γ-谷維素對脂多糖誘導巨噬細胞RAW264.7炎癥因子表達的影響

劉遠錦，田媛媛，劉 博，李新華，陳婭婭，曾琳娜，楊 濤，林親錄，羅非君,*

（1.中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院，稻谷及副產物深加工國家工程實驗室，湖南長沙 410004；2.中南大學湘雅醫(yī)院消化內科，湖南長沙 410008）

γ-谷維素對脂多糖誘導巨噬細胞RAW264.7炎癥因子表達的影響

劉遠錦1，田媛媛1，劉 博1，李新華2，陳婭婭1，曾琳娜1，楊 濤1，林親錄1，羅非君1,*

（1.中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院，稻谷及副產物深加工國家工程實驗室，湖南長沙 410004；2.中南大學湘雅醫(yī)院消化內科，湖南長沙 410008）

利用細菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激巨噬細胞RAW264.7形成炎癥模型，評價γ-谷維素對巨噬細胞炎癥因子表達的影響。在LPS刺激的RAW264.7細胞培養(yǎng)基中，添加不同濃度的γ-谷維素，分析培養(yǎng)基中炎癥因子白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-6 （interleukin-6，IL-6）的含量，以及NO2－/NO3－含量，發(fā)現(xiàn)γ-谷維素能抑制炎癥因子的分泌；利用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）分析mRNA表達水平，確定γ-谷維素能抑制炎癥因子的基因表達；采用Western blotting分析進一步確定γ-谷維素能抑制炎癥因子的蛋白表達。綜上所述，γ-谷維素能明顯抑制炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6、NO等分泌和表達。

γ-谷維素；炎癥；炎癥因子；米糠

米糠是稻谷加工的主要副產物之一，谷維素是米糠提取物之一，可能具有抗炎的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，米糠提取物可以降低Ⅱ型糖尿病大鼠體內脂肪組織中的炎癥標記物表達量[1]；非絕經期的肥胖女性經常攝入糙米能降低體內炎癥標記物的表達水平[2]。在臨床醫(yī)療中，谷維素是調節(jié)植物神經的常用藥物，但徐百勝等[3]采用谷維素與柳氮磺吡啶聯(lián)用治療潰瘍性結腸炎，發(fā)現(xiàn)谷維素能增強抗炎療效，提示谷維素具有抗炎的功能。在佛波酯誘導的小鼠皮炎模型中，谷維素及其主要活性成分均能顯著抑制小鼠的炎癥反應[4]。本課題組最近的研究也發(fā)現(xiàn)γ-谷維素可抑制葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導的小鼠急性和慢性潰瘍性結腸炎[5]。以上研究結果揭示谷維素可能具有抗炎作用，但迄今為止，其抗炎的分子機理尚不清楚。

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是由脂質和多糖由共價鍵相連組成的，它是革蘭氏陰性細菌外膜的主要組成部分，當機體被細菌感染或出現(xiàn)敗血癥時，腸道黏膜屏障破壞，導致LPS進入血液，LPS結合到CD14/Toll樣受體上，促使免疫細胞大量分泌腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1β （interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和NO等炎癥因子，導致機體全身性炎癥反應[6-7]。本研究采用LPS誘導巨噬細胞RAW264.7形成炎癥模型，在分子水平探討γ-谷維素對炎癥因子表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小鼠單核巨噬細胞RAW264.7 無錫博慧斯生物醫(yī)藥科技有限公司；γ-谷維素（純度99%） 日本OSHA Haz有限公司；DSS（純度99%）、LPS（純度99%）美國Sigma公司。

高糖DMEM培養(yǎng)基 美國Hyclone公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 浙江天杭生物科技有限公司；反轉錄試劑盒、熒光SYBR 北京全式金生物技術有限公司；鼠IL-1β酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、鼠TNF-α ELISA試劑盒、鼠IL-6 ELISA試劑盒 美國R&D公司；β-actin抗體、IL-1β抗體、TNF-α抗體、IL-6抗體、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）抗體 美國Cell Signaling公司；二抗Anti-rabbit IgG-HRP （SC-2004）、Anti-mouse IgG-HRP（SC-2005） 美國Santa Cruz公司；化學發(fā)光底物 美國Pierce公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 RAW264.7細胞培養(yǎng)與分組

RAW246.7巨噬細胞用含10%胎牛血清、5%青鏈霉素混合液的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。隔天傳代，生長至80%～90%時，采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗兩次，加入0.25%胰酶在37 ℃消化6～8 min，用移液器打散細胞后1∶2傳代，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。LPS采用純水溶解，γ-谷維素采用質量分數(shù)1%的四氫呋喃溶液溶解，再用純水稀釋，使四氫呋喃在培基中最終質量分數(shù)為0.1%。培養(yǎng)的RAW246.7細胞經胰酶消化后，接種于6 孔板，分為4 組進行處理：對照組，單純LPS處理組，高、低濃度γ-谷維素組。高、低濃度γ-谷維素組中分別加入12.5、25 μmol/L γ-谷維素預處理30 min后加入終質量濃度為1 μg/mL的LPS，單純LPS處理組僅加入LPS溶液和四氫呋喃，對照組加入蒸餾水和四氫呋喃，使4 組細胞培養(yǎng)基中四氫呋喃最終質量分數(shù)均為0.1%，細胞培養(yǎng)24 h后，分別收集培養(yǎng)基和細胞做進一步分析。

1.2.2 γ-谷維素對RAW264.7細胞的毒性

采用四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色法測定γ-谷維素和LPS對細胞是否有毒性作用[8-9]。取對數(shù)生長期的RAW246.7細胞，消化后吹打均勻，用培養(yǎng)基稀釋至細胞密度為7×104個/mL，以每孔100 μL接種于96 孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁后，每孔加入2 μL的γ-谷維素溶液，使得四氫呋喃最終質量分數(shù)為0.1%，γ-谷維素的終濃度分別為0、3.125、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L。每組設置5 個重復孔。輕輕振蕩，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 h后，每孔加入20 μL MTS（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt）溶液。再次培養(yǎng)4 h后，采用酶標儀在490 nm波長處測定每個孔的光密度值。

1.2.3 ELISA法檢測炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β的含量

TNF-α、IL-6和IL-1β是重要的炎癥因子。按照1.2.1節(jié)方法將RAW246.7細胞分為4 組并做相應處理，每組3 個重復，培養(yǎng)24 h后取細胞培養(yǎng)液，室溫條件下1 000×g離心10 min，收集細胞培養(yǎng)液。嚴格按照試劑盒說明書步驟操作。繪制出標準曲線，測定細胞培養(yǎng)基中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量。

1.2.4 NO2－/NO3－含量檢測

巨噬細胞受到LPS信號的刺激會釋放NO，但NO非常不穩(wěn)定，會形成亞硝酸鹽（NO2－）和硝酸鹽（NO3－）。取對數(shù)生長期的RAW246.7細胞消化，稀釋成5×105個/mL細胞懸浮液，接種于24 孔板中，每孔1 mL。24 h后，棄掉舊培養(yǎng)基，加入新培養(yǎng)基，每孔加入LPS使其終質量濃度為1 μg/mL，加入γ-谷維素使其終濃度分別為12.5、25 μmol/L，四氫呋喃終質量分數(shù)為0.1%。培養(yǎng)24 h后，取細胞培養(yǎng)液按照NO試劑盒說明書方法進行操作，測定NO含量（以NO2－/NO3－表示，為NO2－和NO3－的總量）。按照下式計算NO2－/NO3－含量。

式中：20 μmol/L為標準品濃度；n為樣品測定前的稀釋倍數(shù)；空白組為未加細胞只有培養(yǎng)基的處理。

1.2.5 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）分析基因mRNA表達水平

6 孔板培養(yǎng)RAW246.7細胞，用不同濃度γ-谷維素處理，LPS刺激12 h后，用PBS清洗2 次，以Trizol提取細胞總RNA，0.8%瓊脂糖膠電泳檢測RNA的完整性并測定其濃度，用反轉錄試劑盒合成cDNA后進行PCR擴增反應。iNOS：上游引物5’-CAG CTG GGC TGT ACA AAC CTT-3’，下游引物5’-CAT TGG AAG TGA AGC GTT TCG-3’；TNF-α：上游引物5’-CAA AAT TCG AGT GAC AAG CCT G-3’，下游引物5’-GAG ATC CAT GCC GTT GGC-3’；IL-1β：上游引物5’-GAG CAC CTT CTT TTC CTT CAT CTT-3’，下游引物5’-TCA CAC ACC AGC AGG TTA TCA TC-3’；IL-6：上游引物5’-ATG GAT GCT ACC AAA CTG GAT-3’，下游引物5’-TGA AGG ACT CTG GCT TTG TCT-3’；β-actin：上游引物5’-CCA TAA ACG ATG CCG GA-3’，下游引物5’-CAC CAC CCA TAG AAT CAA GA-3’。qPCR反應條件：94 ℃，3 min；94 ℃，30 s；60 ℃，40 s；72 ℃，1 min；40 個循環(huán)。

1.2.6 Western blotting分析

將RAW264.7細胞用γ-谷維素和LPS處理24 h后，PBS清洗2 次，用含苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）的RIPA裂解液（50 mmol/L Tris-HCl （pH 7.4）、150 mmol/L NaCl、1% NP-40、0.1%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS））裂解后，5 000×g離心10 min，取上清液。取10 μL蛋白質裂解液，直接采用Nanodrop儀測定蛋白質濃度，取20 μg的蛋白質樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE），再轉移到硝酸纖維素膜上。將硝酸纖維膜在含有5%脫脂奶粉的PBST（PBS和Tween-20混合）中封閉1 h。一抗孵育過夜（稀釋比例為1∶1 000），孵育后用PBST清洗4 次，室溫條件下二抗孵育2 h（稀釋比例為1∶1 000）。繼續(xù)用PBST清洗4 次。加入化學發(fā)光底物，X光片曝光、顯影、定影顯示陽性條帶，樣本結果用看家蛋白β-actin條帶作為內參校正。

1.3 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行處理，數(shù)據(jù)結果以±s表示，組間比較采用方差分析和t檢驗，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 γ-谷維素對RAW246.7細胞的毒性作用分析

如圖1所示，不同濃度γ-谷維素作用于RAW246.7細胞24 h后，對照組和實驗組細胞存活率分別為：（100±2.03）%、（103.99±4.98）%、（107.65±9.05）%、（103.58±3.90）%、（111.24±12.15）%、（106.38±6.37）%、（97.96±7.20）%。與對照組相比，不同濃度γ-谷維素處理后，細胞活力均無明顯改變（P＞0.05），提示0～100 μmol/L的γ-谷維素對RAW264.7細胞無明顯的毒性作用，該模型可用于后續(xù)實驗。后續(xù)研究將選用1 μg/mL LPS（經典處理劑量）刺激RAW246.7細胞建立細胞炎癥模型，采用12.5、25 μmol/L γ-谷維素來評估其抗炎功效及分子機理。

圖1 1 γ--谷維素對RAW264.7細胞的毒性作用Fig.1 Effect of γ-oryzanol on the viability of RAW264.7 cells

2.2 γ-谷維素對LPS誘導RAW264.7細胞炎癥因子分泌量的影響

LPS和γ-谷維素處理RAW246.7細胞24 h后，收集細胞培養(yǎng)液，離心取上清液，測定細胞炎癥因子的分泌量，結果見圖2。

圖2 2 γ-谷維素對LPS誘導RAW264.7細胞炎癥因子分泌量的影響Fig.2 Effect of γ-oryzanol on the production of infl ammatory factors in LPS-stimulated RAW264.7 cells

如圖2所示，ELISA分析結果顯示，加入LPS刺激后，培養(yǎng)基中IL-1β含量從（15.31±3.12）pg/L增加至（96.32±14.53）pg/L，12.5、25 μmol/L γ-谷維素處理后，培養(yǎng)基中IL-1β含量分別為（40.15±6.56）、（35.31±5.87） pg/L，相對于單純LPS處理組，γ-谷維素處理可極顯著抑制RAW246.7細胞分泌IL-1β （P＜0.01）（圖2A）。γ-谷維素也能抑制TNF-α的分泌，12.5、25 μmol/L γ-谷維素處理后，培養(yǎng)基中TNF-α含量從（656.32±98.37） μg/L分別降至（475.86±130.78）、（290.62±75.46） μg/L，其中25 μmol/L γ-谷維素處理組與單純LPS處理組相比具有極顯著差異（P＜0.01）（圖2B）。LPS刺激RAW264.7細胞炎癥模型中，培養(yǎng)基中IL-6含量從（11.13±0.19） pg/L上升至（89.28±3.75） pg/L，12.5、25 μmol/L γ-谷維素處理后，培養(yǎng)基中IL-6含量分別降低至（70.84±1.24）、（61.54±2.78）pg/L（P＜0.01）（圖2C）。在炎癥反應中，巨噬細胞釋放的NO非常不穩(wěn)定，在培養(yǎng)基中形成會形成亞硝酸鹽（NO2－）和硝酸鹽（NO3－），NO測定試劑盒將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，確定培基中NO的釋放量，結果發(fā)現(xiàn)γ-谷維素亦能抑制NO的釋放，12.5、25 μmol/L γ-谷維素處理后，培養(yǎng)基中NO2－/NO3－濃度從（135.47±4.85）μmol/L分別降至（90.48±9.48）、（64.06±4.53）μmol/L（P＜0.01）（圖2D）。

2.3 γ-谷維素對細胞炎癥因子和iNOS mRNA表達水平的影響

如圖3所示，單純LPS處理RAW246.7細胞12 h后，IL-1β mRNA相對表達量從1.00±0.31增加至15.31±3.12，12.5、25 μmol/L γ-谷維素處理后，RAW246.7細胞的IL-1β mRNA相對表達量分別為10.02±1.82和5.12±1.09，相對于單純LPS處理組，γ-谷維素處理可極顯著抑制IL-1β mRNA轉錄（P＜0.01）。γ-谷維素也能抑制TNF-α mRNA轉錄，12.5、25 μmol/L γ-谷維素處理后，RAW246.7細胞的TNF-α mRNA相對表達量從4.08±0.41（單純LPS處理組）分別降至2.61±0.54 和1.81±0.31，與單純LPS處理組相比具有極顯著差異（P＜0.01）。LPS刺激RAW264.7細胞炎癥模型中，IL-6 mRNA相對表達量為4.57±1.38，12.5、25 μmol/L γ-谷維素處理后，RAW246.7細胞的IL-6 mRNA相對表達量分別降至2.25±0.47和1.96±0.45。在炎癥反應中，iNOS高表達是促使炎癥因子NO釋放的重要條件之一，本研究發(fā)現(xiàn)，γ-谷維素亦能抑制iNOS基因的轉錄，12.5 μmol/L γ-谷維素處理后，RAW246.7細胞的iNOS mRNA相對表達量從8.07±1.54下降到6.01±1.82 （P＜0.05）；25 μmol/L γ-谷維素處理后，iNOS mRNA相對表達量則降至3.17±1.25（P＜0.01）。

圖 33 γ-谷維素對LPS刺激RAW264.7細胞炎癥因子和iiNNOOSS mRNA表達水平的影響Fig.3 Effect of γ-oryzanol on mRNA expression of infl ammatory factors and iNOS in LPS-stimulated RAW264.7 cells

2.4 γ-谷維素對炎癥因子和iNOS蛋白表達水平的影響

圖4 Western blotting分析γ-谷維素細胞炎癥因子和iNOS蛋白表達的影響Fig.4 Effect of γ-oryzanol on protein expression of infl ammatory factors and iNOS in LPS-stimulated RAW264.7 cells

如圖4所示，Western blotting分析結果表明，LPS處理RAW246.7細胞24 h后，IL-1β、TNF-α、IL-6和iNOS蛋白表達水平明顯上升，而在對照組（0、0）中其表達水平非常低。與單純LPS處理組相比，γ-谷維素處理后，RAW246.7細胞中各種炎癥因子水平均有所下降。

3 討 論

炎癥是機體針對外界病毒、化學物質入侵而發(fā)起的維持機體穩(wěn)態(tài)的自發(fā)反應。大量研究表明，炎癥因子的異常激活與眾多疾病有密切的關系[10-11]。如有研究表明慢性炎癥與癌變密切相關，參與機體的癌變演進[12-13]。Sun 等[14]研究發(fā)現(xiàn)炎癥因子的高表達與癌細胞的藥物抗性密切相關，IL-6的高表達可以提高乳腺癌患者對他莫昔芬（一種抗雌激素）的耐藥性。潰瘍性結腸炎是一種常見的慢性炎癥，其病因復雜，常反復發(fā)作并逐漸加重，在潰瘍性結腸炎組織中存在大量炎癥因子的表達。因此，對炎癥因子的調控具有非常重要的意義，特別是利用食品中的營養(yǎng)成分來控制炎癥因子的表達具有副作用少等突出優(yōu)點。

γ-谷維素主要存在于米糠油及其油腳中，米糠層中γ-谷維素的含量為0.3%～0.5%。在加溫壓榨米糠時，γ-谷維素溶于油中，一般毛糠油中γ-谷維素的含量約為2%～3%。隨著研究的深入，目現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)γ-谷維素具有多種藥理活性，如抗氧化、降脂、調節(jié)機體植物神經紊亂等[15-18]。本研究以RAW246.7巨噬細胞為材料，明確了γ-谷維素對LPS刺激細胞所產生的炎癥反應具有明顯的抑制作用，為γ-谷維素抗炎功效研究提供了新的實驗依據(jù)。當前已有醫(yī)生在臨床上將γ-谷維素用于患者的抗炎輔助治療中[3,19]，但還亟需提供這方面的實驗依據(jù)支持。

本研究發(fā)現(xiàn)γ-谷維素能抑制主要炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6和NO等表達，其抗炎作用體現(xiàn)出了多靶點性。也有研究表明，炎癥因子之間可能會存在一些自我加強的作用，如在正常情況下，細胞產生的IL-6基礎分泌量很少，在有外界刺激時，如在感染、創(chuàng)傷、TNF-α影響下，可觸發(fā)細胞內IL-6釋放或合成[20-21]。NO作為一種重要的細胞間信息交流調節(jié)因子，其過量釋放與炎癥的產生有密切關系，其中iNOS是合成NO重要的限速酶，NO釋放往往與iNOS酶高表達有關[20]。關麗華等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在潰瘍性結腸炎模型中，iNOS表達升高，NO釋放量增加。通過對iNOS基因轉錄調控的研究發(fā)現(xiàn)其基因受核轉錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的調控[22]。Sakai 等[23]發(fā)現(xiàn)在牛動脈內皮細胞中γ-谷維素能抑制NF-κB的活化，減少細胞黏附分子VCAM-1和ICAM-1的表達。同時，已有研究證實IL-1β、TNF-α、IL-6和iNOS這4 個基因的啟動子中均存在NF-κB的結合位點，其表達受NF-κB活性的調控[24-27]，提示γ-谷維素也可能通過抑制NF-κB的活化起作用，但需要進一步證實γ-谷維素是否能抑制NF-κB的核轉運及其與順式調控元件的結合能力。雖然本實驗證實了γ-谷維素能抑制巨噬細胞炎癥因子的表達，但其調控炎癥因子表達的信號轉導通路尚需進一步探索。

本研究利用MTT實驗發(fā)現(xiàn)在0～100 μmol/L濃度范圍內，γ-谷維素對巨噬細胞均無明顯毒性作用，這將有利于今后γ-谷維素相關功能性食品和保健品的研發(fā)。

總之，本研究在評估γ-谷維素抗炎功效的基礎上，對γ-谷維素抗炎的分子機理進行了初步的探索，明確了γ-谷維素能明顯抑制炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6和NO的分泌和表達。對其分子機理的深入研究，將促進含γ-谷維素的功能食品及保健品的開發(fā)，同時，也能為人們的膳食方案提供科學的理論依據(jù)。

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Effect of γ-Oryzanol on the Expression of Lipopolysaccharide-Induced Infl ammatory Factors in Macrophages

LIU Yuanjin1, TIAN Yuanyuan1, LIU Bo1, LI Xinhua2, CHEN Yaya1, ZENG Linna1, YANG Tao1, LIN Qinlu1, LUO Feijun1,*
(1. National Engineering Laboratory for Deep Processing of Rice and Byproducts, College of Food Science and Engineering, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, China; 2. Department of Gastroenterology, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, China)

In this study, we used macrophage models of lipopolysaccharide (LPS)-stimulated infl ammation to evaluate the effect of γ-oryzanol on the expression of infl ammatory factors. After exposing RAW264.7 cells to different concentrations of γ-oryzanol and LPS, we analyzed the contents of IL-1β, TNF-α, IL-6 and NO2-/NO3-(NO) in the macrophage culturemedium and found that γ-oryzanol could inhibit the secretion of inflammatory factors. Real-time quantitative PCR was employed to analyzed mRNA expression levels of IL-1β, TNF-α, IL-6 and iNOS, and it was found that infl ammatory gene transcriptions were inhibited by γ-oryzanol. Western blotting analysis further confi rmed that γ-oryzanol could decrease the expression of IL-1β, TNF-α, IL-6 and iNOS protein. Our data showed that γ-oryzanol can signifi cantly inhibit the expression and secretion of infl ammatory factors such as IL-1β, TNF-α, IL-6 and NO.

γ-oryzanol; infl ammation; infl ammatory factor; rice bran

R284.1

A

1002-6630（2015）19-0238-06

10.7506/spkx1002-6630-201519043

2014-11-13

湖南省教育廳科學研究重點項目（13A124）；湖南省研究生科研創(chuàng)新項目（122-0035）；

中南林業(yè)科技大學研究生科研創(chuàng)新項目（CX201313357；CX2013B358；CX2013B14）

劉遠錦（1990-），女，碩士研究生，研究方向為食品分子營養(yǎng)學。E-mail：312334609@qq.com

*通信作者：羅非君（1968-），男，研究員，博士，研究方向為食品分子營養(yǎng)學。E-mail：luofeijun@hotmail.com