響應(yīng)面法優(yōu)化寇氏隱甲藻突變株的發(fā)酵培養(yǎng)基

王 澍 趙樹林 張靜雯 田 華 佘 雋 陳 濤 何東平

（武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，武漢 430023）（中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所2，武漢 430071）

響應(yīng)面法優(yōu)化寇氏隱甲藻突變株的發(fā)酵培養(yǎng)基

王 澍1趙樹林1張靜雯1田 華1佘 雋1陳 濤2何東平1

（武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，武漢 430023）（中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所2，武漢 430071）

對(duì)寇氏隱甲藻突變株產(chǎn)DHA的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。首先用Plackett－Burman試驗(yàn)篩選出影響顯著的3個(gè)因素，再利用最陡爬坡試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化并建立二次多元回歸模型，最后用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基在50 L發(fā)酵罐上進(jìn)行放大試驗(yàn)。結(jié)果表明在最佳培養(yǎng)基葡萄糖121.41 g/L，谷氨酸鈉11.54 g/L，硫酸鎂7.25 g/L時(shí)，DHA的產(chǎn)量為5.65 g/L發(fā)酵液，比優(yōu)化前提高了10.35%。在50 L發(fā)酵罐上發(fā)酵培養(yǎng)，DHA產(chǎn)量為9.50 g/L發(fā)酵液，為搖瓶培養(yǎng)時(shí)的1.68倍。

寇氏隱甲藻突變株 DHA 響應(yīng)面 發(fā)酵培養(yǎng)基

DHA（二十二碳六烯酸）是一種ω－3系列多不飽和脂肪酸，在嬰幼兒大腦發(fā)育和視力發(fā)育中具有非常重要的生理作用，并且具有防治心血管疾病，提高人體免疫力、預(yù)防和減輕精神疾病、消炎、抗癌等功能［1］。近年來(lái)，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)DHA已成為主要研究方向，寇氏隱甲藻（Crypthecodinium cohnii）是海洋微藻的一種，可在沒有光照的條件下發(fā)酵培養(yǎng)，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的增長(zhǎng)和油脂的積累，其脂肪酸積累量高于20%，DHA可占總脂肪酸的30%～50%，具有較高的產(chǎn) DHA能力［2－4］。

目前寇氏隱甲藻發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化主要是研究不同的碳源、氮源、碳氮比、無(wú)機(jī)鹽、金屬離子等對(duì)其DHA產(chǎn)量的影響［5－8］，但生物量和DHA產(chǎn)量相對(duì)較低，對(duì)于工業(yè)化生產(chǎn)，通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化來(lái)獲取高產(chǎn)量的DHA是必要的。梅志剛等［9］通過(guò)對(duì)隱甲藻培養(yǎng)基的響應(yīng)面優(yōu)化，生物量和DHA分別為8.91 g/L和0.91 g/L；de Swaaf等［10］用乙醇分批補(bǔ)料培養(yǎng)隱甲藻，生物量為83 g/L，DHA產(chǎn)量為11.7 g/L；Ratledge等［11］利用乙酸作為碳源，分別培養(yǎng)幾組不同的隱甲藻，生物量可達(dá)20～30 g/L，DHA產(chǎn)量可超過(guò)3 g/L。

由于單因素試驗(yàn)未考慮各因素間的交互作用，故無(wú)法提供未考察區(qū)域的信息，以及進(jìn)行預(yù)測(cè)和控制。響應(yīng)面法可同時(shí)對(duì)多因素水平及其交互作用進(jìn)行優(yōu)化與評(píng)價(jià)，并能快速有效地確定多因素系統(tǒng)的最優(yōu)條件［12］。本研究選取經(jīng)過(guò)2次60Co－γ射線誘變獲得的寇氏隱甲藻突變株［13］，首先用PB試驗(yàn)篩選出對(duì)DHA產(chǎn)量有顯著影響作用的因素，然后用最陡爬坡試驗(yàn)逼近最大響應(yīng)區(qū)域，最后進(jìn)行響應(yīng)面的試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析，得出最佳培養(yǎng)基配比［14］。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 藻種

寇氏隱甲藻株ATCC30772：廣東微生物菌種保藏中心，經(jīng)過(guò)2次60Co－γ射線誘變獲得的寇氏隱甲藻突變株2.4k－2A2－5，本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑

酵母膏：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；纖維素酶（10～140萬(wàn) U/g）、堿性蛋白酶（20萬(wàn) U/g）：江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司。

1.2 主要儀器

GRJ－50B型發(fā)酵罐：鎮(zhèn)江格瑞生物工程有限公司；Agilent7890A氣相色譜儀：安捷倫科技（中國(guó)）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)條件

種子培養(yǎng)：從長(zhǎng)好藻種的斜面上取一定量純的藻落，接種到一級(jí)種子培養(yǎng)液中，置于搖床上，28℃、190 r/min條件下培養(yǎng)48 h。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：將一級(jí)種子液按10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)液中，28℃、190 r/min條件下培養(yǎng)7 d。

1.3.2 油脂提取

將濕藻體按濕重：純凈水1∶1～1∶3的比例，制成懸浮液，加堿性蛋白酶和纖維素酶，（60±1）℃水浴溫培，同時(shí)攪拌8 h，鏡檢藻體破壁后，加入95%乙醇脫水30～60 min，靜置分層，使乙醇－水相與藻泥分層。將乙醇－水相和藻泥分別加入4號(hào)溶劑油，分裝2個(gè)分液漏斗中，靜置分層。取出上層4號(hào)溶劑油藻油相提萃液。反復(fù)浸提，至藻泥變白無(wú)油為止。把4號(hào)溶劑油提萃液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，獲得粗藻油，粗藻油經(jīng)脫膠除雜等過(guò)程后獲得金黃色精藻油［15］。

1.3.3 脂肪酸處理

取0.1 g油樣，加1 mL苯－石油醚（體積比為1∶1）混合溶劑，再加1 mL 0.4 mol/L的氫氧化鉀 －甲醇溶液，搖勻，在室溫下靜置8～10 min，然后加蒸餾水使醚層升至頂部，待液層澄清后即可作色譜分析。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：Agilent SP－2560（100 m×25μm，0.2 μm）；升溫程序：100℃保持4 min，以3℃/min升溫至230℃，保持20min，載氣（N2）流速25mL/min，壓力2.4 kPa，進(jìn)樣量 1μL；分流比15∶1。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 單因素試驗(yàn)

分別考察葡萄糖、谷氨酸鈉、酵母膏、氯化鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈣、金屬溶液等因素對(duì)DHA產(chǎn)量的影響。

1.4.2 Plackett－Burman（PB）設(shè)計(jì)

應(yīng)用Design Expert 8.0軟件對(duì)發(fā)酵試驗(yàn)進(jìn)行PB設(shè)計(jì)。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，從發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)組成中選出對(duì)DHA產(chǎn)量影響較大的8種成分：葡萄糖、谷氨酸鈉、酵母膏、氯化鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈣、金屬溶液，另加3個(gè)虛擬因子作為誤差分析，每個(gè)因素分別確定高（1）、低（－1）兩水平，共進(jìn)行12次試驗(yàn)。

表1 PB試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.4.3 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)（SAD）

最陡爬坡法以試驗(yàn)值變化的梯度方向?yàn)榕榔路较颍鶕?jù)各因素效應(yīng)值的大小確定變化步長(zhǎng)，能快速、經(jīng)濟(jì)地逼近最大響應(yīng)區(qū)域［16］。

由PB試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析結(jié)果可知，葡萄糖、谷氨酸鈉和硫酸鎂對(duì)DHA產(chǎn)量有顯著影響，根據(jù)方程進(jìn)行最陡爬坡設(shè)計(jì)。

1.4.4 響應(yīng)面試驗(yàn)（RSM）

對(duì)PB試驗(yàn)確定的因素，以最陡爬坡試驗(yàn)得到的中心點(diǎn)，使用Design Expert8.0軟件的Box－Behnken方法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，根據(jù)設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，重復(fù)3次，并分析試驗(yàn)獲得重要因素的最佳配方水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)葡萄糖、谷氨酸鈉、酵母膏、氯化鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈣、金屬溶液、碳酸氫鈉、氯化鉀濃度分別為110.00、10、7.5、2.25、4.0、6.25、0.75 g/L、4 mL/L、0.75、0.5 g/L時(shí)，其最高 DHA產(chǎn)量分別為：5.29、5.30、5.17、5.19、5.21、5.28、5.21、5.19、5.10、5.12 g/L發(fā)酵液。根據(jù)結(jié)果對(duì)PB試驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)。

2.2 PB試驗(yàn)結(jié)果與分析

表2 Plackett－Burman設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

Plackett－Burman試驗(yàn)結(jié)果見表2，通過(guò)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合得一階回歸模型如下：Y＝3.6＋7.25×10－3X1＋0.6X2－5.56×10－4X3－0.06X4－5.21×10－3X5＋0.09X6＋0.03X7－0.02X8，方差分析結(jié)果見表3。由表3可知，回歸模型在95%概率水平下顯著，即該模型擬合良好；模型的校正決定系數(shù)R2＝0.881 4，表明88.24%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異性可用此模型來(lái)解釋；變異系數(shù)為1.00%，說(shuō)明可信度和精密較高［17］。8個(gè)因素中葡萄糖（X1）、谷氨酸鈉（X2）、硫酸鎂（X6）在95%的概率水平上對(duì)DHA產(chǎn)量有顯著影響，且都是正效應(yīng)，在后續(xù)最陡爬坡試驗(yàn)中應(yīng)提高其添加量。

表3 Plackett－Burman試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)Plackett－Burman試驗(yàn)結(jié)果，葡萄糖、谷氨酸鈉、硫酸鎂的添加量對(duì)DHA的產(chǎn)量的變化有顯著的影響，對(duì)這3個(gè)因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)［18］。不顯著因素中，酵母膏、氯化鈣為正效應(yīng)，在后續(xù)試驗(yàn)中應(yīng)取高水平，氯化鈉、磷酸二氫鉀、金屬溶液為負(fù)效應(yīng)，在后續(xù)試驗(yàn)中應(yīng)取低水平。

結(jié)果如表4所示，第2組試驗(yàn)對(duì)應(yīng)的DHA產(chǎn)量最高，達(dá)到5.48 g/L發(fā)酵液。所以，以第2組試驗(yàn)所對(duì)應(yīng)的葡萄糖、谷氨酸鈉、硫酸鎂的添加量為中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，即葡萄糖120.00 g/L、谷氨酸鈉 11.5 g/L、硫酸鎂 7.0 g/L。

表4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

表5 Box－Behnken試驗(yàn)因素水平及其編碼

表6 Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

利用Design－Expert8.0軟件對(duì)中Box－Behnken試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合得二次多元回歸模型：對(duì)二次模型進(jìn)行分析，結(jié)果如表7所示。

表7 模型回歸方程方差分析

由表7方差分析可知，模型極其顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），模型的校正決定系數(shù)0.828 1，說(shuō)明82.81%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異性可用此模型來(lái)解釋，相關(guān)系數(shù)R2＝92.48%，變異系數(shù)為0.73%，RSN（信燥比）為9.137，遠(yuǎn)大于4，表明模型擬合度較好，試驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠，分析結(jié)果可信，因此可以用此回歸方程對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)［19］。

圖1 葡萄糖與谷氨酸鈉的交互作用影響DHA產(chǎn)量的響應(yīng)面圖

圖2 葡萄糖濃度與硫酸鎂濃度的交互作用影響DHA產(chǎn)量的響應(yīng)面圖

圖3 谷氨酸鈉與硫酸鎂的交互作用影響DHA產(chǎn)量的響應(yīng)面圖

根據(jù)回歸方程，利用Design－Expert8.0軟件做各響應(yīng)面的三維立體圖（圖1～圖3），葡萄糖、谷氨酸鈉、硫酸鎂及其交互作用對(duì)響應(yīng)面的影響結(jié)果可通過(guò)該組圖中直觀反映出來(lái)［20］。采用Design－Expert軟件的Optimization模塊進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)條件優(yōu)化，預(yù)測(cè)葡萄糖、谷氨酸鈉、硫酸鎂的添加量分別為121.41、11.54、7.25 g/L時(shí)，DHA最高產(chǎn)量為5.67 g/L發(fā)酵液。為了驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果，在此條件下進(jìn)行3組試驗(yàn)，得到生物量的平均值為52.00 g/L發(fā)酵液，DHA產(chǎn)量的平均值為5.65 g/L發(fā)酵液，預(yù)測(cè)值與實(shí)際值相近，說(shuō)明模型擬合性較好，比優(yōu)化前（5.12 g/L發(fā)酵液）提高了10.35%。

2.5 50 L發(fā)酵罐試驗(yàn)

在響應(yīng)面法優(yōu)化的營(yíng)養(yǎng)條件下，對(duì)寇氏隱甲藻突變株進(jìn)行50 L發(fā)酵罐試驗(yàn)。菌種在裝有30 L發(fā)酵培養(yǎng)基的罐中，接種量為10%，初始pH為7，溫度為28℃，轉(zhuǎn)速為190 r/min，3 L/min通氣量的條件下培養(yǎng)96 h，生物量為61.00 g/L發(fā)酵液，DHA產(chǎn)量為9.50 g/L發(fā)酵液，為搖瓶培養(yǎng)時(shí)的1.68倍，說(shuō)明該發(fā)酵培養(yǎng)基也適合50 L發(fā)酵罐的放大生產(chǎn)。

3 結(jié)論

借用 Design－Expert 8.0軟件能方便地應(yīng)用Plackett－Burman設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法進(jìn)行合理的試驗(yàn)安排和數(shù)據(jù)分析，有效地從眾多培養(yǎng)基成分中篩選出重要的影響因素，并實(shí)現(xiàn)發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化，得到最佳添加量，優(yōu)化結(jié)果與實(shí)際值吻合較好［21］。

通過(guò)Plackett－Burman試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在寇氏隱甲藻突變株的發(fā)酵培養(yǎng)基中，葡萄糖，谷氨酸鈉和硫酸鎂具有重要作用，是顯著性影響因素；由最陡爬坡試驗(yàn)找到接近最大相應(yīng)區(qū)域的一點(diǎn)：葡萄糖 120 g/L，谷氨酸鈉 11.5 g/L，硫酸鎂 7.0 g/L；再對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化，得到最佳培養(yǎng)基配方為：葡萄糖121.41 g/L，谷氨酸鈉 11.54 g/L，硫酸鎂 7.25 g/L等，預(yù)測(cè)的最大DHA產(chǎn)量是5.67 g/L發(fā)酵液，驗(yàn)證試驗(yàn)得到的生物量平均值為52.00 g/L發(fā)酵液，DHA產(chǎn)量平均值為5.65 g/L發(fā)酵液，與預(yù)測(cè)值相近，優(yōu)化后DHA的產(chǎn)量比以前（5.12 g/L發(fā)酵液）提高了10.35%。將優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基在50 L發(fā)酵罐上培養(yǎng)96 h，生物量為61.00 g/L發(fā)酵液，DHA產(chǎn)量為9.50 g/L發(fā)酵液，為搖瓶培養(yǎng)時(shí)的1.68倍，說(shuō)明該發(fā)酵培養(yǎng)基也適合50 L發(fā)酵罐的放大生產(chǎn)。

［1］姜?jiǎng)︿h，趙麗芹，陳濤，等.寇氏隱甲藻不同破壁方法的研究［J］.中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2011，（8）：92－94

［2］Ana Mendes，Alberto Reis，Rita Vasconcelos，et al.Crypthecodinium cohniiwith emphasis on DHA production：a review［J］.Journal of Applied Phycology，2009，21（2）：199－214

［3］Sijtsma L，SwaafM E.Biotechnological production and applications of theω－3 polyunsaturated fatty acid docosahexaenoic acid［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2004，64（2）：146－153

［4］Ratledge C.Fatty acid biosynthesis in microorganisms being used for single cell oil production［J］.Biochim，2004，86（11）：807－815

［5］王菊芳，梁世中，吳震強(qiáng).碳/氮比對(duì)隱甲藻總脂及DHA含量的影響［J］.華南理工大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2000，28（10）：28－31

［6］王菊芳，梁世中，楊博.隱甲藻發(fā)酵產(chǎn)DHA最佳無(wú)機(jī)鹽濃度的確定［J］.中國(guó)油脂，2002，21（2）：26－28

［7］郭小婧，龔陽(yáng)敏，梁焯，等.溫度和碳源對(duì)隱甲藻生長(zhǎng)及DHA積累的影響［J］.中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，2013，35（5）：597－603

［8］de Swaaf M E，Rijk TC，Eggink G，etal.Optimization of docosahexaenoic acid production in batch cultivations byCrypthecodinium cohnii［J］.Journal of Biotechnology，1999，70：185－192

［9］梅志剛，王菊芳.響應(yīng)面法優(yōu)化隱甲藻產(chǎn)DHA的培養(yǎng)基［J］.中國(guó)釀造，2010，（11）：84－87

［10］de Swaaf M E，Pronk JT，Sijtsma L.Fed－batch cultivation of the docosahexaenoic－acid－producing marine algaCrypthecodinium cohniion ethanol［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2003，61（1）：40－43

［11］Ratledge Colin，Kanagachandran K，Alistair J.Anderson，et al.Production of docosahexaenoic acid byCrypthecodinium cohniigrown in a pH－auxostat culture with acetic acid as principal carbon source［J］.Lipids，2001，36（11）：1241－1246

［12］張帥，董基，黃志明.響應(yīng)面法優(yōu)化富鉻靈芝發(fā)酵培養(yǎng)基［J］.食品科學(xué)，2013，34（15）：208－212

［13］佘雋，田華，陳濤，等.高產(chǎn)DHA寇氏隱甲藻突變株的篩選［J］.食品科學(xué)，2013，34（17）：230－235

［14］孫鵬，趙旭博，孫先鋒，等.響應(yīng)面法優(yōu)化長(zhǎng)雙歧桿菌增殖培養(yǎng)基［J］.食品科學(xué)，2013，34（05）：207－212

［15］佘雋，任揚(yáng)，田華，等.60Co－γ射線輻射誘變寇氏隱甲藻6號(hào)的技術(shù)研究［J］.中國(guó)釀造，2012，31（2）：147－150

［16］Montgomery D C.Design and analysis of experiments［M］.5th ed.New York：John Wiley＆Sons，2001：430－436

［17］Abdulaziz Q M.Application of Placket－Burman factorial design to improve citrinin production in Monascus ruber batch cultures［J］.Botanical Bulletin of Academia Sinica，2006，47（2）：167－172

［18］Li Y，Liu ZQ，Cui F J，et al.Application of Plackett－Burman experimental design and Doehlert design to evaluate nutritional requirements for xylanase production by Alternaria maliND－16［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2008，77（2）：285－291

［19］項(xiàng)駟文，薛正蓮，秦艷飛，等.響應(yīng)面法優(yōu)化那西肽發(fā)酵條件［J］.中國(guó)抗生素雜志，2013，38（6）：430－433

［20］陶發(fā)琴，王明鵬，王衛(wèi)星，等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化酵母油脂的提取工藝［J］.中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2013，28（4）：51－57

［21］李市場(chǎng)，張鵬鵬，楊娜，等.黏紅酵母產(chǎn)油脂培養(yǎng)基的響應(yīng)面優(yōu)化［J］.中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2013，28（2）：63－68.

Optimization of Fermentation Medium of Crypthecodinium Cohniifor DHA Production with Response Surface Method

Wang Shu1Zhao Shulin1Zhang Jingwen1Tian Hua1She Jun1Chen Tao2He Dongping1
（Wuhan Polytechnic University1，Wuhan 430023）（Wuhan Institute of Virology，Chinese Academy of Sciences2，Wuhan 430071）

In the paper，response surface methodologies have been applied to optimize fermentation medium for DHA production byCrypthecodinium cohnii.First，the glucose，sodium glutamate，MgSO4were identified by Plackett－Burman design as themainmedium components thataffected the yield of DHA.The steepestascentmethod and Box－Behnken were used to optimize the culturemedium and to establish themultivariate regression model.Finally the optimized fermentationmedium enlarged the test in a 50 L fermenter.The results showed that the optimal fermentationmedium were 121.41 g/L glucose，11.54 g/L sodium glutamate，7.25 g/LMgSO4，etc；the experimental yield of DHA in the optimized medium was fermentation liquid of 5.67 g/L，which increased 10.35%than that of themedium before optimization.On the optimal conditions，the yield of DHA could reach a fermentation liquid of 9.50 g/L after being cultured in 50 L fermenter，which was1.68 times as high as that cultured in flask.

Crypthecodinium cohnii，DHA，response surfacemethodology，fermentation medium

Q93－335

A

1003－0174（2015）08－0079－05

十二五科技部支撐計(jì)劃（2011BAD02B00）

2014－03－17

王澍，男，1989年出生，碩士，微生物油脂

何東平，男，1957年出生，教授，糧食、油脂及植物蛋白