近紅外和中紅外光譜技術(shù)在快速鑒別豆粕中摻入尿素聚合物的研究

孫丹丹 李軍國(guó) 秦玉昌 董穎超*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 100081;2.農(nóng)業(yè)部食物與營(yíng)養(yǎng)發(fā)展研究所，北京 100081)

豆粕作為主要的植物性蛋白質(zhì)飼料原料，在畜禽、水產(chǎn)及特種動(dòng)物養(yǎng)殖中應(yīng)用廣泛。但是，由于利益的驅(qū)動(dòng)，一些商家在豆粕中摻入一些含氮量高的化合物來(lái)提高粗蛋白質(zhì)含量，尤其在食品和飼料中檢出三聚氰胺后，虛增蛋白質(zhì)類物質(zhì)引起了廣泛關(guān)注。經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，尿素聚合物是所添加的虛增蛋白質(zhì)類物質(zhì)之一，即以尿素為原料經(jīng)熱加工制得。使用尿素的原因是尿素廉價(jià)且含氮量高(46.7%)，常規(guī)的檢測(cè)方法“凱氏定氮法”不能區(qū)別蛋白氮和非蛋白氮，但尿素吸濕性強(qiáng)，直接添加容易被發(fā)現(xiàn)，而將尿素?zé)峒庸ず?，可形成白色固體，其主要成分是縮二脲、縮三脲、三聚氰酸等縮合物［1］，凱氏定氮法測(cè)得其含氮量約為40%?？s二脲的檢測(cè)方法有分光光度法和高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法［2－3］，三聚氰酸的檢測(cè)方法為色譜法［4－5］，但這些檢測(cè)方法需要化學(xué)試劑，對(duì)操作人員的要求高，耗時(shí)長(zhǎng)。

紅外光譜技術(shù)是一種快速有效的檢測(cè)技術(shù)，在食品摻假中應(yīng)用廣泛［6－7］。在飼料摻假方面，Haughey等［8］利用近紅外(near infrared，NIR)光譜技術(shù)檢測(cè)豆粕中的三聚氰胺，最低測(cè)定質(zhì)量濃度達(dá)到0.1%;楊增玲等［9］應(yīng)用可見(jiàn) －NIR光譜技術(shù)結(jié)合偏最小二乘判別分析(PLS-DA)對(duì)摻有肉骨粉的魚粉進(jìn)行快速鑒別，摻入量≥5%時(shí)正確率為100%;劉星［10］采用主成分分析結(jié)合支持向量機(jī)(SVM)化學(xué)計(jì)量學(xué)算法，分別對(duì)摻入5% ～15%的三聚氰胺甲醛樹脂和脲醛樹脂的奶牛精補(bǔ)料正確識(shí)別率為100%;石光濤等［11］應(yīng)用可見(jiàn) －NIR光譜技術(shù)結(jié)合PLS-DA對(duì)摻有豆粕的魚粉進(jìn)行判別，摻入豆粕濃度為2%～50%時(shí)，檢驗(yàn)集的正確判斷率為96.12%。應(yīng)用NIR光譜技術(shù)測(cè)定飼料中肉骨粉含量也有很多文獻(xiàn)報(bào)道［12－16］。中紅外(mid infrared，MIR)光譜技術(shù)在食品摻假如蜂蜜、果汁、巧克力、油脂等方面應(yīng)用較多［17］，對(duì)于粉狀樣品的研究較少。Liu等［17］應(yīng)用MIR光譜技術(shù)結(jié)合PLSDA預(yù)測(cè)藕粉中摻假物質(zhì)的含量，外部驗(yàn)證決定系數(shù)為 0.98，標(biāo)準(zhǔn)偏差為 5.47;劉嘉等［19］對(duì)葛粉中分別摻入紅薯粉和馬鈴薯粉的MIR光譜進(jìn)行Fisher判別，交互驗(yàn)證準(zhǔn)確率分別為86.7%和92.0%。因此，紅外光譜法可作為一種快速高效可靠的方法用于檢測(cè)食品和飼料摻假。本研究目的是評(píng)價(jià)近紅外和中紅外光譜分析技術(shù)結(jié)合模式識(shí)別法對(duì)鑒別摻有尿素聚合物的豆粕的準(zhǔn)確性，探討其作為高效可靠分析技術(shù)的可行性和實(shí)用性。

1 材料與方法

1.1 樣品制備

豆粕采自中糧東海糧油工業(yè)有限公司，共30批次145個(gè)樣品，樣品于高速旋風(fēng)粉碎機(jī)粉碎30 s。尿素聚合物是由尿素(西隴化工股份有限公司)加熱成固態(tài)并粉碎成粉末狀。根據(jù)尿素聚合物對(duì)不同譜區(qū)吸收值的不同，NIR和MIR的樣品分別制備不同的質(zhì)量濃度(表1)。

表1 校正集和驗(yàn)證集豆粕樣品中尿素聚合物含量Table 1 Urea polymer concentration of calibration set and validation set in soybean meal samples

1.2 試驗(yàn)儀器及軟件

MATRIXTM-Ⅰ型傅立葉變換近紅外光譜儀(BRUKER，Germany)，帶漫反射積分球附件、三維立體角鏡 RockSolidTM干涉儀，Pbs檢測(cè)器。OPUS 光譜采集軟件(version 7.0;Bruker，Germany)。TENSOR 37型傅立葉紅外光譜儀(BRUKER，Germany)。 Matlab(v2013b，MathWorks，USA)和 Unscrambler(version 9.8;CAMO，Norway)化學(xué)計(jì)量學(xué)分析軟件。

1.3 光譜采集

NIR光譜采集:掃描范圍為12 500～3 598 cm－1，分辨率為 8 cm－1，掃描次數(shù) 64 次;開啟旋轉(zhuǎn)樣品臺(tái)，試驗(yàn)環(huán)境溫度為(25±2)℃;每次掃描樣品前，儀器預(yù)熱30 min以上;每個(gè)樣品重復(fù)裝樣掃描3次。為了減少隨機(jī)誤差，隨機(jī)抽取樣品進(jìn)行光譜數(shù)據(jù)采集。

MIR光譜采集:稱取溴化鉀(KBr)200 mg，KBr與樣品的比例為50∶1，將試驗(yàn)樣品與KBr研磨混勻，在壓力13 MPa下壓片1 min;光譜范圍4 000 ～400 cm－1，分辨率為 4 cm－1，掃描次數(shù) 64次;每次掃描樣品前，儀器預(yù)熱30 min以上;試驗(yàn)環(huán)境溫度為(25±2)℃;每個(gè)樣品重復(fù)掃描2次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

樣品光譜常因受到高頻隨機(jī)噪聲、光散射、樣品不均勻等因素的影響，而產(chǎn)生干擾信號(hào)。常用的預(yù)處理方法有多元散射校正(MSC)、變量標(biāo)準(zhǔn)化(SNV)、一階導(dǎo)數(shù)(1Der)、二階導(dǎo)數(shù)(2Der)等，這些數(shù)據(jù)處理方法可以提高分析信號(hào)的信噪比，校正樣品因散射而引起的光譜的誤差，消除基線漂移和背景。使用一種或多種組合處理方法能提高定性分析中樣品分類準(zhǔn)確率及定量分析中預(yù)測(cè)精度［19］。

本試驗(yàn)采用PLS-DA和SVM分類方法，識(shí)別率和檢測(cè)限為評(píng)價(jià)模型優(yōu)劣的指標(biāo)。在PLS-DA方法中，令純豆粕樣品值為0，摻假豆粕為1，閾值設(shè)置為0.5，即當(dāng)樣品預(yù)測(cè)值小于0.5時(shí)判為豆粕，否則判為摻假豆粕。

2 結(jié)果與分析

2.1 NIR光譜分析

2.1.1 樣品NIR光譜分析

尿素聚合物的主要成分是縮二脲、縮三脲和三聚氰酸，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。純豆粕和摻入5%尿素聚合物豆粕的NIR原始光譜，如圖2所示，在7 567～3 695 cm－1區(qū)間的差異，主要是由于聚合物中氨基(－NH2)和羥基(－OH)引起的。伯酰胺和仲酰胺的一級(jí)倍頻吸收帶在6 666 cm－1附近，合頻在5 000 cm－1附近，－OH的一級(jí)倍頻約在6 993 cm－1附近，合頻約在5 000 cm－1附近［20］。

圖1 縮二脲(a)、縮三脲(b)和三聚氰酸(c)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structural formula of biuret(a)，triuret(b)and cyanuric(c)acid

圖2 純豆粕與摻假豆粕NIR光譜特征Fig.2 Near infrared reflectance spectroscopic characteristics of pure soybean meal and adulterated soybean meal

2.1.2 PLS-DA 模型的建立與驗(yàn)證

利用偏最小二乘回歸方法對(duì)校正集樣品的NIR光譜和樣品的分類變量進(jìn)行回歸分析，建立NIR光譜與分類變量間的分類模型。對(duì)光譜進(jìn)行無(wú)處理、平滑、變量標(biāo)準(zhǔn)化、求導(dǎo)等預(yù)處理后建立PLS-DA判別模型，其判別結(jié)果基本一致。圖3為原光譜經(jīng)變量標(biāo)準(zhǔn)化后，得到的校正集和驗(yàn)證集的結(jié)果，圖3(a)為校正集樣品交叉驗(yàn)證結(jié)果，尿素聚合物的含量為1%時(shí)，預(yù)測(cè)值小于0.5，被誤判為純豆粕;圖3(b)為驗(yàn)證集樣品判別結(jié)果，當(dāng)尿素聚合物的含量為1%時(shí)，預(yù)測(cè)值小于0.5，被誤判為純豆粕。因此，采用PLS-DA判別方法結(jié)合NIR光譜技術(shù)識(shí)別摻入尿素聚合物的豆粕的檢測(cè) 限大于1.0%。

圖3 校正集(a)和驗(yàn)證集(b)樣品PLS-DA模型的判別結(jié)果Fig.3 Discriminant results for samples in calibration set(a)and validation set(b)by PLS-DA models

2.1.3 SVM 模型的建立與驗(yàn)證

原始光譜經(jīng)變量標(biāo)準(zhǔn)化后，選擇6 688.3～3 606.4 cm－1之間的光譜數(shù)據(jù)，輸入到SVM 分類器中，選擇徑向基作為核函數(shù)，得到SVM分類結(jié)果，迭代次數(shù)673次，支持向量的個(gè)數(shù)208，邊界支持向量的個(gè)數(shù)16。圖4為訓(xùn)練集和測(cè)試集樣品判別結(jié)果，判斷準(zhǔn)確率分別99.80%和99.21%，即2個(gè)樣品集中各出現(xiàn)1個(gè)誤判樣品，其尿素聚合物的含量為1%，被誤判為純豆粕樣品。因此，采用SVM分類方法結(jié)合NIR光譜技術(shù)識(shí)別摻入尿素聚合物的豆粕的檢測(cè)限大于1.0%。

圖4 訓(xùn)練集和測(cè)試集樣品SVM模型的判別結(jié)果Fig.4 Discriminant results for samples in training set and testing set by SVM models

2.2 MIR光譜分析

2.2.1 樣品 MIR光譜

尿素聚合物是縮二脲(圖1a)、縮三脲(圖1b)、三聚氰酸(圖1c)等的混合物。其中，縮二脲的酰亞胺中的羰基偶合裂分為雙峰在1 745～1 680 cm－1區(qū)域，伯胺N－H的伸縮振動(dòng)在3 500～3 300 cm－1之間有2個(gè)峰，剪式振動(dòng)在1 650～1 580 cm－1，仲胺N－H的伸縮振動(dòng)有1個(gè)峰，剪式振動(dòng)在1 650～1 515 cm－1附近，C－N的伸縮振動(dòng)在1 350～1 000 cm－1之間;三聚氰酸中的－OH形成氫鍵，吸收峰在3 500～3 200 cm－1處，內(nèi)酰胺因環(huán)的張力增加，羰基峰頻率升高，C=N的伸縮振動(dòng)在1 690～1 550 cm－1附近。在537 cm－1處有一個(gè)尖的強(qiáng)吸收峰無(wú)法辨認(rèn)，可能是尿素中的雜質(zhì)在加熱過(guò)程中發(fā)生聚合反應(yīng)，在摻假豆粕中此峰隨著尿素聚合物含量的增加而增強(qiáng)，如圖5所示。

圖5 尿素聚合物(a)和摻假豆粕(b)的MIR光譜特征Fig.5 The mid infrared spectrum of urea polymer(a)and adulterated soybean meal(b)

2.2.2 PLS-DA 模型的建立與驗(yàn)證

除去水峰和二氧化碳峰后，對(duì)光譜進(jìn)行無(wú)處理、平滑、變量標(biāo)準(zhǔn)化、求導(dǎo)等預(yù)處理后建立PLS-DA判別模型，預(yù)處理方法對(duì)模型的影響較大，最終選擇最佳預(yù)處理方法為變量標(biāo)準(zhǔn)化和一階導(dǎo)數(shù)7點(diǎn)平滑的組合，圖6為原始光譜經(jīng)變量標(biāo)準(zhǔn)化和一階導(dǎo)數(shù)7點(diǎn)平滑組合處理后，得到的校正集和驗(yàn)證集樣品的判別結(jié)果。圖6(a)為校正集樣品交叉驗(yàn)證結(jié)果，豆粕中尿素聚合物的含量大于等于0.08%，預(yù)測(cè)值均大于0.5，偏差均小于0.5;圖6(b)為驗(yàn)證集樣品的判別結(jié)果，判斷正確率為100%。因此，采用PLSDA判別方法結(jié)合MIR光譜技術(shù)識(shí)別摻入尿素聚合物的豆粕的檢測(cè)限為0.08%。

2.2.3 SVM 模型的建立與驗(yàn)證

除去水峰和二氧化碳峰后，對(duì)光譜進(jìn)行變量標(biāo)準(zhǔn)化和一階導(dǎo)數(shù)7點(diǎn)平滑處理，將處理后的光譜數(shù)據(jù)輸入到SVM分類器中，選擇徑向基作為核函數(shù)，得到SVM分類結(jié)果。迭代次數(shù)432次，支持向量的個(gè)數(shù)180，邊界支持向量的個(gè)數(shù)0，校正集準(zhǔn)確率為100%，驗(yàn)證集準(zhǔn)確率為100%。因此，使用SVM方法結(jié)合MIR光譜技術(shù)識(shí)別摻入尿素聚合物的豆粕的檢測(cè)限為0.08%。

3 討論

3.1 光譜預(yù)處理方法對(duì)NIR和MIR模型的影響

預(yù)處理對(duì)MIR模型的影響較大。方法的種類、組合及組合順序直接影響MIR模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度，采用變量標(biāo)準(zhǔn)化和一階導(dǎo)數(shù)7點(diǎn)平滑組合處理后得到最優(yōu)結(jié)果;預(yù)處理對(duì)NIR模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度沒(méi)有影響，采用變量標(biāo)準(zhǔn)化處理時(shí)，樣品預(yù)測(cè)偏差最小。Devos 等［20］處理 NIR 光譜數(shù)據(jù)用一步預(yù)處理方法，就可以產(chǎn)生一個(gè)預(yù)測(cè)能力較好的SVM模型，而在MIR區(qū)，預(yù)處理方法及預(yù)處理方法的組合順序?qū)VM分類模型預(yù)測(cè)結(jié)果均具有很大影響。

圖6 校正集(a)和驗(yàn)證集(b)樣品PLS-DA模型的判別結(jié)果Fig.6 Discriminant results for samples in calibration set(a)and validation set(b)by PLS-DA models

3.2 PLS-DA與SVM方法比較

PLS-DA算法是基于PLS方法建立的類別變量與光譜特征間的線性回歸模型，SVM可以將低維線性不可分的樣本變量映射到高位空間中，變成線性可分，主要用于解決小樣本、非線性問(wèn)題。本研究中SVM模型略優(yōu)于PLS-DA，PLS-DA模型得到的未知樣品分類結(jié)果有預(yù)測(cè)值偏差，而SVM模型可以直接判斷樣品分類。Teye等［21］比較了4種模式識(shí)別方法(線性判別、K－鄰近值、反向神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、SVM)，結(jié)果表明SVM模型準(zhǔn)確度高于其他3種模型，其訓(xùn)練集和預(yù)測(cè)集的正確識(shí)別率均為100%。

3.3 NIR和MIR光譜技術(shù)比較

在NIR和MIR區(qū)建立的分類模型對(duì)摻入尿素聚合物的豆粕最低檢測(cè)含量分別為1.00%和0.08%，這是由于MIR光譜強(qiáng)度遠(yuǎn)大于NIR，對(duì)樣品化學(xué)組分的變化比NIR更靈敏，而且尿素聚合物在MIR區(qū)的吸光度相對(duì)于豆粕較高。Wang等［22］應(yīng)用NIR/MIR光譜技術(shù)鑒別摻假的八角，結(jié)果表明，MIR光譜技術(shù)準(zhǔn)確率優(yōu)于NIR光譜技術(shù)，當(dāng)兩者光譜數(shù)據(jù)聯(lián)合建立分類模型時(shí)，準(zhǔn)確率最高。但在本試驗(yàn)中，MIR光譜技術(shù)檢測(cè)需要用溴化鉀壓片，光譜采集時(shí)間相對(duì)于NIR光譜技術(shù)稍長(zhǎng)，且光譜受到環(huán)境和樣品中水分的影響更大。

4 結(jié)論

①在NIR光譜區(qū)，建立的SVM分類模型對(duì)摻有1%～5%尿素聚合物的豆粕識(shí)別率大于99%;在MIR光譜區(qū)，PLS－DA和SVM分類模型對(duì)摻假豆粕的識(shí)別率為100%，最低檢測(cè)濃度為0.08%。

②對(duì)于鑒別摻有尿素聚合物的豆粕，MIR光譜技術(shù)優(yōu)于NIR光譜技術(shù)。

［1］ 劉功年，張學(xué)才，張德祥.縮二脲制備工藝的研究［J］.安徽化工，1993(4):21 －25.

［2］ 中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB/T 2441.2—2010尿素的測(cè)定方法:第2部分:縮二脲含量——分光光度法［S］.北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

［3］ 王祖翔，蔣俊，孫莉，等.高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定食品中的尿素、縮二脲與雙氰胺［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2012，31(5):593 －599.

［4］ 李鋒格，姚偉琴，蘇敏，等.氣相色譜－質(zhì)譜法快速測(cè)定牛奶中的三聚氰胺和三聚氰酸［J］.色譜，2009，27(2):233－236.

［5］ 云環(huán)，嚴(yán)華，張朝暉，等.超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定牛奶和奶粉中的二氰二胺、三聚氰胺和三聚氰酸［J］.色譜，2013，31(5):404 －409.

［6］ DOWNEY G.Vibrational spectroscopy in studies of food origin［M］//BRERETON P.New analytical approaches for verifying the origin of food.UK:The Food and Environment Research Agency(FERA)，2013:94－116.

［7］ 王小燕，王錫昌，劉源，等.近紅外光譜技術(shù)在食品摻偽檢測(cè)應(yīng)用中的研究進(jìn)展［J］.食品科學(xué)，2011，32(1):265－269.

［8］ HAUGHEY S A，GRAHAM S F，CANCOU?T E，et al.The application of near-infrared reflectance spectroscopy(NIRS)to detect melamine adulteration of soya bean meal［J］.Food Chemistry，2013，136(3/4):1557－1561.

［9］ 楊增玲，韓魯佳，劉賢，等.魚粉中肉骨粉的可見(jiàn)－近紅外光譜快速定性判別方法［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2009，25(7):308 －311.

［10］ 劉星.奶牛飼料中氨基樹脂、土霉素及其鹽酸鹽的近紅外光譜識(shí)別研究［D］.碩士學(xué)位論文.長(zhǎng)沙:中南大學(xué)，2012.

［11］ 石光濤，韓魯佳，楊增玲，等.魚粉中摻雜豆粕的可見(jiàn)和近紅外反射光譜分析研究［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2009，29(2):362 －366.

［12］ 湛小梅，韓魯佳，劉賢，等.遺傳算法在魚粉中肉骨粉近紅外光譜檢測(cè)中的應(yīng)用［J］.光學(xué)學(xué)報(bào)，2009，29(10):2800－2803.

［13］ 楊增玲，韓魯佳，李瓊飛，等.基于NIRS的反芻動(dòng)物飼料中肉骨粉判別［J］.農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào)，2009，40(7):124－128.

［14］ 楊增玲，韓魯佳，李瓊飛，等.反芻動(dòng)物精料補(bǔ)充料中肉骨粉快速檢測(cè)近紅外光譜法［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2008，28(6):1278 －1282.

［15］ YANG Z L，HAN L J，LIU X，et al.Detecting and quantifying meat meal or meat and bone meal contamination in fishmeal by visible and near infrared reflectance spectra［J］.Animal Feed Science and Technology，2008，147(4):357 －367.

［16］ 牛智有，韓魯佳.飼料中肉骨粉含量的近紅外反射光譜檢測(cè)方法［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2008，24(4):271－274.

［17］ LIU J，WEN Y，DONG N，et al.Authentication of lotus root powder adulterated with potato starch and/or sweet potato starch using fourier transform mid-infrared spectroscopy［J］.Food Chemistry，2013，141(3):3103－3109.

［18］ 劉嘉，李建超，陳嘉，等.葛粉摻假的傅里葉變換紅外光譜法鑒別研究［J］.食品科學(xué)，2011，32(8):226－230.

［19］ 嚴(yán)衍祿.近紅外光譜分析基礎(chǔ)與應(yīng)用［M］.北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，2005:30－39.

［20］ DEVOS O，DOWNEY G，DUPONCHEL L.Simultaneous data pre-processing and SVM classification model selection based on a parallel genetic algorithm applied to spectroscopic data of olive oils［J］.Food Chemistry，2014，148:124 －130.

［21］ TEYE E，HUANG X Y，DAIH，et al.Rapid differentiation of Ghana cocoa beans by FT-NIR spectroscopy coupled with multivariate classification［J］.Spectrochimica Acta Part A:Molecular and Biomolecular Spectroscopy，2013，114:183 －189.

［22］ WANG Y，MEI M H，NI Y N，et al.Combined NIR/MIR analysis:a novel method for the classification of complex substances such as Illicium verum Hook.F.and its adulterants［J］.Spectrochimica Acta Part A:Molecular and Biomolecular Spectroscopy，2014，130:539－545.