核轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子基因缺失對(duì)高脂飼糧誘導(dǎo)非酒精性脂肪肝模型小鼠肝臟的影響

崔一喆 王秋菊 張秀英 王春花 李廣亮 齊 悅

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030;2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319)

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是以肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪貯積和脂肪變性為特征的臨床病理綜合征［1］。近年來(lái)，由于脂肪和高糖等攝入增加、激素食品泛濫等因素，使NAFLD發(fā)病率逐年增高。NAFLD在雞、狗、豬、牛、羊以及魚(yú)等動(dòng)物也可發(fā)生，是各種動(dòng)物的原發(fā)或者繼發(fā)性疾病［2－3］，在雞、鴨的發(fā)病率較高，給禽類(lèi)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)的重經(jīng)濟(jì)損失［4］。有文獻(xiàn)報(bào)道轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子(nuclear factor erythroid 2-like 2，Nrf2)基因的缺失會(huì)明顯加重NAFLD的進(jìn)程［5］。Nrf2可降低肝臟對(duì)氧化應(yīng)激的敏感性，保持肝臟功能的穩(wěn)定以及阻止肝臟疾病的發(fā)生，在肝損傷、脂肪肝、肝纖維化及肝癌等方面具有保護(hù)作用［6］，但Nrf2是否會(huì)改變高脂飼糧誘導(dǎo)的肝細(xì)胞毒性尚不清楚。因此，本試驗(yàn)采用高脂飼糧誘導(dǎo)NAFLD模型，結(jié)合基因敲除，研究Nrf2基因缺失對(duì)NAFLD小鼠肝臟氧化應(yīng)激的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

野生型(wild type，WT)和 Nrf2基因敲除(knock out，KO)ICR 雄性小鼠，18 ～20 g，購(gòu)自南京軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心，小鼠基因型鑒定由中國(guó)人民解放軍南京軍區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物中心鑒定［鑒定號(hào):SCXK(軍)2007-012］，本實(shí)驗(yàn)室采用PCR法對(duì)小鼠基因型進(jìn)行鑒定。小鼠分籠飼養(yǎng)，試驗(yàn)前空腹過(guò)夜，自由飲水。

1.2 高脂飼糧(high fat diet，HFD)的制備方法

膽固醇由天津虔誠(chéng)偉業(yè)科技發(fā)展有限公司提供，批號(hào):20100122;膽鹽、糊精均由北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，批號(hào):20120202;豬油為超市購(gòu)買(mǎi)。HFD的配方由前期試驗(yàn)確定［7］，按照普通飼料68.5%、豬油15%、膽固醇1%、膽鹽0.5%和糊精15%，稱(chēng)取各種成分，將膽固醇和膽鹽與普通飼糧(normal diet，ND)粉末混合均勻，再加入熬制好的豬油，待混合均勻后，加入糊精和一定比例的水，用制粒機(jī)壓制成型后，烘干備用。

1.3 動(dòng)物模型的分組

將WT和KO小鼠，分別隨機(jī)分成2組，分別飼喂ND和 HFD。各組分別表示為 WT-ND、WTHFD、KO-ND、KO-HFD。自由采食，自由飲水，試驗(yàn)期為8周。試驗(yàn)過(guò)程中，每周記錄各小鼠體重，每天觀察各組小鼠外觀形態(tài)變化、采食行為及其對(duì)外界反應(yīng)等。

1.4 樣品的采集和處理

在第8周末禁食12 h后，眼球采血后處死小鼠。全血3 000 r/min離心10 min分離血清，－20℃凍存，用于血清學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)。斷頸處死小鼠，腹部正中十字切口，暴露肝臟，預(yù)冷生理鹽水沖洗后，去除多余結(jié)締組織，濾紙吸干。在肝臟最大葉距邊緣5 mm處取小塊肝組織，一部分液氮凍存，用于酶活性檢測(cè);一部分用10%中性甲醛溶液固定，用于蘇木精－伊紅(HE)和油紅染色，制作切片。

1.5 血清學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)

采用Beckman CX4型全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminot ransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartat eaminotransferase，AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、甘油三酯(triglycerides，TG)、總 膽 固 醇 (total cholesterol，TC)、高 密 度 脂 蛋 白 (high-density lipoprotein，HDL)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)和總蛋白(total protein，TP)的含量或活性。其中ALT、AST和ALP活性采用速率法檢測(cè)，TG和TC含量采用液體雙試劑酶法檢測(cè)，HDL和LDL含量采用直接法檢測(cè)，TP含量采用雙縮脲法測(cè)定。

1.6 肝臟酶活性的檢測(cè)

谷胱甘肽(glutathione，GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化物酶(peroxidase，POD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量或活性測(cè)定試劑盒購(gòu)置南京建成生物工程研究所。按試劑盒說(shuō)明書(shū)要求，分別取10%勻漿上清0.5 mL，加試劑一應(yīng)用液 2 mL混勻，3 500 r/min離心10 min，取上清液1 mL進(jìn)行顯色反應(yīng)。

1.7 數(shù)據(jù)處理

所有計(jì)量數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，數(shù)據(jù)處理與分析采用SAS 6.12的GLM程序進(jìn)行，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 HFD對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能的影響

從表1小鼠的體重動(dòng)態(tài)變化來(lái)看，WT-ND、KO-ND、WT-HFD和KO-HFD各組之間相比，小鼠的初始體重和末體重沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)，各組小鼠在飼養(yǎng)期內(nèi)的日增重和日采食量也沒(méi)有顯著差異(P ＞0.05)。

2.2 HFD對(duì)小鼠血清學(xué)指標(biāo)的影響

WT和KO小鼠血清學(xué)指標(biāo)結(jié)果見(jiàn)表2。與對(duì)照組小鼠比較，WT和KO高脂誘導(dǎo)NAFLD模型組小鼠TC、LDL含量和ALT、AST活性極顯著升高(P＜0.01)，ALP活性顯著或極顯著升高(P＜0.01或 P ＜0.05)，TP含量極顯著降低(P ＜0.01)，但TG和HDL含量變化不顯著(P＞0.05);與WT對(duì)照組小鼠比較，KO小鼠TC含量和ALP活性極顯著升高(P＜0.01)，HDL含量顯著升高(P ＜0.05)，TP含量極顯著降低(P ＜0.01)，ALT活性顯著降低(P＜0.05)，但 TG、LDL含量和AST活性變化不顯著(P＞0.05);與WT高脂誘導(dǎo)NAFLD模型組小鼠比較，KO高脂誘導(dǎo)NAFLD模型組小鼠HDL含量和ALP活性極顯著升高(P＜0.01)，TG含量和ALT活性顯著升高(P＜0.05)，LDL含量極顯著降低(P＜0.01)，TC含量和 AST活性顯著降低(P＜0.05)，但TP含量變化不顯著(P＞0.05)。

表1 高脂飼糧對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能的影響Table 1 Effects of high fat diet on growth performance of mice

表2 高脂飼糧誘導(dǎo)小鼠肝臟中血清學(xué)指標(biāo)的變化Table 2 Changes of high fat diet induced serum index of liver in mice

2.3 肝臟的病理學(xué)變化

HFD誘導(dǎo)8周后，WT和KO小鼠肝臟均通過(guò)肉眼觀察，可見(jiàn)對(duì)照組小鼠的肝臟呈紅褐色，表面光滑，邊緣銳利，質(zhì)軟有彈性(圖1中A和C);而NAFLD模型組小鼠的肝臟呈黃褐色，體積均勻性增大，肝臟質(zhì)地較硬，包膜緊張，邊緣鈍而厚，表面及切面呈灰黃色，有油膩感(圖1中B和D)。HE染色后，對(duì)照組小鼠肝臟無(wú)脂肪變性，小鼠肝細(xì)胞形態(tài)正常，肝索排列整齊，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞中央有大而圓的核，無(wú)明顯脂肪滴，基本未見(jiàn)炎癥細(xì)胞(圖1中E和G)。NAFLD模型組小鼠肝細(xì)胞核的相對(duì)大小不均，發(fā)生脂肪變性(小泡和大泡性脂肪變性)并伴有肝細(xì)胞壞死和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。WT高脂小鼠肝臟表現(xiàn)出的小泡性脂肪變性，KO高脂小鼠肝臟表現(xiàn)出嚴(yán)重的大泡性脂肪變性和溫和的小泡性脂肪變性(圖1中F和H)。油紅染色后，對(duì)照組小鼠肝臟有少量的脂肪滴紅染(圖1中I和K);HFD的NAFLD模型組小鼠肝臟有明顯的紅色脂肪滴(圖1中J和L)。

2.4 肝臟氧化應(yīng)激水平變化

HFD誘導(dǎo)8周后，肝臟中的GSH、SOD、POD和MDA含量或活性變化如表2所示。與對(duì)照組小鼠相比較，WT和KO高脂誘導(dǎo)NAFLD模型組小鼠肝臟中GSH含量和SOD活性顯著或極顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)，而POD 活性和MDA含量顯著或極顯著升高(P＜0.05或 P＜0.01)。與WT小鼠相比，KO高脂誘導(dǎo)NAFLD模型組小鼠肝臟中MDA含量增加49%，但GSH含量及SOD和POD活性變化不顯著(P＞0.05)。與WT對(duì)照組小鼠相比，KO小鼠肝臟中SOD、POD活性和MDA含量顯著或極顯著升高(P＜0.05或P＜ 0.01)，而GSH含量極顯著降低(P＜0.01)。

圖1 高脂飼糧誘導(dǎo)小鼠肝臟病理學(xué)變化Fig.1 High fat diet induced pathological changes of liver in mice

表3 肝臟中GSH、MDA含量和SOD、POD活性變化Table 3 Changes of GSH，MDA content and SOD，POD activity in liver

3 討論

3.1 NAFLD模型建立

本研究中采用高脂飼糧，分別飼喂野生型ICR小鼠和Nrf2基因敲除小鼠，通過(guò)各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)對(duì)模型建立進(jìn)行評(píng)價(jià)。試驗(yàn)中以AST、ALT和ALP作為肝細(xì)胞損傷的敏感指標(biāo)，在高脂飼糧誘導(dǎo)后，不論在野生型小鼠還是基因缺失型小鼠都顯著升高，符合建模評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)［8］。模型組小鼠血清中TC含量顯著高對(duì)照組，這與在有關(guān)患有NAFLD疾病中 TC水平升高的報(bào)道相一致［9］。邵洛林等［10］通過(guò)Pearson相關(guān)分析顯示，高脂飼糧飼喂小鼠后，TC和LDL肝指數(shù)與Nrf2的表達(dá)呈正相關(guān)，本試驗(yàn)中KO組小鼠TC和LDL含量顯著低于WT組小鼠，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致，同時(shí)，Tanaka等［11］和Kim等［12］研究發(fā)現(xiàn)，由于高脂飼糧誘導(dǎo)時(shí)間的不同，Nrf2及其靶基因的表達(dá)趨勢(shì)也不相同，這也可能是導(dǎo)致KO小鼠TC和LDL含量降低的原因，其機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。KO組比WT組的LDL、TC含量顯著降低，而HDL含量顯著升高，表明Nrf2基因缺失條件下，小鼠肝臟中脂類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至外周的能力降低，而由外周轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟能力升高，所以容易造成脂肪在肝臟中蓄積，這與病理變化中KO高脂小鼠肝臟表現(xiàn)出嚴(yán)重的大泡性脂肪變性相一致。

本試驗(yàn)病理結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠肝臟HE染色，肝臟細(xì)胞基本保持完整，肝小葉結(jié)構(gòu)正常;油紅染色后，基本沒(méi)有紅染的細(xì)胞;而模型組小鼠肝臟脂肪變性明顯，表明高脂飼糧誘導(dǎo)8周后在ICR小鼠及Nrf2基因敲除ICR小鼠成功構(gòu)建NAFLD模型。

3.2 高脂飼糧對(duì)肝臟抗氧化應(yīng)激酶活性的影響

本試驗(yàn)研究了高脂飼糧誘導(dǎo)下，野生型和Nrf2基因缺失型小鼠肝臟中，抗氧化酶活性的變化。GSH是細(xì)胞中主要的非蛋白疏基和主要的還原劑之一，是組織中氧化應(yīng)激檢測(cè)的主要指標(biāo)。GSH具有抗氧化性能和保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的毒性的作用。GSH含量下降可能是消耗增加或/和合成下降所造成的［13］。高脂飼糧誘導(dǎo)NAFLD模型的過(guò)程中GSH含量的降低，暗示了氧化應(yīng)激的發(fā)生，GSH含量降低的程度也反映了疾病的嚴(yán)重程度。我們的研究中觀察到與報(bào)道相似的結(jié)果。在高脂飼糧誘導(dǎo)下，野生型和Nrf2基因缺失型小鼠肝臟中GSH含量與對(duì)照組相比顯著降低。MDA是多不飽和脂肪酸過(guò)氧化分裂所形成的三碳化合物，是脂質(zhì)過(guò)氧化損傷反應(yīng)的產(chǎn)物之一，也是反映氧化應(yīng)激損害的經(jīng)典、有效的指標(biāo)之一。NAFLD疾病過(guò)程中MDA含量的增加也暗示了氧化應(yīng)激的發(fā)生，同樣與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)。MDA含量的增加與GSH含量的降低同時(shí)印證了氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生。SOD能夠催化超氧化物通過(guò)歧化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為氧氣和過(guò)氧化氫，是肝臟中重要的抗氧化酶。它可對(duì)抗與阻斷因氧自由基對(duì)細(xì)胞造成的損害，并及時(shí)修復(fù)受損細(xì)胞，復(fù)原因自由基造成的對(duì)細(xì)胞傷害。有資料報(bào)道，在NAFLD動(dòng)物模型中SOD活性降低［14］，有關(guān)人類(lèi)NAFLD報(bào)道中，部分資料顯示SOD活性降低［15－18］。POD代表著機(jī)體中的脂質(zhì)過(guò)氧化程度，當(dāng)機(jī)體中因?yàn)槟承┘膊∫蛩貙?dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化的時(shí)候，相應(yīng)的過(guò)氧化物酶也就會(huì)同時(shí)增加。

在本研究的過(guò)程中，以上4種酶的活性變化均與資料報(bào)道相一致。證明了本研究采用高脂飼糧誘導(dǎo)的NAFLD模型引起了肝臟氧化應(yīng)激的發(fā)生，且由于Nrf2基因的缺失增加了高脂飼糧誘導(dǎo)MDA含量變化。

4 結(jié)論

①本試驗(yàn)經(jīng)飼喂高脂飼糧成功構(gòu)建了ICR小鼠及Nrf2基因敲除ICR小鼠NAFLA模型。

②高脂飼糧誘導(dǎo)NAFLA模型小鼠肝臟發(fā)生氧化應(yīng)激。

［1］ MACHADO M V，CORTEZ-PINTO H.Non-alcoholic fatty liver disease:what the clinician needs to know［J］.World Journal of Gastroenterology，2014，20(36):12956－12980.

［2］ 王明瓊，楊立軍，李盼盼，等.奶牛脂肪肝臨床診斷指標(biāo)的篩選［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2014，50(5):43 －45.

［3］ 趙芹，張海軍，武書(shū)庚，等.吡咯喹啉醌對(duì)脂肪肝蛋雞肝損傷的保護(hù)作用機(jī)制［J］.動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2014，26(3):651－658.

［4］ 姜錦鵬，寧康健，呂錦芳，等.實(shí)驗(yàn)性雞脂肪肝出血綜合征模型的建立與評(píng)價(jià)［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2012，20(3):69 －73.

［5］ CHOWDHRY S，NAZMY M H，MEAKIN P J，et al.Loss of Nrf2 markedly exacerbates nonalcoholic steatohepatitis［J］.Free Radical Biology and Medicine，2010，48:357 －371.

［6］ TANG W，JIANG Y F，PONNUSAMY M，et al.Role of Nrf2 in chronic liver disease［J］.World Journal of Gastroenterology，2014，20(36):13079 －13087.

［7］ 李曉沖，徐尚，張秀英，等.C57BL6J小鼠非酒精性脂肪肝模型的建立［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2013，49(1):6－8.

［8］ 中華肝病學(xué)會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組.非酒精性脂肪性肝病診療指南(2010年修訂版)［J］.中華肝臟病雜志，2010，18(3):163 －166.

［9］ MOFRAD P，CONTOSM J，HAQUE M，et al.Clinical and histologic spectrum of nonalcoholic fatty liver disease associated with normal ALT values［J］.Hepatology，2003，6(37):1286 －1292.

［10］ 邵洛林，許偉華，周成軍，等.Nrf2在小鼠非酒精性脂肪性肝病發(fā)病機(jī)制中的作用［J］.山東大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，48(3):53 －46.

［11］ TANAKA Y，ALEKSUNESL M，YEAGER R L，et al.NF-E2-related factor 2 inhibits lipid accumulation and oxidative stress in mice fed a high-fat diet［J］.The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，2008，325(2):655 －664.

［12］ KIM S，SOHN I，AHN J I，et al.Hepatic gene expression profiles in a long-term high-fat diet-induced obesity mouse model［J］.Gene，2004，340(1):99 －109.

［13］ PASTORE A，F(xiàn)EDERICI G，BERTINI E，et al.Analysis of glutathione:implication in redox and detoxification［J］.Clinica Chimica Acta，2003，333:19 －39.

［14］ ZOU Y，LI J，LU C，et al.High-fat emulsion-induced rat model of nonalcoholic steatohepatiis［J］.Life Sci-ence，2006，79:1100 －1107.

［15］ SARICAM T，KIRCALI B，KOKEN T.Assessment of lipid peroxidation and antioxidant capacity in non-alcoholic fatty liver disease［J］.Turkish Journal of Gastroenterology，2005，16:65 －70.

［16］ VIDELA LA，RODRIGO R，ORELLANA M，et al.Oxidative stress-related parameters in the liver of non-alcoholic fatty liver disease patients［J］.Clinical Science，2004，106:261 －268.

［17］ KORUK M，TAYSI S，SAVA S MC，et al.Oxidative stress and enzymatic antioxidant status in Patients with nonalcoholic steatohepatiis［J］.Annals of Clinical and Laboratory Science，2004，34:57 －62.

［18］ BHARDWAJ P，MADAN K，THAREJA S，et al.Comparative redox status in alcoholic liver disease and nonalcoholic fatty liver disease［J］.Hepatology International，2008，2:202－208.