制備型反相高效液相色譜分離豬股骨降血壓肽的研究

舒一梅，李　誠(chéng)，李凌希，郭　威，陳　娜，鄭麗君，肖　嵐，曾　珍

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安625014）

制備型反相高效液相色譜分離豬股骨降血壓肽的研究

舒一梅，李誠(chéng)*，李凌希，郭威，陳娜，鄭麗君，肖嵐，曾珍

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安625014）

豬股骨酶解液經(jīng)超濾、凝膠層析、離子交換層析分離后，為了得到高活性且純度較高的降血壓肽單體，采用制備型反相高效液相色譜（RP-HPLC）對(duì)離子交換層析分離后的高活性組分進(jìn)一步分離。通過(guò)對(duì)洗脫條件的優(yōu)化，確定了最佳分離條件：0～5min 0%～80%A；5～8min 80%～100%A；8～15min 80%～60%A；15～20min 60%～20%A。結(jié)果顯示：第一步RP-HPLC分離得到三個(gè)組分，其中峰Z2的活性最高，其IC50值為0.0437mg/mL；組分Z2進(jìn)行第二步RP-HPLC分離，其峰Z21的IC50值達(dá)到0.0352mg/mL，其純度達(dá)到96.7%。通過(guò)分析Z21的氨基酸組成以及LC-MS的分離鑒定，確定其含有6種氨基酸（Glu、Ala、Val、Leu、Phe、Pro），其分子量為764.8。

豬股骨酶解液，降血壓肽，反相高效液相色譜，液質(zhì)聯(lián)用，ACE半抑制濃度

豬股骨經(jīng)酶解后得到的酶解液成分復(fù)雜，要得到高活性的豬股骨降血壓肽需經(jīng)多次的分離純化。多肽的分離、純化和鑒定中應(yīng)用較多的是反相高效液相色譜（RP-HPLC），RP-HPLC分辨率和回收率高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單，色譜過(guò)程穩(wěn)定[1]。在尋找多肽類物質(zhì)分離的最佳條件上，有不少學(xué)者做了大量的工作，如何保持多肽活性、如何選擇固定相材料、洗脫液種類、如何分析測(cè)定都是目前研究的內(nèi)容[2]，如潘道東等[3]、Yamamoto等[4]、吳亞麗等[5]利用RP-HPLC分離出了不同序列的降血壓肽。

豬股骨酶解液在經(jīng)過(guò)超濾、凝膠層析、離子交換層析之后，具有較高ACE抑制活性的多肽被分離出來(lái)，但仍然未能分離至單體，為了進(jìn)一步研究豬股骨降血壓肽的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，采用制備型RP-HPLC（反相高效液相色譜）進(jìn)行分離，以期純化出豬股骨降血壓肽單體，為促使降血壓肽產(chǎn)品或藥物的開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

豬股骨骨粉降血壓肽粗提物[6]豬股骨酶解后經(jīng)超濾、凝膠層析、離子交換層析分離而得到，實(shí)驗(yàn)室自制；ACE、HHL美國(guó)Sigma公司；乙腈、三氟乙酸色譜純；蛋白含量檢測(cè)試劑盒南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；其他均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

QT-2漩渦混勻器上海琪特分析儀器有限公司；紫外分光光度計(jì)UV-3200MAPADA；冷凍干燥機(jī)、高速冷凍離心機(jī)、移液槍Thermo Fisher；超純水裝置優(yōu)普公司；pH計(jì)方舟科技；制備型高效液相色譜（配有BUCHI Photometer C-640紫外檢測(cè)器）BUCHI；高效液相色譜IC-2010（配有可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)和LC-solution色譜工作站）日本島津；Agilent 6100 LC-MS安捷倫；氨基酸成分分析儀日本日立公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1制備型RP-HPLC分離以豬股骨降血壓肽粗提物為原料，通過(guò)改變洗脫條件對(duì)制備型RP-HPLC分離純化豬股骨降血壓肽的條件進(jìn)行優(yōu)化，以組分峰的分離度和ACE抑制活性作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以獲得較佳的分離純化條件（每一條件進(jìn)行6次以上平行實(shí)驗(yàn)，直到每次平行實(shí)驗(yàn)的分離圖譜一致）。色譜柱：C18柱（SKR-10，5μm，300A，25mm×250mm）；進(jìn)樣體積：0.5mL；蛋白濃度：10mg/mL；流速：2.5mL/min；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：214nm。本實(shí)驗(yàn)選用的流動(dòng)相為：A液（5%乙腈，含0.05%TFA），B液（95%乙腈，含0.05% TFA）。

1.2.1.1第一步制備型RP-HPLC分離利用不同的洗脫條件進(jìn)行洗脫，可以得到不同的分離效果色譜圖，以組分峰的分離度較好的色譜圖來(lái)選擇最佳的洗脫條件。在最佳洗脫條件下，分離得到的各組分冷凍干燥后測(cè)定其抑制ACE活性，收集ACE抑制活性最高的組分。

1.2.1.2第二步制備型RP-HPLC分離洗脫條件為第一步RP-HPLC的最佳分離條件。將經(jīng)第一步RPHPLC分離得到的高活性組分再進(jìn)行第二步RP-HPLC分離，直到分離出的降血壓肽純度大于95%。將分離出的各組分冷凍干燥后測(cè)定其ACE抑制活性，收集活性最高組分冷凍干燥，備用。

1.2.1.3純度測(cè)定將經(jīng)過(guò)制備型RP-HPLC分離出來(lái)的ACE抑制活性最高的降血壓肽通過(guò)分析型RPHPLC進(jìn)行純度鑒定[7-9]，色譜柱：C18（Shim-pack VPODS 4.6mm×250mm，5μm）；進(jìn)樣體積：10μL；蛋白濃度：10mg/mL；流速：1mL/min；柱溫：25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：214nm。實(shí)驗(yàn)選用的流動(dòng)相為：A液（5%乙腈），B液（95%乙腈）。洗脫條件：0～5min 0%～20%B；5～8min 20%～40%B；8～15min 40%～60%B；15～20min 20%～0%B。

1.2.2氨基酸分析將制備型RP-HPLC分離出來(lái)的ACE抑制活性最高的組分冷凍干燥后稱取10mg采用酸水解法[10]測(cè)定其氨基酸成分，取三組進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，然后上機(jī)測(cè)定。

1.2.3LC-MS鑒定將兩步RP-HPLC分離得到的ACE抑制活性最高的組分冷凍干燥后，配成一定濃度的樣品溶液，上機(jī)測(cè)定，得質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)。

離子方式：ESI+；毛細(xì)管電壓：3000V；錐孔電壓：30V；離子源溫度：100℃；脫溶劑氣溫度：250℃；質(zhì)量范圍：100～2000m/z；光電倍增器電壓：700V；分析柱：AtlantisC-182 4.6mm×150mm；流動(dòng)相：A液（5%乙腈），B液（95%乙腈）。洗脫條件：0～5min 0%～20%B；5～8min 20%～40%B；8～15min 40%～60%B；15～20min 20%～0%B。柱溫：25℃；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：10μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：214nm。

1.2.4指標(biāo)的測(cè)定

1.2.4.1ACE抑制率的測(cè)定ACE抑制率的測(cè)定主要采用經(jīng)典的紫外分光光度法測(cè)定[11-12]。具體操作如表1，ACE抑制率計(jì)算見(jiàn)式（1）。

表1　ACE抑制活性測(cè)定方法Table.1　The determination methods of ACE inhibitory activity

式中：Aa：樣a的吸光度，樣a加入了樣品液，與ACE、HHL共同反應(yīng)的測(cè)定值；Ab：樣b的吸光度，樣b為反應(yīng)中未加入樣品液，反應(yīng)結(jié)束后添加樣品液以維持整個(gè)反應(yīng)體系平衡，是ACE與HHL完全反應(yīng)的參照的測(cè)定值；Ac：樣c的吸光度，樣c在反應(yīng)前先使ACE失活，再加入樣品液，是ACE與HHL反應(yīng)的空白對(duì)照的測(cè)定值。

1.2.4.2IC50值測(cè)定方法將樣品配制成不同的濃度（實(shí)驗(yàn)點(diǎn)≥5），分別測(cè)定其ACE抑制率，以樣品濃度為橫坐標(biāo)，ACE抑制率為縱坐標(biāo)，繪制圓滑曲線，用對(duì)數(shù)幾率圖解法計(jì)算出IC50值。

1.2.4.3蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定主要采用Lowry法蛋白含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定。

2　結(jié)果與分析

2.1制備型RP-HPLC分離降血壓肽

采用連續(xù)兩步制備型反相高效液相色譜分離豬股骨降血壓肽，第一次分離結(jié)果如圖1所示，分離出三個(gè)峰Z1、Z2、Z3。最佳的洗脫條件為：0～5min 0%～80%A；5～8min 80%～100%A；8～15min 80%～60%A；15～20min 60%～20%A。按Z1、Z2、Z3部分進(jìn)行收集，冷凍干燥后測(cè)定各組分的ACE的抑制活性，結(jié)果如表2所示，3個(gè)收集組分中Z2活性最高。因此，對(duì)Z2組分進(jìn)行第二步分離，結(jié)果如圖2所示，將Z2分成了2個(gè)主要組分Z21、Z22，分別收集，冷凍干燥后測(cè)定其對(duì)ACE的抑制活性結(jié)果見(jiàn)表3，2個(gè)收集組分中Z21ACE抑制活性最高。

圖1　第一步RP-HPLC分離圖Fig.1　The Chromatogram of the fiactions separated by the first HPLC step

表2　第一步RP-HPLC各組分IC50值Table.2　The IC50of the fiactions separated by the first HPLC step

圖2　第二步RP-HPLC分離色譜圖Fig.2　The Chromatogram of the fiactions separated by the first second RP-HPLC step

表3　第二步RP-HPLC各組分IC50值Table.3　The IC50of the fiactions separated by the second RP-HPLC step

2.2純度鑒定

采用分析型RP-HPLC分析Z21的純度，如圖3所示。通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析，其純度為96.7%。

圖3　Z21純度鑒定色譜圖Fig.3　The RP-HPLC Chromatogram of fiaction Z21

2.3氨基酸成分分析

經(jīng)兩步RP-HPLC分離后，收集的Z21成分其氨基酸成分分析如表4所示。

表4　Z21的氨基酸成分及含量Table.4　The content of hydrolytic amino acids in Z21

從表4可看出，分離出的ACE抑制高活性成分Z21含有6種氨基酸，分別為Glu、Ala、Val、Leu、Phe、Pro，說(shuō)明Z21含有豐富的疏水性氨基酸。

2.4LC-MS鑒定

將分離出的組分Z21通過(guò)LC-MS分離鑒定。ESI質(zhì)譜對(duì)肽和蛋白質(zhì)的分析一般以正離子質(zhì)譜方式進(jìn)行。Z21的正離子質(zhì)譜圖如圖4所示。

圖4　Z21質(zhì)譜圖Fig.4　Mass spectrum of Z21performed by mass spectrometry analysis

用質(zhì)譜法測(cè)定肽的序列是根據(jù)其質(zhì)譜中碎片離子來(lái)推導(dǎo)的。質(zhì)譜中出現(xiàn)的碎片序列信息主要通過(guò)酰胺鍵（肽鍵）的斷裂來(lái)形成。圖4中分子離子峰（M+ H）+所對(duì)應(yīng)的是765.8。因此，Z21的分子量為764.8。

大量學(xué)者的研究認(rèn)為，ACE抑制肽的抑制活性主要取決于C末端的氨基酸，C末端氨基酸為芳香族氨基酸（包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）和脯氨酸時(shí)其抑制活性較高。此外，N末端為疏水性的纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸或堿性氨基酸的肽與ACE的親和力較強(qiáng)，抑制活性較高[13]。Z21中含有豐富的疏水性氨基酸，如Pro、Phe、Leu等，與Cheung等[14]的結(jié)論一致，是具有高活性的ACE抑制肽。

3　結(jié)論與討論

以豬股骨降血壓肽粗提物為原料，采用了RPHPLC法及連續(xù)兩步RP-HPLC分離豬股骨降血壓肽。經(jīng)兩步RP-HPLC分離后，得到Z21活性成分，經(jīng)分析型RP-HPLC檢測(cè)，其純度達(dá)到96.7%。通過(guò)質(zhì)譜測(cè)定、解析，降血壓肽Z21的分子質(zhì)量為764.8，其IC50值為0.0352mg/mL。

在分離豬股骨降血壓肽的過(guò)程中，每一個(gè)純化步驟未能分離出高純度的豬股骨降血壓肽單體，因此結(jié)合多個(gè)分離純化的單元技術(shù)，能夠更好的分離出豬股骨降血壓肽單體。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RP-HPLC技術(shù)，優(yōu)化了RP-HPLC的分離條件，分離出的豬股骨降血壓肽純度達(dá)到96.7%，說(shuō)明其具有很高的ACE抑制活性。本實(shí)驗(yàn)是通過(guò)體外活性的測(cè)定進(jìn)行評(píng)價(jià)的，在條件許可的情況下，后續(xù)應(yīng)進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、驗(yàn)證其活性，放大實(shí)驗(yàn)，為實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化提供參考。

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Isolation and identification of antihypertension peptides from pig femoral collagen with RP-HPLC

SHU Yi-mei，LI Chen*，LI Ling-xi，GUO Wei，CHEN Na，ZHENG Li-jun，XIAO Lan，ZENG Zhen
（College of Food，Sichuan Agriculture University，Ya’an 625014，China）

In order to obtain high activity and purity of antihypertensive peptides，the method of RP-HPLC was used to separate the solution after the preliminary separation and charactenization by ultrafiltration，gel permeation chromatography and ion exchange chromatography.Studying the effect of separation and purification on the factors of elution conditions，the optimal conditions for analysis were as follows：0～5min 0%～80%A；5～8min 80%～100%A；8～15min 80%～60%A；15～20min 60%～20%A.The results showed that the fraction was then purified by frist RP-HPLC into 3 peaks，in which peak Z2had the strongest ACE inhibitory activity with an IC50of 0.0437mg/mL.The peak Z2was desalinationted by the second RP-HPLC.The peak Z21had the highest ACE inhibitory activity which with an IC50of 0.0352mg/mL，the purity was 96.7%.Through the analysis of the amino acid of Z21and identification of LC-MS，it contained six kinds of amino acids（Glu，Ala，Val，Leu，Phe，Pro），the molecular weight was 764.8.

enzymolysis liquid of the pig femoral；antihypertensive peptides；RP-HPLC；LC-MS；the half inhibitory concentration of ACE

TS251

B

1002-0306（2015）04-0265-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.049

2014－07－31

舒一梅（1989-），女，在讀碩士研究生，研究方向：畜產(chǎn)品質(zhì)量與安全。

李誠(chéng)（1964-），男，教授，研究方向：畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全控制。