精氨酸通過內(nèi)分泌途徑調(diào)控氧化應(yīng)激仔豬生長相關(guān)因子基因表達(dá)

鄭 萍 余 冰 何 軍 虞 潔 毛湘冰 羅鈞秋 黃志清 王曲圓 陳代文

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所，教育部動物抗病營養(yǎng)重點實驗室，雅安 625014)

氧化應(yīng)激可影響機(jī)體健康，降低仔豬生長性能［1-2］。養(yǎng)豬生產(chǎn)中，許多因素使機(jī)體自由基產(chǎn)生過量或細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)受損，從而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激［3］。精氨酸(Arg)是合成生物學(xué)重要分子如一氧化氮(NO)、多胺、肌酸的重要前體物，可促進(jìn)胰島素和生長激素分泌、調(diào)節(jié)養(yǎng)分代謝等［4］。在應(yīng)激或疾病狀態(tài)下，Arg被認(rèn)為是豬的必需氨基酸［5］。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充Arg可以緩解代謝綜合征［6-7］，促進(jìn)動物生長［8］，提高胚胎存活率［9-10］，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化功能［11］，降低氧化應(yīng)激的危害。本實驗室前期的研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充Arg可以提高氧化應(yīng)激仔豬的采食量，緩解氧化應(yīng)激仔豬的失重［12］，那么Arg抗氧化應(yīng)激的作用途徑是什么呢?目前還缺乏相關(guān)研究報道。本試驗通過Diquat誘導(dǎo)仔豬的氧化應(yīng)激［13-17］，研究 Arg對氧化應(yīng)激仔豬內(nèi)分泌及生長相關(guān)因子基因表達(dá)的影響，探尋Arg抗氧化應(yīng)激的作用機(jī)制，為生產(chǎn)上合理應(yīng)用Arg提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

Diquat(貨號:PS365)，購于美國Sigma公司。

1.2 試驗設(shè)計

試驗選擇24頭21日齡健康PIC斷奶仔公豬，經(jīng)過1周的預(yù)飼，按體重相近的原則隨機(jī)分為4組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)1頭豬，分別飼喂基礎(chǔ)飼糧+注射生理鹽水(對照組)、基礎(chǔ)飼糧+注射Diquat(氧化應(yīng)激組)、基礎(chǔ)飼糧+0.8%Arg+注射 Diquat(0.8%Arg組)、基礎(chǔ)飼糧 +1.6%Arg+注射Diquat(1.6%Arg組)。正式試驗第8天08:00，各試驗組仔豬空腹稱重采血后腹腔注射用滅菌生理鹽水配成的10 mg/mL的Diquat溶液(10 mg/kg BW)［12］誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，對照組仔豬注射等量的滅菌生理鹽水。正式試驗期共11 d。

1.3 試驗飼糧

試驗用基礎(chǔ)飼糧為玉米-豆粕型飼糧，飼糧配制參照NRC(1998)5～10 kg仔豬營養(yǎng)需要以及豬場PIC仔豬飼料營養(yǎng)水平配制［18］，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)成分見表1。0.8%和1.6%Arg組分別以0.8%和1.6%的Arg等量替代基礎(chǔ)飼糧中的玉米。

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所試驗豬場進(jìn)行，豬舍溫度控制在(25±1)℃，每天飼喂4次(08:00、12:00、16:00、20:00)，每次以采食后料槽略有少量余料為度，所有仔豬自由采食和飲水，按常規(guī)程序進(jìn)行消毒。

1.5 樣品采集與處理

分別于應(yīng)激前(0 h)，應(yīng)激后24、48和96 h，全部仔豬空腹用含肝素的真空采血管于前腔靜脈采血10 mL，3 000 r/min離心10 min，收集血漿，-20 ℃保存待測。于試驗第11天，空腹稱重后采血，然后進(jìn)行麻醉屠宰，迅速取肝臟、背最長肌樣品，用液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 測定指標(biāo)及方法

1.6.1 血漿胰島素、胰島素樣生長因子 -Ⅰ(IGF-Ⅰ)的濃度

血漿中胰島素、IGF-Ⅰ的濃度采用豬胰島素和IGF-Ⅰ酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(R＆D，美國)進(jìn)行測定。具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.6.2 血漿和肝臟一氧化氮合成酶(NOS)的活性

采用試劑盒測定血漿和肝臟中總一氧化氮合成酶(tNOS)和誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)的活性，詳細(xì)方法參見南京建成生物工程研究所試劑盒操作說明。

1.6.3 肝臟和肌肉生長相關(guān)因子基因表達(dá)

（2）針對目前硫磺裝置在開停工過程或緊急情況下的SO2超標(biāo)問題，為保證煙氣SO2穩(wěn)定達(dá)標(biāo)排放，減少廢水、廢堿渣和冒白煙等現(xiàn)象的產(chǎn)生，建議結(jié)合雙塔吸收工藝優(yōu)點與后堿洗工藝的特點，能夠有效降低和解決這些問題。

所測肝臟和肌肉生長相關(guān)因子基因包括IGF-Ⅰ、胰島素樣生長因子-Ⅰ受體(IGF-ⅠR)、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3(IGFBP3)。肝臟和肌肉組織總RNA提取按照 Trizol試劑(TaKaRa，大連)說明書進(jìn)行，提取的總RNA溶解于無RNA酶水溶液(TaKaRa，大連)中?？俁NA提取后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA的完整性;核酸蛋白儀(Beckman Coulter DU800，CA，美國)于 260 nm 波長處檢測RNA濃度。cDNA合成采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，大連)，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為:在PCR儀(Bio-Rad，美國)中，37℃下孵化15 min(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))，85℃下靜置5 s(反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng))，反應(yīng)產(chǎn)物即cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實時熒光定量PCR用Option Monitor 3 Real-Time PCR檢測系統(tǒng)(Bio-Rad，美國)，采用TaKaRa SYBR Green SupermixⅡ試劑盒，引物序列及參數(shù)見表2。反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性30 s;95℃變性10 s;退火溫度下退火20 s;40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后作熔解曲線，產(chǎn)生單峰以證實產(chǎn)物的單一性。結(jié)果用Pfaffl［19］的方法進(jìn)行計算。

表2 實時熒光定量PCR引物序列及參數(shù)Table 2 Primer sequences and parameters for real-time PCR

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，差異顯著者進(jìn)行Duncan氏多重比較。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，以P＜0.05為差異顯著標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧補(bǔ)充Arg對氧化應(yīng)激仔豬血漿胰島素、IGF-Ⅰ濃度的影響

由表3可知，注射Diquat前，各組仔豬血漿胰島素濃度無顯著差異(P＞0.05)，Arg對血漿胰島素濃度無顯著影響(P＞0.05)。氧化應(yīng)激顯著降低仔豬應(yīng)激后24 h血漿胰島素濃度(P＜0.05)，對應(yīng)激后48和96 h的血漿胰島素濃度影響不顯著(P＞0.05)。與氧化應(yīng)激組相比，補(bǔ)充 1.6%Arg使仔豬應(yīng)激后24、96 h的血漿胰島素濃度分別升高了 113%(P ＞0.05)、121%(P ＞0.05);與對照組相比，補(bǔ)充1.6%Arg可顯著升高仔豬應(yīng)激后96 h的血漿胰島素濃度(P＜0.05)。

注射Diquat前，補(bǔ)充1.6%Arg顯著升高了血漿IGF-Ⅰ的濃度(P＜0.05)。與對照組相比，氧化應(yīng)激可顯著降低仔豬應(yīng)激后24 h的血漿IGF-Ⅰ濃度(P＜0.05)，對應(yīng)激后48 h的血漿IGF-Ⅰ濃度影響不顯著(P＞0.05)，但顯著升高了應(yīng)激后96 h的血漿IGF-Ⅰ濃度(P＜0.05)。與氧化應(yīng)激組相比，補(bǔ)充0.8%Arg可顯著增加仔豬應(yīng)激后48 h的血漿IGF-Ⅰ濃度(P ＜0.05)，補(bǔ)充1.6%Arg 使仔豬應(yīng)激后24、48、96 h的血漿IGF-Ⅰ濃度分別升高了13%(P ＞0.05)、44%(P ＜0.05)、15%(P ＜0.05)。

表3 飼糧補(bǔ)充Arg對氧化應(yīng)激仔豬血漿胰島素和IGF-Ⅰ濃度的影響Table 3 Effects of arginine supplementation on plasma concentrations of insulin and IGF-Ⅰof piglets under oxidative stress ng/mL

2.2 飼糧補(bǔ)充Arg對氧化應(yīng)激仔豬血漿一氧化氮合成酶活性的影響

由表4可見，氧化應(yīng)激和補(bǔ)充Arg對仔豬血漿tNOS、iNOS活性的影響均不顯著(P＞0.05)。

2.3 飼糧補(bǔ)充Arg對氧化應(yīng)激仔豬肝臟一氧化氮合成酶活性的影響

由表5可見，氧化應(yīng)激顯著降低仔豬肝臟tNOS、iNOS 的活性(P ＜0.05)。補(bǔ)充 0.8%Arg能顯著抑制因氧化應(yīng)激導(dǎo)致的tNOS活性的降低(P＜0.05)，補(bǔ)充1.6%Arg能顯著升高氧化應(yīng)激下仔豬肝臟 tNOS、iNOS的活性(P ＜0.05)。

2.4 飼糧補(bǔ)充Arg對氧化應(yīng)激仔豬肝臟IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR和IGFBP3 mRNA表達(dá)的影響

由圖1可見，氧化應(yīng)激顯著降低仔豬肝臟IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR和IGFBP3 mRNA的相對表達(dá)量(P＜0.05)。補(bǔ)充0.8%Arg能顯著增加因氧化應(yīng)激導(dǎo)致的IGF-Ⅰ mRNA相對表達(dá)量的下降(P＜0.05)，補(bǔ)充1.6%Arg能顯著增加因氧化應(yīng)激導(dǎo)致的IGF-Ⅰ和IGFBP3 mRNA相對表達(dá)量的下降(P＜0.05)。

表4 飼糧補(bǔ)充Arg對氧化應(yīng)激仔豬血漿一氧化氮合成酶活性的影響Table 4 Effects of arginine supplementation on plasma activities of NOS of piglets under oxidative stress U/mL

圖1 飼糧補(bǔ)充Arg對氧化應(yīng)激仔豬肝臟IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR和IGFBP3 mRNA表達(dá)的影響Fig.1 Effects of arginine supplementation on liver expression of IGF-Ⅰ，IGF-ⅠR and IGFBP3 mRNA of piglets under oxidative stress

2.5 飼糧補(bǔ)充Arg對氧化應(yīng)激仔豬肌肉IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR和IGFBP3 mRNA表達(dá)的影響

由圖2可見，氧化應(yīng)激對仔豬肌肉IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR和IGFBP3 mRNA的相對表達(dá)量無顯著影響(P＞0.05)。補(bǔ)充1.6%Arg能顯著增加氧化應(yīng)激仔豬肌肉IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR和IGFBP3 mRNA的相對表達(dá)量(P＜0.05)。

圖2 飼糧補(bǔ)充Arg對氧化應(yīng)激仔豬肌肉IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR和IGFBP3 mRNA表達(dá)的影響Fig.2 Effects of arginine supplementation on muscle expression of IGF-Ⅰ，IGF-ⅠR and IGFBP3 mRNA of piglets under oxidative stress

3 討論

生產(chǎn)上許多因素會使仔豬遭遇氧化應(yīng)激，導(dǎo)致生產(chǎn)性能降低，甚至繼發(fā)感染各種疾病。研究發(fā)現(xiàn)，Arg具有抗氧化應(yīng)激的作用［20］。本實驗室之前的研究也表明，飼糧補(bǔ)充Arg能緩解仔豬氧化應(yīng)激［12］，本試驗在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究了Arg抗仔豬氧化應(yīng)激的作用機(jī)制。

應(yīng)激和內(nèi)分泌有著重要的關(guān)系。Wright等［21］研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素(LPS)增加了公豬的血液皮質(zhì)醇和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的濃度，降低了血液中IGF-Ⅰ的濃度。血液中胰島素和IGF-Ⅰ的濃度與仔豬生長性能有著重要的關(guān)系。在生長性能很差的仔豬上發(fā)現(xiàn)，血液循環(huán)中IGF-Ⅰ和IGFBP3的濃度都很低［22］。本試驗中，Diquat誘導(dǎo)的仔豬氧化應(yīng)激可顯著降低仔豬血漿胰島素和IGF-Ⅰ的濃度。Priego等［23］報道，注射LPS可降低大鼠血漿IGF-Ⅰ濃度和肝臟 IGF-Ⅰ mRNA的表達(dá)，本試驗結(jié)果與此一致，氧化應(yīng)激顯著降低了應(yīng)激后24 h的血漿IGF-Ⅰ濃度以及肝臟 IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR和IGFBP3 mRNA的相對表達(dá)量。此外，本試驗中對照組仔豬應(yīng)激后96 h的血漿胰島素濃度較其他時間點大幅度的降低，而96 h血漿IGF-Ⅰ濃度則大幅度的升高，分析其原因可能是應(yīng)激會導(dǎo)致胰島素分泌的下降，連續(xù)的采血對豬只也是一種應(yīng)激;IGF-Ⅰ濃度升高的原因可能與機(jī)體的自我修復(fù)功能有關(guān)，具體的原因有待進(jìn)一步的研究。

Arg可通過刺激胰島素和生長激素的分泌，調(diào)節(jié)應(yīng)激狀態(tài)下動物的代謝，增加蛋白質(zhì)的合成代謝，降低蛋白質(zhì)的分解代謝［24-25］。Liu 等［26］研究認(rèn)為，補(bǔ)充Arg能減低LPS應(yīng)激斷奶仔豬蛋白質(zhì)分解代謝，維持骨骼肌蛋白質(zhì)的沉積率，從而緩解LPS應(yīng)激導(dǎo)致的仔豬生長受阻。本試驗結(jié)果顯示，補(bǔ)充Arg可顯著增加氧化應(yīng)激仔豬的血漿胰島素和IGF-Ⅰ濃度以及肝臟IGF-Ⅰ mRNA的相對表達(dá)量;同時，本實驗室之前的研究結(jié)果顯示，補(bǔ)充Arg可緩解氧化應(yīng)激導(dǎo)致的仔豬生產(chǎn)性能的下降［12］。肌肉是IGF-Ⅰ轉(zhuǎn)錄的重要場所，本試驗結(jié)果顯示，補(bǔ)充Arg顯著增加了氧化應(yīng)激條件下仔豬肌肉IGF-Ⅰ基因的表達(dá)，說明Arg通過上調(diào)氧化應(yīng)激條件下仔豬肌肉中IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR和IGFBP3 mRNA的表達(dá)，從而影響氧化應(yīng)激仔豬肌肉蛋白質(zhì)的合成。研究發(fā)現(xiàn)，IGF-Ⅰ是一種潛在的抗氧化劑，能顯著降低體外培養(yǎng)大鼠軟骨細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平［27］，通過穩(wěn)定線粒體保護(hù)成年大鼠缺血/再灌注模型的心肌細(xì)胞免受活性氧損傷［28］，保護(hù)腸上皮細(xì)胞免受氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［29］。補(bǔ)充Arg可上調(diào)氧化應(yīng)激仔豬肝臟IGF-ⅠmRNA的表達(dá)，也可能是Arg調(diào)控機(jī)體抵御氧化應(yīng)激的另一種機(jī)制。以上結(jié)果說明，Arg抗氧化應(yīng)激的作用途徑之一是通過對內(nèi)分泌的調(diào)控作用，上調(diào)氧化應(yīng)激仔豬胰島素和IGF-Ⅰ的濃度，從而緩解仔豬氧化應(yīng)激。

此外，有研究顯示，Arg可通過NO途徑促進(jìn)激素的分泌［5，30］。本試驗中，補(bǔ)充Arg能改善氧化應(yīng)激仔豬肝臟一氧化氮合成酶的活性，顯著提高肝臟IGF-ⅠmRNA的表達(dá)。研究表明，血液循環(huán)中的IGF-Ⅰ主要來源于肝臟的生物合成［31］。因此，結(jié)合本試驗結(jié)果，推測給氧化應(yīng)激仔豬補(bǔ)充Arg可活化肝臟一氧化氮合成酶活性，并通過NO途徑調(diào)控肝臟IGF-Ⅰ的合成，進(jìn)而影響循環(huán)中IGF-Ⅰ的濃度。同時，血液指標(biāo)結(jié)果顯示，補(bǔ)充Arg對氧化應(yīng)激仔豬血漿NOS的活性無顯著影響，這說明Arg-NO途徑可能存在組織特異性，氧化應(yīng)激仔豬補(bǔ)充Arg促進(jìn)激素分泌可能通過依賴和不依賴NO的2種途徑。

綜上所述，Arg緩解仔豬氧化應(yīng)激的途徑之一是通過促進(jìn)胰島素、IGF-Ⅰ的分泌，進(jìn)而調(diào)控生長相關(guān)因子基因表達(dá)，其具體的作用機(jī)制是否依賴于NO途徑還有待于進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

Arg通過促進(jìn)胰島素、IGF-Ⅰ的分泌進(jìn)而上調(diào)生長相關(guān)因子基因表達(dá)是其緩解仔豬氧化應(yīng)激的途徑之一。

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