對受體和配體（配基）相互作用有影響，味蕾組織經(jīng)過固定化以后的信號傳導過程是否仍能真實反映神經(jīng)生理過程尚需進一步的深入研究。

苦味常常作為抗營養(yǎng)的成分在營養(yǎng)普遍過剩的今天，可以有效防止現(xiàn)代代謝綜合癥的發(fā)生和發(fā)展，所以對于苦味物質(zhì)的定量化測定可能在藥物及食品的功能性成分篩選與研究，以及其與GPCRs受體的互作規(guī)律等方面具有廣闊的應(yīng)用前景；另外，該研究在豬飼料的配方，特別是適口性研究方面也具有一定的參考意義。

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Immobilizing Taste-Bud Tissues of Pigs to Prepare Bitterness Biosensor

QΙAO Lixin, LΙU Tingting, PANG Guangchang*
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300314, China)

Using sodium alginate-starch gel as a fixing agent, taste-bud tissues of pigs were fixed between two nuclear microporous membranes to make a sandwich-type sensing membrane, which was then fi xed to a glassy carbon electrode to make a biosensor electrode. By using electrochemical workstation, the current produced when sucrose octaacetate, denatonium and quercetin stimulated their corresponding receptors were tested. The results showed that the lowest limit of detection of this biosensor for sucrose octaacetate, denatonium and quercetin were 1 × 10-14, 1 × 10-13and 1 × 10-14mol/L and the maximum rate of change of the current was found at concentration levels of 1 × 10-8, 1 × 10-6and 1 × 10-9mol/L, respectively, indicating that their receptors are saturated. It was demonstrated that the interaction curves of sucrose octaacetate, denatonium and quercetin with their respective receptors exhibited high correlation (R2= 0.957 3, 0.987 3 and 0.996 4) in the concentration ranges of 1 × 10-14-1 × 10-11mol/L, 1 × 10-13-1 × 10-7mol/L and 1 × 10-14-1 × 10-9mol/L, respectively. This study not only quantitatively determined the interaction of the taste receptor and bitter substances with a new biosensor, but also provided a simple approach for monitoring bitter substances and investigating the mechanism of ligand-receptor interaction.

taste biosensor; sucrose octaacetate; denatonium; quercetin

TS202.3

A

1002-6630（2015）22-0090-05

10.7506/spkx1002-6630-201522016

2015-05-18

國家自然科學基金面上項目（31371773）

喬立新（1990—），男，碩士研究生，研究方向為發(fā)酵工程。E-mail：1151665754@qq.com

*通信作者：龐廣昌（1956—），男，教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：pgc@tjcu.edu.cn